GABA-activated Correntes canal único e Tonic em fatias de cérebro de rato

Summary

Usamos a técnica patch-clamp para medir GABA-activated single-channel correntes (GABAA canais, receptores GABAA) e as correntes sinápticas e tônico que eles geram em neurônios. Ativação dos canais diminui a excitabilidade neuronal na saúde e na doença

Abstract

O GABA _A canais estão presentes em todos os neurônios e estão localizados tanto nas sinapses e fora de sinapses onde geram correntes fásicas e tônicas, respectivamente ^4,5,6,7 O GABA _Um canal é um canal de cloreto de pentamérica GABA-gated. As subunidades do canal são agrupados em oito famílias (α1-6, β1-3, γ1-3, δ, ε, θ, π e ρ). Dois alphas, dois betas e um subunidade 3 ^º formam o canal funcional ^8. Ao combinar estudos de sub-tipo específico GABA-activated canal único moléculas com estudos incluindo populações de todos os canais GABA _A no neurônio torna-se possível entender o mecanismo básico de inibição neuronal e como ela é modulada por agentes farmacológicos.

Usamos a técnica patch-clamp ^9,10 para estudar as propriedades funcionais dos canais GABA _A em neurônios vivos em fatias de cérebro do hipocampo e gravar o canal único e todo-cell correntes. Nós ainda examinar como os canais são afetados por diferentes concentrações de GABA, outras drogas e os fatores intra e extracelulares. Para obter uma descrição teórica e prática detalhada do método de patch-clamp consulte A Single-Channel Recordings editado por B Sakman Neher e E ^10.

Protocol

1. Preparação de fatias do cérebro:

Experimentos são feitos em fatias de cérebro pós-natal do hipocampo de 16 - 22 dias de idade ratos Wistar.

1. Os animais são sacrificados por decapitação, em conformidade com as orientações locais de ética e protocolos de cuidados aprovado animal.
2. Remover rapidamente o cérebro com uma espátula e corte-o ao longo da linha média com uma lâmina cirúrgica (# 24). Coloque cada hemisfério em um papel de filtro Whatman com o corte de frente para o papel.
3. Coloque uma gota de supercola no disco de amostra e colocar o hemisfério em cima dela com a superfície de corte voltada para baixo. Coloque o disco de amostra na câmara de corte do vibratome que é preenchido com um fluido cerebrospinal gelada artificial (ACSF, por favor veja aqui abaixo 3.1).
4. Definir a espessura de corte de 400 mM e começar a cortar o cérebro. Você terá que cortar cerca de 2 mm de tecido cerebral antes de chegar ao hipocampo.
5. As fatias do hipocampo são colocados em uma placa de petri de vidro preenchidos com ACSF. A placa é colocada em um fundo preto (papel preto, por exemplo) para permitir a fácil visualização do hipocampo. Isolar o hipocampo do tecido circundante usando afiadas lâminas cirúrgicas. Tenha cuidado para não empurrar ou puxar o tecido.
6. Fatias são então incubadas na solução ACSF a 37,0 ° C por 1h e depois armazenado em temperatura ambiente até os experimentos são feitos. Durante a incubação de uma hora o tecido se recupera dos danos impostos pelo processo de corte.

2. Preparação de pipetas para remendar:

1. Pipetas são feitas de vidro borossilicato capilares.
2. O patch-pipetas são puxados em um extratores pipeta automática ou manual, resultando em pipetas resistência de 2-4 mohms para gravações de células inteiras ou 8-20 mohms de canal único gravações quando preenchido com a solução da pipeta adequada ea solução do banho ser a ACSF (veja abaixo, 3.1).
3. As pipetas que usamos para canal único gravações são polidas usando um microforge onde o calor a partir de um vidro derretido sentado no fio de platina torna a superfície mais lisa. O vidro de borosilicato mesmo como está no patch-pipetas é usado para formar a gota de vidro no fio. Polimento as pipetas desta forma, em nossa experiência cria pipetas que formam vedações resistência mais estável e mais elevado em comparação com pipetas polido pelo calor de um fio sem revestimento ou por uma etapa de polimento do extrator automático. Tamanho final das pipetas faixas de 8-20 mohms. Pipetas utilizadas em todo o celular gravações não são polidos.

