ГАМК-активированный Одноканальный с тоником токи в ломтики мозга крысы

Summary

Мы используем патч-зажим технику для измерения ГАМК-активированный одноканальный токов (ГАМК-каналов, ГАМК-рецепторов) и синаптических с тоником они порождают токи в нейронах. Активация каналов уменьшает возбудимость нейронов в норме и патологии

Abstract

ГАМК каналы присутствуют во всех нейронов и расположены как в синапсах и за ее пределами синапсах, где они производят фазической и тонической токи, соответственно ^4,5,6,7 ГАМК канал pentameric ГАМК-хлорида закрытого канала. Канал подразделения сгруппированы в 8 семей (α1-6, β1-3, γ1-3, δ, ε, θ, π и ρ). Два альфа, бета два и один ^3-й субъединицы формы функциональных канал ^8. Объединив исследования подтипа конкретных ГАМК-активированный одноканальный молекул с исследованиями, в том числе все популяции ГАМК каналов в нейрон становится возможным понять основной механизм торможения нейронов и как она модулируется с помощью фармакологических средств.

Мы используем патч-зажим технику ^9,10 изучить функциональные свойства ГАМК каналов в живых нейронов в срезах гиппокампа мозга и записи одного канала и целых клеток токами. Кроме того, мы рассмотрим, как каналы страдают от различных концентраций ГАМК, другие препараты и внутри-и внеклеточных факторов. Подробное теоретическое и практическое описание патча-зажим метода см. одноканальный Recordings раз редактировалось B Sakman и Е Неер ^10.

Protocol

1. Подготовка мозга ломтиками:

Эксперименты проводились на срезах гиппокампа мозга от послеродовой 16 - 22 дней у крыс линии Вистар.

1. Животные были принесены в жертву путем обезглавливания в соответствии с местными этическими принципами и утверждены протоколы ухода за животными.
2. Быстро удалить мозга с помощью шпателя и разрезать его вдоль средней линии с хирургическим лезвием (# 24). Место каждого полушария на ватмане фильтр с разрезом перед бумагой.
3. Поместите каплю суперклея на образец диска и место полушарии на нем с поверхности среза вниз. Место образца диск в камеру дробления из vibratome, наполненный ледяной искусственной цереброспинальной жидкости (ACSF, пожалуйста, смотрите здесь ниже 3.1).
4. Установить толщина среза до 400 мкМ и начать сокращать мозга. Вам нужно будет отрезать примерно 2 мм мозговой ткани, прежде чем достичь гиппокампе.
5. Срезах гиппокампа помещают в стеклянную пластинку Петри заполнены ACSF. Пластина помещается на черном фоне (например, черная бумага), что позволяет легко визуализировать гиппокампе. Изолировать гиппокампа от окружающих тканей острыми хирургическими лезвий. Будьте осторожны, чтобы не толкать или тянуть ткани.
6. Ломтики затем инкубируют в растворе ACSF на 37,0 ° С в течение 1 часа и затем хранится при комнатной температуре до экспериментов сделали. В течение одного часа инкубации тканей восстанавливается от повреждения введенные процесса резки.

2. Подготовка пипетки для ямочного ремонта:

1. Пипетки изготавливаются из боросиликатного стекла капилляров.
2. Патч-пипеток тянут на автоматическое или ручное пипетки съемники в результате пипетки сопротивление 2 - 4 МОм для всей записи ячейки или 8 - 20 МОм для одноканальной записи при заполнении соответствующего решения пипетки и ванной раствора ACSF (см. ниже, 3.1).
3. Пипетки мы используем для одноканальной записи полируются использованием microforge где тепло из расплавленного стекла сидит на платиновой проволоки делает поверхность гладкой. Же боросиликатного стекла как в патч-пипеток используется для формирования стекла капли на проволоке. Полировка пипетки таким образом, в нашем опыте создает пипетки, которые формируют более стабильные и более высокие печатей сопротивление по сравнению с пипетки отполированы тепла из немелованной проводам или полировки шагом в автоматизированных съемника. Окончательный размер пипетки колеблется от 8 до 20 МОм. Пипетки используются в цельноклеточной записи не полируется.

