ラット脳スライスにおけるGABA活性化シングルチャネルとトニック電流

Summary

私たちは、GABA活性化単一チャネル電流（GABAAチャネル、GABAA受容体）とそれらが神経細胞で生成シナプスとトニック電流を測定するパッチクランプ技術を使用してください。チャネルの活性化は、健康や​​病気で神経細胞の興奮性を低下させる

Abstract

GABAのチャンネルはすべてのニューロンに存在し、両方のシナプスと彼らは相動性および強壮電流を生成するシナプスの外側に配置されて、それぞれ^4,5,6,7 GABAチャネルは、五量体GABA開口型塩化物チャンネルです。チャネルのサブユニットは、8家族（α1- 6、β1- 3、γ1- 3、δ、ε、θ、π、ρ）に分類されます。二つのアルファ、二つのベータ版一第³サブユニットは、機能的なチャネル^8を形成する。 GABAの全人口を含む研究とサブタイプ特異的GABA活性化、シングルチャネルの分子神経細胞におけるチャネルの研究を組み合わせることで、それが神経細胞の抑制と、それがどのように薬理学的作用物質によって変調さの基本的なメカニズムを理解することが可能となる。

我々は、海馬脳切片で生きているニューロンでGABAチャンネルの機能特性を研究し、シングルチャネルと細胞全体の電流を記録するパッチクランプ法^9,10を使用してください。我々は、さらにチャネルが別のGABA濃度、他の薬剤と内と細胞外因子によってどのように影響を受けるか調べる。パッチクランプ法の詳細な理論的および実践的な説明についてはB SakmanとEネーアー¹⁰で編集したシングルチャネルの録音を参照してください。

Protocol

1。脳スライスの作製：

22日齢のWistarラット - 実験は、生後16日から海馬脳切片で行われます。

1. 動物は、地元の倫理的なガイドラインと承認された動物のケアのプロトコールに従い、断頭によって屠殺されています。
2. すぐにへらで脳を削除し、外科ブレード（＃24）と正中線に沿ってカット。紙が直面しているカットでワットマンろ紙上の各半球を置きます。
3. 試料のディスク上に瞬間接着剤の滴を入れ、切断面が下向きで、その上に半球を置きます。氷冷した人工脳脊髄液（ACSF、3.1を下回るこちらをご覧ください）​​で満たされているビブラトームのカッティングチャンバに試料ディスクを置きます。
4. 400μMのためにスライス厚を設定し、脳の切断開始。あなたが海馬に到達する前に脳組織の約2mmを切断する必要があります。
5. 海馬スライスはACSFで満たされたガラスのペトリ皿に入れています。プレートは、海馬の簡単な可視化を可能にするために黒い背景（例えば黒紙）に配置されます。鋭い外科刃を使用して周囲の組織から海馬を分離する。組織を押したり引いたりしないように注意してください。
6. スライスは、37.0でACSF溶液中でインキュベートされています°その後1時間のためのCとは、実験が終了するまで室温で保存。 1時間のインキュベーションの間に組織は、切削加工によって課せられたダメージから回復。

2。パッチ適用のためのピペットの作製：

1. ピペットは、ホウケイ酸ガラス毛細管から作られています。
2. パッチピペットは、ピペットで、その結果、自動または手動ピペットプラーで引っ張られている2の抵抗 - 全細胞記録用MΩ4または8 - シングルチャネルの録音のための間20MΩ適切なピペット溶液とACSFれ浴溶液で満たされた（3.1、以下を参照）。
3. 我々はシングルチャネルの録音に使用するピペットは、白金線の上に座って溶融ガラスからの熱は表面が滑らかになるマイクロフォージを使用して研磨されています。同じホウケイ酸ガラスのようなパッチピペットになっているが回線上にガラスの液滴を形成するために使用されます。我々の経験でピペットをこのように研磨することコーティングされていないワイヤからの熱によって、または自動化された引き手で研磨工程で研磨ピペットに比べてより安定して高抵抗のシールを形成するピペットを作成します。ピペットの最終的なサイズは、8から間20MΩの範囲である。細胞全体のレコーディングで使用されているピペットは研磨されていません。