3. Soluções utilizadas nos experimentos:

Soluções específicas são utilizadas para o canal único e todo-cell gravações.

1. ACSF contém em mM: NaCl 124, 26 NaHCO _{3, 3} KCl, 1,3 MgSO _4, 2,5 Na ₂ HPO _4, 2,5 CaCl _2, 10 glicose com pH 7,2-7,4 quando aeradas com 95% O ₂ e 5% CO _2. O ACSF às vezes é também complementado com outros nutrientes, como por exemplo, ¹¹ lactato.
2. Canal único gravações: A solução de banho ou é ACSF ou em mM: NaCl 140, KCl 5, 1 MgCl _2, 1,8 CaCl ₂ e 10 TES (N-tris [hidroximetil] metil-2-aminoetanosulfónico ácido) pH 7,25 e outras drogas que podem ser necessários para os experimentos específicos A solução pipeta para manchas de células-inscritos e de dentro para fora, em mM:. Colina 140 Cl, 5 NaCl, KCl 1, 1 MgCl _2, CaCl ₂ 1,8, 10 TES pH 7,25, 200 mM saclofen (antagonista GABA B) e 0-1 mM GABA. Para fora-out patches em mM: NaCl 140 ou Colina Cl, 0,3 KCl, MgCl 2 _2, 0,5 CaCl _2, 5 EGTA, 10 pH TES 7,2-7,4.
3. Whole-cell clamp tensão gravações: A solução de banho:. Fatias são perfundidos (2-3 ml / min) com ACSF agora contendo ácido também cinurênico (3 mM) e outras drogas que podem ser necessários para os experimentos específicos A solução contém pipeta em mM: 140 CsCl, 1 CaCl _2, 3 EGTA, 0,5 KCl, 1 MgCl _{2, 2} ATP-Mg, 0,3 GTP-Na, 5 QX-314 brometo, 10 pH de 7,25 TES com CsOH.

4. Formando um selo Giga Ohm (GÊ) para patch-clamp experimentos:

As fatias de cérebro do hipocampo (Fig. 1A) são realizadas na parte inferior da câmara de gravação por fios de nylon em um fio de platina em forma de U. Para visualizar a organização do tecido por exemplo, o CA1 e 3 e na região do giro dentado do hipocampo nos cortes ou as células específicas, você precisa de um microscópio. Maioria dos laboratórios utiliza um microscópio na posição vertical com objectivos que vão de 10X a 60X, permitindo assim uma para identificar regiões ou células específicas do tecido. No entanto, para as fatias patching mesmo um microscópio de dissecação pode ser usado e então você identificar visualmente uma região para corrigir, mas não uma célula específica. Este tipo de correção é chamado de "patching cego". Eun ambos os casos, um no final é remendar uma única célula em uma área específica. A taxa de sucesso é semelhante para os dois métodos. Embora os corpos celulares das principais células no hipocampo estão organizados em lâmina altamente estruturados (por exemplo, CA3/CA1 stratum pyramidale e identificado como faixas brilhantes na fatia do cérebro do hipocampo) dispersos por todas as sub-áreas e camadas do hipocampo são os corpos celulares dos inibitória interneurônios que compõem cerca de 10% do total da população neuronal ^12. O interneurônio ocasional ou glia que pode ser corrigido na célula granular ou lâmina neuronal piramidais podem ser diferenciadas das células principais pelas propriedades elétricas diferentes dessas células (veja o livro Hippocampus ^13).