3. Решения, используемые в экспериментах:

Конкретные решения, используемые для одноканальных и целых клеток записей.

1. ACSF содержит в мм: 124 NaCl, 26 NaHCO _{3, 3} KCl, 1,3 ₄ MgSO, 2,5 Na ₂ HPO _4, 2,5 CaCl _2, 10 глюкозы с рН 7,2 - 7,4, когда пропускают с 95% O ₂ и 5% СО _2. ACSF иногда также дополнены другими питательными веществами, такими как, например, молочной кислоты ^11.
2. Одноканальный записи: ванна решение либо ACSF или в мм: 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl _2, 1,8 CaCl ₂ и 10 ТЭС (N-трис [гидроксиметил] метил-2-aminoethanesulfonic кислота) рН 7,25 и других наркотиков которые могут быть необходимы для конкретных экспериментов пипетки раствор для сотовых подключением и наизнанку пятна в мм: 140. Холин Cl, 5 NaCl, KCl 1, 1 ₂ MgCl, 1,8 CaCl _2, 10 TES рН 7,25, 200 мкМ saclofen (GABAB антагонист) и 0 - 1 мкМ ГАМК. Для наружных из-патчей в мм: 140 NaCl или Холин Cl, 0,3 KCl, MgCl ₂ 2, 0,5 CaCl _2, 5 EGTA, 10 TES рН 7,2 - 7,4.
3. Всего-клеточные напряжения зажим записи: ванна решение:. Ломтики перфузии (2 - 3 мл / мин) с ACSF теперь содержащие также кинуреновой кислоты (3 мм) и другие препараты, которые могут быть необходимы для конкретных экспериментов решение пипетки содержит в мм: 140 CsCl, 1 CaCl _2, 3 EGTA, 0,5 KCl, 1 MgCl _{2, 2} ATP-Mg, 0,3 ГТФ-Na, 5 QX-314 метила, 10 TES рН 7,25 с CsOH.

4. Формирование Гига Ом (ГОм) уплотнение для патч-зажим экспериментов:

Срезах гиппокампа головного мозга (рис. 1А) проводятся в нижней части записи камеры нейлоновых нитей на П-образной платиновой проволоки. Для того, чтобы визуализировать ткани организация, например СА1 и 3 и зубчатой ​​извилине региона в срезах гиппокампа или специфические клетки, необходимо микроскопом. Большинство лаборатории используют прямой микроскоп с целями в диапазоне от 10X до 60X что позволяет отождествить регионов или конкретных клеток в ткани. Тем не менее, для ямочного ремонта ломтиками даже рассечение микроскоп может быть использован, а затем вы визуально определить области для исправления, а не конкретное клетки. Этот тип патчей называется "слепой исправления". Ян обоих случаях в конце концов это исправление одной ячейки в конкретной области. Успех ставка одинакова для обоих методов. Хотя клеточных тел основные клетки в гиппокампе организованы в хорошо структурированный пластинки (например, CA3/CA1 слой pyramidale и идентифицированы как яркие полосы в гиппокампе срез мозга), разбросанных среди всех подполей и слоев гиппокампа клеточных тел тормозных интернейронов, которые составляют около 10% от общего числа нейронов населения ^12. Случайные интернейронов или глии, которые могут быть исправлены в клетке гранулы или пирамидальной нейронов пластинки могут быть дифференцированы от основных клеток различных электрических свойств этих клеток (см. Гиппокамп книга ^13).