3。実験で使用したソリューション：

特定のソリューションは、シングルチャネルと細胞全体の記録に使用されます。

1. ACSFはmm単位で含まれています：124塩化ナトリウム、26のNaHCO _3、3のKCl、1.3のMgSO _4、2.5のNa ₂ HPO _4、2.5のCaCl _2、pH 7.2の10グルコース- 7.4を95％O ₂および5％CO ₂でバブリングしたとき。 ACSFは、時々 、例えば乳酸¹¹など他の栄養素を補充しています。
2. シングルチャネルの録音：140塩化ナトリウム、5のKCl、1のMgCl _2、1.8 CaCl ₂及び10 TES（N -トリス[ヒドロキシメチル]メチル-2 -アミノエタンスルホン酸）pHは7.25と他の薬剤： 浴溶液は ACSFまたはmmのいずれかそのは、特定の実験のために必要な場合がありますmMで細胞に接続されたとインサイドアウトのパッチ用ピペット溶液 ：140コリンClを、5 NaClを、1のKCl、1のMgCl _2、1.8 CaCl _2で 、10 TES pHが7.25、200μMsaclofen （GABAB拮抗薬）および0 - 1μMGABA。用外のアウトmMでパッチ：140 NaClまたはコリンClを、0.3のKCl、2のMgCl _2、0.5 CaCl _2を 、5 EGTA、10 TESのpHは7.2から7.4。
3. ホールセル電圧クランプ記録： 浴溶液 ：。スライスが灌流（2 - 3ml /分）である今もキヌレン酸（3 mm）と特定の実験に必要になる可能性がある他の薬剤を含むACSFでピペット溶液が含まれているmMで：140塩化セシウム、1のCaCl _2、3 EGTA、0.5のKCl、1のMgCl _2、2 ATPとMg、0.3 GTP - Naは、5 QX - 314ブロマイド、CsOHと7.25の10 TESのpH。

4。パッチクランプ実験のためのギガオーム（GΩ）シールを形成する。

海馬脳切片（図1A）は、U字形の白金線上にナイロンスレッドで録音室の下部に保持されます。 CA1と3例：組織の組織と海馬スライスまたは特定の細胞における海馬歯状回領域を可視化するためには、顕微鏡が必要です。ほとんどの研究室では10倍から一組織内の地域または特定のセルを識別することができますので、60Xまでの目標に正立顕微鏡を使用してください。しかし、パッチのスライスに対しても、解剖顕微鏡は、次に、視覚的にパッチの領域ではなく、特定のセルを識別するために使用してすることができます。パッチのこのタイプは、"ブラインドパッチ"と呼ばれます。 INどちらの場合も最後の1つは、パッチは、特定のエリア内の単一のセルです。成功率は、2つのメソッドについても同様です。海馬の主細胞の細胞体は、高度に構造化されたラミナ編成（例えばCA3/CA1層三角骨と海馬脳スライスの明るいバンドとして識別）海馬のすべてのサブフィールドと階層の間で散在しているが、抑制性の細胞体です。総神経人口¹²の約​​10％を構成する介在。顆粒細胞や錐体神経細胞の粘膜にパッチを適用することが時折介在ニューロンまたはグリアは、これらの細胞の異なる電気的特性（海馬ブック^13を参照）によって主要な細胞から分化させることができる。