1. GÊ formação de selo. Durante este processo a pipeta de vidro de alguma forma torna-se bem presas à membrana celular e nas configurações diferentes de patch (veja abaixo, 4 e 5), podemos medir a atividade do GABA ativado canais que estão na membrana da célula.
   Coloque a pipeta no suporte pipeta e aperte a tampa que prende a pipeta. Configurações no 200B amplificador Axoclamp são: V-clamp, Ganho 2, Filtro 2 kHz, o potencial de exploração é 0 mV e estamos fazendo o experimento através do computador utilizando o software PClamp.
2. Soprar no bocal que é ligado ao tubo que liga ao titular da pipeta e fechar a válvula entre o bocal eo tubo. Isto cria pressão positiva na sua pipeta. A pressão positiva na pipeta tem duas funções: primeiro, um fluxo sairá da pipeta e uma vez que a pipeta entra na solução do banho que irá ajudar a manter a ponta da pipeta limpa. Segundo, a aplicação de uma sucção suave para a membrana celular através da correção da pipeta é uma parte vital da formação de uma alta qualidade, alta resistência selo. O selo muitas vezes pode ser simplesmente formado pela abertura da válvula que controla a pressão da pipeta. Devido a isso, certifique-se que não há vazamentos de ar. Você pode facilmente testar se há vazamentos, tendo a titular com a pipeta, mergulhe-o em um copo cheio de água e soprar no bocal. Se você ver as bolhas de escapar, então essa parte não é firme o suficiente.
3. Inferior a pipeta na solução do banho. Na tela do computador onde você medir a resistência da pipeta você verá um pulso quadrado gerado por um trem de pulso 5 mV e um número que indica a resistência de sua pipeta. Menor número representa aberturas maiores pipeta ponta, pipetas maiores. Ajustar a pipeta compensar a 0.
4. Vedação à membrana celular. Identificar a região ou a célula que você está indo para a correção, isto é, formar um selo sobre. Dentro da fatia do cérebro pode-se identificar o grânulo giro dentado ou o CA1 e CA3 regiões de células piramidais corpo do hipocampo como faixas brilhantes (ver fig. 1A), utilizando o aumento de 10x no microscópio ou podemos identificar os neurônios piramidais superficiais individuais usando o ampliação de 60X.
   1. Traga a sua pipeta em foco para que você veja o seu tanto a região / celular e da pipeta quando você olha através do microscópio olho-peças.
   2. Coloque a pipeta acima do meio da célula / região usando as configurações do movimento coarse-manipulador e inferior a pipeta até que esteja um pouco acima, mas não tocar no tecido.
   3. Muito gentilmente inferior a pipeta para o meio da sua região / célula usando as configurações-movimento bem no seu manipulador e, ao mesmo tempo assistir a tela do computador e acompanhar a sua resistência pipeta. Mantenha mover-se a pipeta para baixo até ver a resistência da pipeta se tornando maiores (maior número).
   4. Agora, delicadamente solte a pressão positiva na pipeta, abrindo a válvula. Isso equivale a uma sucção suave e, muitas vezes se forma um giga-selo (lacre de alta resistência, GÊ) não automatically.If, em seguida, aplicar o vácuo para a parte da boca onde anteriormente aplicado a pressão positiva eo Giga-Seal irá se formar.
   5. Você tem agora obtidos a chamada célula-Attached configuração de patch-clamp (ver fig. 1B). Ajustar a compensação de capacitância rápido e lento para cancelar a transientes provenientes da pipeta e do titular da pipeta. Na tela do computador você vai ver agora um traço plano atual. Quanto maior o valor de vedação GÊ, melhor relação sinal-ruído, você terá no single-channel gravações.

Às vezes pode ser vantajoso para o patch dentro da fatia do hipocampo. Em alguns casos, as células podem ser mais saudáveis ​​quando não na superfície como eles são mais protegidos. Além disso, no caso um está estudando os efeitos do ambiente extracelular sobre as funções celulares, como efeito da concentração de GABA extracelular na geração atual tônica nos neurônios, patching dentro do tecido pode ser uma vantagem. O procedimento de correção é o mesmo descrito acima para além de que um não libera o popressão sível na pipeta até a ponta da pipeta está dentro da fatia.