1. ГОм уплотнение образования. Во время этой процедуры стеклянную пипетку как-то становится плотно прикреплена к клеточной мембране и в различных конфигурациях патч (см. ниже, 4 и 5) мы можем измерить активность ГАМК-активированных каналов, которые находятся в клеточной мембране.
   Положить пипетку в пипетку держатель и затяните колпачок, который крепится пипетки. Настройки на Axoclamp 200B усилителя: V-образный зажим, Gain 2, фильтр 2 кГц, проведение потенциал 0 мВ и мы делаем эксперимент с помощью компьютера, используя PClamp программного обеспечения.
2. Удар в рот кусок, который крепится к трубке, которая подключается к держателю пипетки и закрыть клапан между кусок рот и трубы. Это создает избыточное давление в вашем пипетки. Положительное давление в пипетку имеет две функции: во-первых, поток будет выходить из пипетки и один раз пипетку входит ванна решение, что это поможет поддержанию кончиком пипетки чистой. Во-вторых, применение деликатного всасывания к клеточной мембране через патч-пипетки является важнейшей частью формирования высокого качества, высоким сопротивлением печатью. Печать часто может быть просто формируется путем открытия клапана, который управляет пипетки давления. Из-за этого, убедитесь, что Есть нет утечек воздуха. Вы можете легко проверить на наличие утечек, принимая держатель с пипетки, окуните его в стакан с водой и дуть в рот кусок. Если вы видите пузырьки побега то, что часть не достаточно плотно.
3. Сократите ваши пипетки в ванной решение. На экране компьютера, где вы измеряете пипетки сопротивления вы увидите, прямоугольные импульсы порожденных 5 мВ импульсов и номер, который говорит вам, сопротивление вашей пипетки. Меньше число представляет больше пипетки отверстия, большие пипетки. Отрегулируйте пипетку смещение в 0.
4. Уплотнение к клеточной мембране. Определить регион или ячейки вы собираетесь патч, то есть, форма печать на. В мозгу срез можно выделить зубчатой ​​извилине гранул или СА1 и СА3 пирамидальные тела клетки регионов гиппокампа в виде ярких полос (см. рис. 1A) с использованием 10-кратным увеличением на микроскоп или мы можем идентифицировать отдельные поверхности пирамидных нейронов использованием 60X увеличением.
   1. Возьмите пипеткой в ​​центр внимания, так что вы видите как ваш регион / ячейки и пипетки, когда вы смотрите через микроскоп глаз штук.
   2. Место пипетки выше середины область / ячейку с помощью грубого движения манипулятора настройки и нижней пипетки, пока он не только выше, но не касаясь ткани.
   3. Очень нежно опустите пипетки на середину вашем регионе / ячейку с помощью тонкой настройки движения на манипуляторе и в то же время смотреть на экран компьютера и отслеживать ваши пипетки сопротивления. Продолжайте двигаться ваши пипетки вниз, пока не увидите сопротивления пипетки становится все больше (большее число).
   4. Теперь, осторожно освободить положительного давления в пипетку, открывая клапан. Это составляет нежным всасывания и часто гига-печати (высокая печать сопротивление, ГОм) форм automatically.If нет, то применять всасывания в рот кусок, где вы ранее применявшиеся положительного давления и Giga-Seal будет форме.
   5. Вы уже получили так называемые Cell-Attached патч-зажим конфигурации (см. рис. 1В). Настройка быстрая и медленная емкости компенсации отменить переходные ближайшие из пипетки и держатель пипетки. На экране компьютера вы увидите плоские текущей следа. Чем выше значение ГОм печать, тем лучше сигнал-шум у вас будет в одноканальной записи.

Иногда бывает выгоднее патч в гиппокампе срез. В некоторых случаях клетки могут быть более здоровыми, когда они не на поверхности, поскольку они более защищены. Кроме того, в случае, если один изучает последствия внеклеточной среды на клеточные функции, такие как эффект внеклеточной ГАМК концентрации на тоник нынешнего поколения в нейронах, внесение исправлений в ткани может быть преимуществом. Исправлений процедура такая же, как описано выше, кроме того один не освобождает Роsitive давление в пипетку до кончика пипетки в срез.