1. GΩのシール形成。この手順の実行中にガラスのピペットは、何らかの形でしっかりと、細胞膜に付着し、別のパッチ構成で我々は細胞膜に存在するGABA活性化チャネルの活性を測定することができます（4と5、以下を参照してください）​​となります。
   ピペットホルダーにピペットを入れ、ピペットを固定してキャップを締めます。 Axoclampアンプ200B上の設定は以下の通りです：V -クランプ、ゲイン2、フィルタ2 kHzの、保持電位は0 mVのであり、我々はPClampソフトウェアを使用してコンピュータを経由して実験を行っています。
2. ピペットホルダーに接続し、マウスピースとチューブの間にバルブを閉じてチューブに接続されているマウスピースに吹く。これはピペットで正圧を作成します。ピペットで正圧は2つの機能を持って、最初、ストリームはピペットから出てくると一回ピペットは、ピペットの先端を清潔に保つことを助ける浴溶液に入ります。第二に、パッチピペットを介して細胞膜への穏やかな吸引を適用する高品質、高抵抗のシールを形成するのに重要な部分です。シールは、しばしば単にピペットの圧力を制御するバルブを開くことによって形成することができる。このため、は空気の漏れがないことを確認してください。あなたが簡単にピペットでホルダーを取るこ​​とでリークをテストすることができる、マウスピースに水とブロー水を入れたビーカーにそれを浸し。もし気泡がエスケープ表示された場合、その部分は十分にタイトではない。
3. 浴溶液にあなたのピペットを下ろします。あなたがピペットの抵抗を測定するコンピュータの画面では、5 mVのパルス列と、あなたのピペットの抵抗を告げる番号が生成する方形パルスを表示されます。小さい数値は大きいピペットチップの開口部、大きなピペットを表します。オフセットを0にピペットを調整します。
4. 細胞膜にシール。 、上にシールを形成される領域や、パッチを適用しようとしている細胞を、識別する。脳スライス内の一つは、顕微鏡で10倍の倍率を用いて（図1A参照）明るいバンドとしての歯状回の顆粒または海馬のCA1とCA3錐体細胞体領域を識別することができますか我々は使用して個々の面錐体細胞を識別することができます60X倍率。
   1. あなたが顕微鏡のアイピースに目を通すときに、お住まいの地域/セルとピペットの両方を表示できるように焦点にあなたのピペットをもたらす。
   2. それだけで上記のが、組織に触れていないようになるまで、粗動マニピュレータの設定と下位ピペットを使用して領域/セルの中央上にピペットを置きます。
   3. 非常に穏やかにあなたのマニピュレータを微移動の設定を使用して、地域/セルの中央にあなたのピペットを下げると同時に、コンピュータの画面を見て、ピペットの抵抗を追跡する。あなたがピペットの抵抗が大きくなって（高い数値）が表示されるまであなたのピペットを上下に動かしてください。
   4. 今、静かにバルブを開いて、ピペットで正圧を解放。この金額は穏やかな吸引としばしばギガシール（高抵抗のシール、GΩが）automatically.Ifのない形成してから、以前に正圧を適用し、 ギガシールが形成されるマウスピースに吸引を適用する。
   5. これで、いわゆる細胞接着型のパッチクランプの構成を（図1Bを参照）取得している。ピペットとピペットホルダーからの過渡電圧をキャンセルし、高速と低速静電容量の補償を調整します。コンピュータの画面では、現在、フラット、現在のトレースが表示されます。高いGΩのシールの値は、より良好な信号対雑音比は、シングルチャネルの録音になりますれている。

それは時々海馬スライス内のパッチに有利であり得る。しないときは、それらがより保護されている表面上のいくつかのインスタンスでは細胞はより健康にすることができます。また、ケース内の1つは、組織内のニューロン、パッチ適用のトニック現世代での細胞外GABA濃度の影響として、細胞機能を細胞外環境の影響を研究していることは有利です。パッチ適用の手順はそのいずれかから離れて上記と同じですpoを解放しませんピペットで鋭敏圧力は、ピペットの先端まで、スライス内に​​あります。

5。細胞全体の設定と録音、細胞全体の電流の確立：

1. セルに接続された構成では、-60 mVにピペットの可能性を変更したり、細胞の静止膜電位に近い。
2. ピペットホルダーに接続し、同時に抵抗し、細胞に侵入した後に表示さキャパシタンスの過渡電圧の変化を注意することは、コンピュータの画面を見ているチューブを介してピペットに吸引を適用します。これは、いわゆる全細胞設定または全細胞モード（図1B）になって発生する場合。
   細胞膜の抵抗は、1つのセル型から別のものに変化し、膜内のチャネルと何かオープンのコンダクタンスに依存する。細胞膜の静電容量は、セルの大きさによって異なります。吸引は、最初は優しくはずですが、それは細胞より多くの力への侵入が困難な場合に適用することができます。吸引のパルスを使用することもできます。
3. 時には、ピペットと細胞の間に開発抵抗の補償が必要です。これは、シリーズまたはアクセス抵抗（RsまたはRa）補正と呼ばれ、アンプのコントロールノブを使用して、ソフトウェアまたは手動のいずれかを介して行うことができます。我々の実験では、Raの誤差を補正しないが、それは最初のアクセス抵抗の25％以上変化する場合の実験は拒否されます。
4. 全細胞モードで記録されたGABA活性化トニック電流。

細胞全体の構成では海馬のCA1錐体ニューロンで我々は、少なくとも保持電位に設定 - 60 mVを、5を待つ - ピペット溶液は、細胞内部で平衡化することができます10分。この時間の間に記録が安定する。実験中に我々は、直列抵抗の値を追跡する。

実験は、電圧クランプで行われて、全細胞膜におけるチャネルの人口を流れる電流を測定している。一つは、電流の位相性と持続性の性質により、GABA活性化シナプスとシナプス電流を区別することができます。拮抗薬SR95531は、すべてのGABA電流を抑制する。保持電流の減少は、ニューロンにおける現在のGABA活性化トニックのレベルを示します。

我々は、我々は通常、表面上の細胞ではなく、スライス内の細胞にパッチを適用していないスライスの外、周囲のGABAに依存していることトニックGABA活性化現在検討されていますように。我々はGABAチャンネルを変調するために使用するアゴニストおよびアンタゴニストは、浴溶液に適用され、スライス内の細胞に到達しません。 3ml /分 - 実験室内の溶液の流れの速度は2です。