5. Que institui a configuração de célula inteira e gravação de célula inteira correntes:

1. Na configuração da célula-ligado, mude o potencial pipeta para -60 mV ou perto o potencial de repouso de sua cela.
2. Aplicar o vácuo para a pipeta através do tubo que é conectado ao titular da pipeta e, ao mesmo tempo assistir a tela do computador para notar a mudança na resistência e os transientes de capacitância que aparecem depois de ter quebrado na célula. Quando isso acontece, você está no modo de chamada de configuração Whole-Cell ou células inteiras (Figura 1B).
   A resistência da membrana celular varia de um tipo celular para outro e depende da condutância dos canais na membrana e quantas estão abertas. A capacitância da membrana celular varia com o tamanho da célula. Sucção deve inicialmente ser gentilmente mas se é difícil entrar na força mais células pode ser aplicada. Pulsos de sucção também pode ser usado.
3. Às vezes, uma compensação para a resistência que se desenvolve entre a pipeta ea célula é necessária. Isso é chamado de série ou a resistência de acesso (Rs ou Ra) compensação e pode ser feito através do software ou manualmente usando um botão de controle no amplificador. Em nossos experimentos não compensar Ra mas as experiências são rejeitadas se ele varia de acordo com mais de 25% da resistência inicial de acesso.
4. GABA-activated correntes tônica gravada no modo de célula inteira.

Em toda a configuração de células do hipocampo em neurônios piramidais CA1 vamos definir o potencial de participação, em - 60 mV e esperar por 5 - 10 minutos permitindo que a solução da pipeta para equilibrar com o interior da célula. Durante esse tempo, a gravação se torna estável. Durante o experimento que manter o controle do valor da resistência série.

Experimentos são feitos na voltagem clamp e você medir a corrente através de uma população de canais na membrana de células inteiras. Pode-se diferenciar entre GABA-activated correntes sinápticas e extrasynaptic pela natureza fásica e tônica das correntes. O antagonista SR95531 inibe todas as correntes de GABA _A. A diminuição na corrente segurando indica o nível de GABA a tônica ativado atual no neurônio.

Como estamos interessados ​​na corrente GABA-activated tónico que é dependente do extracelular, GABA ambiente na fatia que normalmente não mancha as células na superfície, mas em vez disso, as células dentro da fatia. Agonistas e antagonistas que usamos para modular o GABA _A canais são aplicados na solução do banho e fazer chegar as células dentro da fatia. A taxa do fluxo de solução na câmara experimental é 2-3 ml / min.

6. Gravação de um único canal correntes:

Experimentos são feitos na célula-inscritos, o de dentro para fora ou de fora-out de configuração de patch-clamp (veja aqui abaixo) e nós correntes registro através de um único canal de moléculas, o single-channel correntes. Definições na Axoclamp 200B, V-clamp, ganho de 500, filtro de 2 ou 5 kHz. Com o software PClamp nós controlamos o potencial pipeta, definir a taxa de amostragem de dados com pelo menos 100 mS e registrar as correntes. A fim de minimizar o ruído em canal único gravações do volume da solução de banho é mantido baixo para que ela cobre apenas a fatia.