5. Создание цельноклеточная конфигурации и записи цельноклеточная токов:

1. В камере подключением конфигурации, изменение пипетки потенциал -60 мВ или близко к мембранный потенциал покоя вашего мобильного.
2. Применить всасывания пипетки через трубку, которая соединена с пипеткой держатель и в то же время смотреть на экран компьютера отметить изменение сопротивления и емкости переходных, которые появляются, как только вы разбиты на ячейки. Когда это произойдет, вы находитесь в так называемой цельноклеточная конфигурации или целых клеток режиме (рис. 1б).
   Сопротивление клеточной мембраны изменяется от одного камерного типа к другому и зависит от проводимости каналов в мембране и сколько из них открыты. Емкость клеточной мембраны изменяется в зависимости от размера ячейки. Всасывающая должны быть первоначально мягко, но если это трудно пробиться в ячейке больше силы могут быть применены. Импульсы всасывания также могут быть использованы.
3. Иногда компенсации за сопротивления, которое развивается между пипеткой и клетка не требуется. Это называется серия или доступ сопротивления (РТС или Ra) компенсации и может быть сделано либо с помощью программного обеспечения или вручную с помощью ручки управления на усилителе. В наших экспериментах мы не компенсируют Ра, но эксперименты отклоняется, если она изменяется более чем на 25% от первоначального сопротивления доступа.
4. ГАМК-активированный тоник токи, записанные в цельноклеточной режиме.

В цельноклеточная конфигурации в гиппокампа СА1 пирамидных нейронов положить проведения потенциал на - 60 мВ и подождать 5 - 10 минут позволяет пипетки раствор, чтобы уравновесить с клеткой интерьера. За это время записи становится стабильной. В ходе эксперимента мы отслеживаем значение последовательного сопротивления.

Эксперименты проводятся в напряжении-зажим и вы измеряете ток через населению каналов в целом-клеточную мембрану. Можно различать ГАМК-активированный синаптических и extrasynaptic токов фазической и тонической характер течения. Антагонист SR95531 ингибирует ГАМК все токи. Снижение тока удержания показывает уровень ГАМК-активированный тоник тока в нейроне.

Как мы заинтересованы в тоником ГАМК-активированный ток, который зависит от внеклеточных, эмбиент ГАМК в срезе мы обычно не патч клеток на поверхности, но, скорее, клеток в срезе. Агонистов и антагонистов, которые мы используем для модуляции ГАМК каналы применяются в ванной решение и действительно достигают клеток в срезе. Скорость потока раствора в экспериментальной камере 2 - 3 мл / мин.

6. Запись одноканальный токов:

Эксперименты проводятся в клеточной прилагается, изнутри наружу или снаружи из-патч-зажим конфигурации (см. здесь ниже), и мы записываем токов через одноканальное молекул, одноканальный токов. Настройки на Axoclamp 200B, V-образный зажим, получить 500, фильтр 2 или 5 кГц. С PClamp программного обеспечения мы контролируем пипетки потенциал, установить скорость передачи данных выборки на уровне не менее 100 мкс и записывать токи. Для того, чтобы снизить уровень шума в одноканальном записи объема ванны решение поддерживать на низком уровне, так что она просто покрывает срез.