6。単一チャネル電流の記録：

実験は、細胞に接続された、インサイドアウトまたは外部のアウトパッチクランプ構成で行われている（以下はこちらをご覧ください）​​とシングルチャネルの分子を介して我々は、記録電流を、単一チャネル電流。 Axoclamp 200B、V -クランプ、ゲイン500、フィルタ2または5 kHzの上に設定。我々はピペットの電位を制御PClampソフトウェアを使用して、それ以下100以下μsでデータのサンプリングレートを設定し、電流を記録する。それだけでスライスを覆うように、シングルチャネルの録音でノイズを最小限に抑えるために、浴溶液の量は低く抑えています。

1. セル接続構成におけるGABA活性化チャネル。あなたがセルに接続されたモードにある膜上GΩシールを取得していては（図1Bを参照）をピペットで囲まれた膜のパッチ内にあるチャンネルから録音することができますときに。 GABAは細胞膜を通過しないように、GABAは、パッチ内のチャンネルをアクティブにするためにピペット溶液に入れています。シナプス外GABA活性化チャネルは、数分までの待ち時間を有効にします。 PClampにあなたがで可能性を設定したピペットの電位、すなわち - - パッチの可能性は=は40 mVの、それは脱分極40mVのような膜によって記録されます。
   セルに接続されたモードでの記録の利点は、チャネルがそのネイティブ環境にあると正常細胞内タンパク質との要因に関連していることです。欠点は、あなたが絶対静止膜電位がわからないとして記録されており、パッチ間の電位は、両方のピペットの可能性と細胞の静止膜電位によって決定されるものの可能性を正確にわからないということです。
2. インサイドアウトの構成におけるGABA活性化チャネル。セルに接続されたモードで静かにピペットを持ち上げ、マイクロマニピュレータの微細な動きを使用してスライスから離れて側とに移動するとき。これで、インサイドアウトのパッチを持っており、インサイドアウトモードで記録することができます。
   あなたが（図1Bを参照）をピペットで囲まれている膜のパッチからの記録。セルに接続されたモードのようにするチャンネルをアクティブにするにはピペット溶液でGABAがある。彼らはピペットにまたがるとチャンネル[14]を調節することができるようになるようにしかし、そのようなベンゾジアゼピン、バルビツレート、プロポフォールなどの脂質二重層を横切る薬物は、浴溶液に適用することができます。パッチの可能性= - ピペットの可能性と細胞接着型のモードのように重ねては静止膜電位がないので、その後パッチを-40 mVにPClampの保持電位を設定した場合、パッチの可能性は、ピペットの可能性などに等しい。潜在的には、ちょうど40 mVです。
   インサイドアウトの構成の利点は1つが内部の膜の表面に薬剤や酵素を適用し、チャネルの特性に影響を与える場合、調べることができることです。インサイドアウトのパッチは、外部のアウトパッチが形成されている場合よりもチャネル複合体のための潜在的に、より穏やかなこの酒に酔って個別パッチのコンフィギュレーションの形成を行うチャネルの膜環境には適用されないことの力（下記参照下さい） 。
3. アウトサイドアウト構成でGABA活性化チャネル。ときは全細胞モードでは、静かに持ち上げたり、マイクロマニピュレータの微細な動きを使用して、ピペットを引く。同時に、パッチのプロパティを表示するコンピュータ上のウィンドウの内容を確認します。あなたが細胞から離れてピペットを描くようにするには、静電容量のトランジェントが消えると再度GΩシールを持って表示されます。これで、外部のアウトパッチを形成していると外アウトモードで記録することができます。
   どういうわけか、細胞膜は、ピペットの先端の開口部に封印している、膜の内側には、ピペットの内部と膜（図1B）録音室に直面している元の外側に直面している。検査されるGABAと他の薬剤は現在、浴溶液に溶解されています。あなたは40 mVにPClampの保持電位を設定した場合、パッチの可能性は=ピペットの潜在的なだけで全細胞モードの例で希望してパッチの可能性は、ちょうど40 mVです。
   外アウトモードの利点は、あなたの膜電位とは何か、膜オリジナル外側が直面しているとして、実験室、使用される薬が浴溶液に溶解し、容易に適用し、チャネルをオフに洗浄することができる正確に知っているということです。欠点は、膜がオーバーシールしなければならなかったし、いくつかの分子が失われた可能性がありますまたはローカル膜環境が歪んでようがなくなったチャネル細胞内、さらには膜貫通タンパク質と完全なチャネル機能に必要なことが要因に付いていない可能性があることです。プロセス。しかし、一緒に別のパッチの構成が、他の方法で、今日不可能な分子レベルでチャネルのプロパティの解剖を許可する。