1. GABA-activated canais na configuração da célula-Attached. Quando você tiver obtido um selo GÊ na membrana que está no modo de células-inscritos e você pode gravar a partir de canais que estão no remendo de membrana delimitada pela pipeta (ver fig. 1B). Como GABA não atravessa a membrana celular, GABA é colocado na solução de pipeta para ativar os canais no patch. Extrasynaptic GABA-activated canais ativar com uma latência de até poucos minutos. O potencial patch é = - ou seja, potenciais pipeta quando em PClamp você definir o potencial de - 40 mV, é registrado pela membrana como mV 40 despolarizada.
   A vantagem de gravar em modo de células associadas é que o canal está em seu ambiente nativo e está em conexão com as proteínas normais intracelular e fatores. A desvantagem é que você não sabe exatamente qual o potencial que está a gravar como você não sabe o potencial de membrana em repouso absoluto e do potencial em todo o patch é determinada tanto pelo potencial de pipeta e do potencial de repouso da membrana da célula.
2. GABA-activated canais na configuração Inside-Out. Quando no modo de células-anexado gentilmente levante sua pipeta e movê-lo para o lado e longe da fatia usando a movimentos finos do micromanipuladores. Você tem agora um patch de dentro para fora e pode gravar no modo de dentro para fora.
   Você gravar a partir do pedaço de membrana que é delimitada pelo seu pipeta (ver fig. 1B). Como no modo de células-anexado que vocêtêm GABA na solução de pipeta para ativar os canais. Mas, as drogas que atravessam a bicamada lipídica, tais como benzodiazepínicos, barbitúricos, propofol, etc pode ser aplicado na solução do banho como eles serão capazes de cruzar a pipeta e modulam os canais [14]. O potencial de patch = - potencial de pipeta e já que não há potencial de repouso da membrana revestida como no modo de células-inscritos, o potencial de correção é igual ao da pipeta-por exemplo, potencial de se definir o potencial de participação na PClamp a -40 mV, em seguida o patch potencial é exatamente 40 mV.
   A vantagem da configuração de dentro para fora é que se pode aplicar drogas ou enzimas para a superfície da membrana interna e examinar se ela afeta as propriedades do canal. A força de fazer o patch de dentro para fora não se aplica ao ambiente da membrana do canal fazendo a formação dessa configuração de patch rasgou-off potencialmente mais suave para o complexo de canais do que quando o patch fora-out é formado (veja abaixo) .
3. GABA-activated canais na configuração Fora-Out. Quando no modo de célula inteira levantar delicadamente para cima ou para chamar de volta a pipeta usando os movimentos finos do seu micromanipulador. Ao mesmo tempo assistir a janela no seu computador que exibe as propriedades patch. Como desenhar a pipeta fora da célula, você verá os transientes de capacitância desaparecer e você voltará a ter um selo GÊ. Você já formou uma mancha de fora para fora e pode gravar no modo de Fora-Out.
   De alguma forma a membrana celular selou sobre a abertura da ponta da pipeta, o interior da membrana enfrenta o interior da pipeta e do exterior original da membrana faces da câmara de gravação (Figura 1B). GABA drogas e outras a serem analisados ​​são agora dissolvida na solução do banho. O potencial de patch = potencial pipeta como no exemplo do modo de célula inteira se você definir o potencial de participação na PClamp a 40 mV, em seguida, o potencial adesivo é exatamente 40 mV.
   As vantagens do modo de fora-out é que você sabe exatamente o que o seu potencial de membrana é e como a parte externa da membrana originais faces da câmara experimental, drogas para ser usado pode ser dissolvido na solução do banho e de fácil aplicação e lavados para os canais. As desvantagens são que você não pode ter anexado ao canal de proteínas transmembrana intracelular e até mesmo e os fatores que podem ser necessários para a função completa de canais como a membrana tinha para selar-over e algumas moléculas podem ter sido perdidos ou o ambiente de membrana locais distorcido em o processo. Mas, juntos as configurações diferentes de patch permitir a dissecação de propriedades do canal a nível molecular que não é possível com qualquer outro método hoje.

7. Analisando os resultados:

As correntes de canal único e todo-celular são analisados ​​com o software PClamp. Para as análises dos eventos sinápticos usamos Synaptosoft (GA, EUA) ou AXOGraph (Sydney, Austrália).