1. ГАМК-активированных каналов в Cell-Attached конфигурации. Когда вы получили ГОм печать на мембране вы находитесь в ячейке подключением режиме, и вы можете записывать с каналов, которые находятся в мембране патч заключены в пипетку (см. рис. 1В). Как ГАМК не пересекает клеточную мембрану, ГАМК помещают в раствор пипеткой, чтобы активировать каналы в патче. Extrasynaptic ГАМК-активированных каналов активировать с задержкой до нескольких минут. Патч потенциал = - пипетки потенциальных т.е. когда в PClamp вы установите потенциал при - 40 мВ, она регистрируется как мембрана деполяризованной 40 мВ.
   Преимущество записи в ячейки подключением режима является то, что канал находится в своей родной среде, и в связи с нормальным внутриклеточных белков и факторов. Недостатком является то, что вы не знаете точно, какой потенциал вы записываете, как вы не знаете, абсолютное мембранный потенциал покоя и потенциал на патч определяется как потенциал пипетки и мембранный потенциал покоя клетки.
2. ГАМК-активированных каналов в Inside-Out конфигурации. Когда в клетке подключением режиме осторожно поднимите пипетки и переместить его в сторону, подальше от среза с помощью тонких движений микроманипуляторами. Теперь вы наизнанку патч и может записывать в Inside-Out режиме.
   Вы запись из участок мембраны, которая заключена в вашем пипетки (см. рис. 1В). Как и в клеточной прилагается режимеесть ГАМК в решении пипетку, чтобы активировать каналы. Но, наркотики, которые пересекают липидный бислой, такие как бензодиазепины, барбитураты, пропофол и т.д. могут быть применены в ванне решения, как они смогут пересечь границу в пипетку и модулировать каналов [14]. Патч потенциал = - пипетки потенциал и поскольку нет мембранный потенциал покоя накладным, как в клетке подключением режиме, патч потенциал равен-пипетки потенциал, например, если вы установите проведения потенциал в PClamp до -40 мВ, то патч Потенциал ровно 40 мВ.
   Преимущество наизнанку конфигурации является то, что можно применить препараты или ферменты, чтобы внутренняя поверхность мембраны и рассмотреть, если это влияет на свойства канала. Силу решения наизнанку патч не распространяется на мембраны среду канал делает формирование этого разорвал-офф патч конфигурации потенциально более мягким для канала сложная, чем когда снаружи из-патч образуется (см. ниже) .
3. ГАМК-активированных каналов Вне-Out конфигурации. Когда в цельноклеточной режиме осторожно поднимите вверх или отступать пипетки использованием тонких движений вашего микроманипулятора. В то же время смотреть в окно на вашем компьютере, который отображает патч свойствами. Как вы рисуете пипетки от ячейки вы увидите емкости переходных исчезнет, ​​и вы опять придется ГОм печатью. Вы теперь формируется вне-из патча и может записывать в Вне-Out режиме.
   Каким-то образом клеточная мембрана имеет герметичный за кончик открытия пипетка, внутри мембраны лица интерьера пипетки и оригинальное снаружи мембраны лиц записи камеры (рис. 1б). ГАМК и других препаратов должны быть рассмотрены в настоящее время растворяется в ванне решение. Патч потенциал = пипетки потенциал как в цельноклеточной режиме, например, если вы установите проведения потенциал в PClamp до 40 мВ, то патч потенциал ровно 40 мВ.
   Преимущества вне-из режима является то, что вы точно знаете, что ваш мембранный потенциал и как мембрана оригинальные наружных плоскостей экспериментальную камеру, наркотики, которые будут использоваться может быть расторгнут в ванне раствор и легко применить к и смывается каналов. Недостатки, которые больше не могут иметь прилагается к каналу внутриклеточных белков и даже трансмембранного и факторы, которые могут быть необходимы для полной функции канала как мембрана была тюленей снова и некоторые молекулы могут быть потеряны или местной окружающей среды мембраны искажены процесса. Но, вместе различные конфигурации патч позволит вскрытия канала свойства на молекулярном уровне, что невозможно при использовании любого другого метода сегодня.

7. Анализ результатов:

Одноканальные и целых клеток токи проанализированы с PClamp программного обеспечения. Для анализа синаптических событий мы используем Synaptosoft (штат Джорджия, США) или AXOGraph (Сидней, Австралия).