7。結果の分析：

シングルチャネルと細胞全体の電流はPClampソフトウェアで分析されています。我々はSynaptosoft（GA、米国）またはAXOGraphを（シドニー、オーストラリア）を使用するシナプス事象の分析のため。

8。代表的な結果：

図。図2Aは、歯状回の顆粒神経細胞における細胞接着型のパッチで20nMのGABA濃度により活性化された単一チャネル電流を示しています。チャネルの最大コンダクタンスの活性化の待ち時間は2分38秒であり、最大コンダクタンスはPS ¹⁵ 44だった。パッチは、40 mVの脱分極によってだった。図。 2Bは、強壮剤と相動電流をidentifiyingラット海馬ニューロンからホールセル電圧クランプ電流のレコードの例を示します。 GABAA受容体拮抗薬SR95531は、両方のシナプス - （トニック）とシナプス生成された（一過性）GABA活性化電流を抑制する。我々は、（Ba）の歯状回ニューロンと（BB）インスリンはシナプス外チャンネルの（Ba、B）、ブロッキングSR95531により誘導されるベースライン電流の変化によって緊張性電流を明らかにCA1錐体ニューロンを治療するGABAA受容体拮抗薬SR95531（100μM）を適用シナプス電流の消失時SR95531ブロックシナプスチャンネル（BB）。基底状態の下のCA1錐体ニューロンは、ニューロンが⁴ GABA活性化トニック電流が開発インスリンの生理的濃度に暴露されると^、6トニックGABA活性化電流がしないが。

図1A。ラット海馬脳スライス、特定された地域では、CA1とCA3錐体細胞層と歯状回（DG）顆粒細胞層です。B.回路図パッチクランプの構成。

ラット海馬脳スライスの歯状回の顆粒細胞のセルに接続されたパッチのGABA 20nMのによって活性化された図2A。シングルチャネル電流。保持電位は脱分極40mVの（ピペットの電位= -40 mV）となった。スターは^（*、1日現在のトレース）電流が速い時間スケール（2に示すように、そこから識別するND現在のトレース）A.歯状回の顆粒細胞と-60 mVの保持電位で電圧固定モードでB.のCA1錐体ニューロンのラット海馬の脳のスライスに記録されている。B.細胞全体の電流から取られた。電流が記録される前にCA1実験のために、スライスは、室温で2時間1 nMのインスリンでインキュベートした。

Discussion

細胞全体の電流は、セル内のアクティブなチャンネルによって発生する電流のアンサンブルを表します。特定の薬理学及びGABAAチャンネルの塩化物の透過性は、これらのチャネルに関連付けられている電流を識別することが可能となります。シナプスのチャネルとシナプス外チャンネルの強壮剤活性化の活性化の一時的な性質がニューロンに発現するGABAAチャネルのこれら二つの集団間の簡単な差別化が可能になります。しかし、唯一のシングルチャネルの録音では、ある者は、強壮剤電流を生成するチャネル分子の動力学的性質を調べることができます。 100μs以内にアクティブにシナプスのチャネルとは異なり、トニックGABAAチャネルは、GABAが^{4,7,15,16,17,18が}適用される時間から数分の範囲の遅延で活性化されます。その多くのチャネルのプロパティでのチャネルの結果のこの遅延活性化は、全細胞記録を用いて研究することはできません。シングルチャネルレベルでのGABAAチャンネルの異なる亜集団は、機能的及び薬理学的性質を変化させることに基づいて同定することができます。このように、別のパッチクランプ構成が提供するものを活用することにより、それが詳細にニューロンのトニックとシナプス電流を生成するGABA活性化チャネルの分子機能と薬理学を勉強することが可能です。

Materials

Several patch-clamp hardware and software systems are available and they all operate using the same basic principles. In our laboratory we use the Axoclamp amplifiers and the PClamp software (Molecular Devices, USA) to record and analyze our experiments. Another popular brand is HEKA amplifiers and software (HEKA Elektronik , Germany) Microforge: Narishige MF-830 (Japan); Vibrotome: e.g. Leica VT1200S (Germany) or Campden Instruments vibrotome (UK); Microscope: Nikon Eclipse E600FN; Water bath; Micromanipulators: custom made and Narishige micromanipulators (Japan); Puller: DMZ-universal (Germany) or Narishige PC-10 (Japan). Electrode glass: GC150F-15 (Harvard Apparatus, UK).