8. Resultados representativos:

Fig. 2A mostra single-channel correntes ativadas por 20 nM concentração GABA em um patch de células-inscrito no neurônio giro denteado grânulo. A latência de ativação da condutância máxima do canal foi de 2 minutos e 38 segundos e da condutância máxima foi de 44 pS ^15. O patch foi despolarizada em 40 mV. Fig. 2B mostra exemplos de toda célula de tensão-clamp registros atuais de neurônios do hipocampo de ratos identifiying tônica e fásica correntes. O antagonista GABAA SR95531 inibe tanto a extrasynaptic (tônica) eo synaptic gerado (fásica) GABA-activated correntes. Nós aplicamos o antagonista GABAA SR95531 (100 mM) para (Ba) dentate gyrus neurônio e (Bb) tratados com insulina CA1 neurônio piramidal revelando a tônica atual, a mudança na corrente de base induzida por SR95531 bloqueando os canais extrasynaptic (Ba, b) e o desaparecimento das correntes sinápticas quando SR95531 bloqueia os canais sinápticos (Bb). Em condição basal CA1 neurônios piramidais não têm tônica GABA-activated correntes ^6, mas quando os neurônios são expostos a concentrações fisiológicas de insulina ^quatro correntes GABA-activated tônica desenvolver.

Figura 1A. Rat fatia do cérebro do hipocampo, regiões identificadas são CA1 e CA3 camadas de células piramidais e giro denteado (DG) camada de células granulares. B. Esquema de patch-clamp configurações.

Figura 2A. Canais Single-correntes ativadas por 20 nM GABA em um patch de células-inscrito na célula giro denteado grânulos em uma fatia de cérebro de rato do hipocampo. Potencial Holding foi despolarizada 40 mV (potencial de pipeta = -40 mV). A estrela (*, 1 ^º traço atual) identifica de onde as correntes apresentadas na escala de tempo mais rápido (2nd traçado atual) foi retirado. B. Whole-cell correntes registrado em ratos fatia do cérebro do hipocampo em a. célula giro denteado grânulo e CA1 b. neurônio piramidal na tensão de clamp-mode com o potencial realização de -60 mV. Para o CA1 experimentos, as fatias foram incubadas em uma insulina nM por 2 h em temperatura ambiente antes de correntes foram registradas.

Discussion

A corrente de célula inteira representa o conjunto das correntes geradas por canais ativos na célula. A farmacologia específica e permeabilidade dos canais de cloreto de GABAA torna possível identificar correntes associadas a estes canais. A natureza transitória da ativação dos canais sinápticos ea ativação tônica dos canais extrasynaptic permite a diferenciação fácil entre essas duas populações de canais GABAA expressos em um neurônio. No entanto, apenas com um único canal gravações se pode estudar as propriedades cinéticas das moléculas canal que geram as correntes tônica. Ao contrário dos canais sinápticos que ativam dentro de 100 mS, os canais tônica GABAA são ativados com uma latência na faixa de minutos a partir do momento GABA é aplicada ^{4,7,15,16,17,18.} Esta ativação retardada dos resultados canais em que as propriedades do canal que muitos não podem ser estudados usando células inteiras gravações. No nível de canal único os diferentes sub-populações de canais GABAA podem ser identificados com base em diferentes propriedades funcionais e farmacológicos. Assim, tomando uma vantagem de que as diferentes configurações de patch-clamp tem a oferecer, é possível estudar em detalhe a função molecular e farmacologia dos canais GABA-ativada que gera as correntes tônico e sináptica nos neurônios.

Materials

Several patch-clamp hardware and software systems are available and they all operate using the same basic principles. In our laboratory we use the Axoclamp amplifiers and the PClamp software (Molecular Devices, USA) to record and analyze our experiments. Another popular brand is HEKA amplifiers and software (HEKA Elektronik , Germany) Microforge: Narishige MF-830 (Japan); Vibrotome: e.g. Leica VT1200S (Germany) or Campden Instruments vibrotome (UK); Microscope: Nikon Eclipse E600FN; Water bath; Micromanipulators: custom made and Narishige micromanipulators (Japan); Puller: DMZ-universal (Germany) or Narishige PC-10 (Japan). Electrode glass: GC150F-15 (Harvard Apparatus, UK).