8. Представитель результаты:

Рис. 2А показывает одноканальный токов активируются 20 нМ концентрации ГАМК в клеточной прилагается участок в зубчатой ​​извилине нейрона гранул. Задержки активации максимальной проводимости канала была 2 минуты и 38 секунд, а максимальная проводимость составила 44 пС ^15. Патч был деполяризованного на 40 мВ. Рис. 2В показаны примеры цельноклеточная напряжения зажим текущей записи из нейронов гиппокампа крыс identifiying тоником и фазовые токи. Антагонистом ГАМК-SR95531 ингибирует extrasynaptic-(тонизирующий) и синаптических генерируемые (фазный) ГАМК-активированных токов. Мы применили антагонистом ГАМК-SR95531 (100 мкМ) к (Ba) зубчатой ​​извилине нейрона и (Bb) инсулина лечение СА1 пирамидальных нейронов выявления тоник тока смещения в базовый ток, вызванный SR95531 блокирование extrasynaptic каналов (Ba, б) и исчезновения синаптических токов при SR95531 блоков синаптических каналов (Bb). Под базальной состояние СА1 пирамидных нейронов не имеют тонизирующий ГАМК-активированных токов ^6, но, когда нейроны подвергаются физиологические концентрации инсулина ⁴ ГАМК-активированных токов тоник развиваться.

Рисунок 1А. Срез гиппокампа крысы мозга, регионов, указанных в СА1 и СА3 пирамидальных слоев клеток и зубчатой ​​извилине (ГД) слой гранул клеток. Б. Схема патч-зажим конфигураций.

Рисунок 2А. Одноканальный токов активируются 20 нМ ГАМК в клеточной прилагается патч на зубчатой ​​извилине ячейки гранул в срез гиппокампа крысы мозга. Холдинг потенциал деполяризованного 40 мВ (потенциал пипетки = -40 мВ). Звездочкой (*, ^1-й текущем следов) определяет, откуда токи показаны на быстрый масштабе времени (2ой текущей след) была взята из. B. Всего-клеточные токи, записанные в срез гиппокампа крысы мозга в a. зубчатой ​​извилине ячейки гранул и b. СА1 пирамидальных нейронов в напряжении зажим режиме при проведении потенциал -60 мВ. Для СА1 экспериментов, срезы инкубировали в 1 нМ инсулина в течение 2 ч при комнатной температуре до токов были записаны.

Discussion

Цельноклеточная текущей представляет ансамбль токов, генерируемых активных каналов в клетке. Конкретные фармакологии и хлорида проницаемость ГАМК-каналов позволяет определить токи, связанные с этими каналами. Преходящий характер активации синаптических каналов и тонизирующее средство активизации extrasynaptic каналов позволяет легко различия между этими двумя популяциями каналов ГАМК выражается в нейроне. Однако, только с одноканальной записи можно изучать кинетические свойства канала молекул, которые генерируют тоник токов. В отличие от синаптических каналов, которые активируются в течение 100 мкс, тоник ГАМК-каналы активируются с задержкой в пределах минут с момента ГАМК применяется ^{4,7,15,16,17,18.} Эта задержка активации каналов результатов в том, что многие свойства канал не может быть изучены с помощью цельноклеточная записей. В одноканальном уровня различных групп населения каналов ГАМК могут быть идентифицированы на основе различных функциональных и фармакологических свойств. Таким образом, взяв преимущества того, что различные патч-зажим конфигурации могут предложить, можно детально изучить молекулярные функции и фармакологии ГАМК-активированных каналов, которые генерируют тонизирующее и синаптических токов в нейронах.

Materials

Several patch-clamp hardware and software systems are available and they all operate using the same basic principles. In our laboratory we use the Axoclamp amplifiers and the PClamp software (Molecular Devices, USA) to record and analyze our experiments. Another popular brand is HEKA amplifiers and software (HEKA Elektronik , Germany) Microforge: Narishige MF-830 (Japan); Vibrotome: e.g. Leica VT1200S (Germany) or Campden Instruments vibrotome (UK); Microscope: Nikon Eclipse E600FN; Water bath; Micromanipulators: custom made and Narishige micromanipulators (Japan); Puller: DMZ-universal (Germany) or Narishige PC-10 (Japan). Electrode glass: GC150F-15 (Harvard Apparatus, UK).