GABA corrientes activadas de un solo canal y Tonic en rodajas de cerebro de rata

Summary

Utilizamos la técnica de patch-clamp para medir GABA-activa de un solo canal corrientes (GABAA canales, los receptores GABA A) y las corrientes sinápticas y tónico que generan en las neuronas. La activación de los canales disminuye la excitabilidad neuronal en la salud y la enfermedad

Abstract

El GABA _A los canales están presentes en todas las neuronas y se encuentran tanto en las sinapsis y fuera de la sinapsis donde se generan las corrientes fásica y tónica, respectivamente ^4,5,6,7 El GABA _Un canal es _un pentamérica GABA-gated canal de cloro. Las subunidades de los canales se agrupan en 8 familias (α1-6, β1-3, γ1-3, δ, ε, θ, π y ρ). Dos alfas, betas dos y tres subunidades ^ª formar el canal funcional ^8. Mediante la combinación de estudios de la sub-tipo específico GABA activado por un solo canal con las moléculas de estudios con todas las poblaciones de GABA _A los canales en la neurona es posible entender el mecanismo básico de la inhibición neuronal y cómo se modula por agentes farmacológicos.

Utilizamos la técnica de patch-clamp ^9,10 para estudiar las propiedades funcionales de los canales _GABA en las neuronas vivas en rodajas de hipocampo del cerebro y el registro de un solo canal y las corrientes de células enteras. Hemos de seguir examinando la forma de los canales se ven afectados por diferentes concentraciones de GABA, otras drogas y los factores intra y extracelulares. Para una descripción detallada teórica y práctica del método de patch-clamp consulte la de un canal de grabaciones editadas por Sakman B y E Neher ^10.

Protocol

1. Preparación de rodajas de cerebro:

Los experimentos se realizan en rodajas de hipocampo de cerebro postnatal 16 a 22 días de edad ratas Wistar.

1. Los animales se sacrificaron por decapitación de acuerdo con las pautas locales de ética y protocolos aprobados por el cuidado de animales.
2. Quite rápidamente el cerebro con una espátula y cortar a lo largo de la línea media con una cuchilla quirúrgica (# 24). Lugar de cada hemisferio en un papel de filtro Whatman con el corte hacia el papel.
3. Ponga una gota de pegamento en el disco muestra y el lugar del hemisferio en la parte superior del mismo con la superficie del corte hacia abajo. Coloque el disco muestra en la cámara de corte de la vibratome que se llena con un líquido artificial helada cefalorraquídeo (ACSF, por favor ver aquí abajo 3.1).
4. Establecer el grosor de corte de 400 micras y empieza a cortar el cerebro. Usted tendrá que cortar unos 2 mm de tejido cerebral antes de alcanzar el hipocampo.
5. Los cortes de hipocampo se colocan en una placa de Petri de vidrio lleno de ACSF. La placa se coloca sobre un fondo negro (papel negro, por ejemplo) para permitir la fácil visualización de los hipocampos. Aislar el hipocampo de los tejidos circundantes con afiladas cuchillas quirúrgicas. Tenga cuidado de no empujar o tirar del tejido.
6. Las láminas se incuban en la solución de ACSF a 37,0 ° C durante 1 hora y luego se almacena a temperatura ambiente hasta que los experimentos se hacen. Durante la incubación de una hora el tejido se recupera de los daños impuestos por el proceso de corte.

2. Preparación de las pipetas para aplicar la revisión:

1. Pipetas están hechas de vidrio de borosilicato capilares.
2. El parche-pipetas se tiró de un extractor pipeta automática o manual que resulta en pipetas de resistencia de 2 a 4 mW para las grabaciones de células enteras o de 8 a 20 mW para las grabaciones de un solo canal cuando se llena con la solución de la pipeta adecuada y la solución del baño se la ACSF (ver más abajo, 3.1).
3. Las pipetas se utilizan para las grabaciones de un solo canal se pulen con un microforge donde el calor de un vidrio fundido se sienta en el alambre de platino hace que la superficie más lisa. El vidrio de borosilicato mismo que se encuentra en el parche pipetas se utiliza para formar la gota de vidrio en el cable. Pulir las pipetas de esta manera en nuestra experiencia crea pipetas que forman juntas una resistencia más estable y más alto en comparación con pipetas pulidas por el calor de un alambre sin recubrimiento o por una etapa de pulido en el extractor automático. El tamaño final de las pipetas oscila desde 8 hasta 20 mW. Pipetas utilizadas en células enteras grabaciones no están pulidas.

3. Las soluciones utilizadas en los experimentos:

Soluciones específicas se utilizan para el canal y las grabaciones de células enteras.

1. ACSF contiene en mM: 124 NaCl, 26 de NaHCO _{3, 3} KCl, 1,3 MgSO _4, 2,5 Na ₂ HPO _4, 2,5 CaCl _2, glucosa 10 con pH 7,2 a 7,4 cuando se burbujea con un 95% O ₂ y el 5% de CO _2. La ACSF a veces también se complementa con otros nutrientes como por ejemplo, lactato ^11.
2. De un solo canal de grabaciones: La solución es bien ACSF baño o en mm: 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl _2, 1,8 CaCl ₂ y TES 10 (N-tris [hidroximetil] metil-2-aminoetanosulfónico ácido) pH 7,25 y otras drogas que puedan ser necesarios para los experimentos específicos de la solución de la pipeta de parches de células adjunto y de adentro hacia afuera en mM: 140. colina Cl, 5 NaCl, KCl 1, 1 MgCl _2, 1,8 CaCl _2, 10 TES pH 7.25, 200 M saclofen (antagonista de GABAB) y 0-1 M GABA. Por fuera, los parches en mM: 140 NaCl o colina Cl, 0,3 KCl, 2 MgCl _2, 0,5 CaCl _2, 5 EGTA, pH 10 TES 7,2 a 7,4.
3. De células enteras de fijación de voltaje-grabaciones: La solución del baño:. Rebanadas son perfundidos (2-3 ml / min) con ACSF que ahora contiene también ácido quinurénico (3 mm) y otros medicamentos que puedan ser necesarios para los experimentos específicos de la solución de la pipeta contiene en mm: 140 CsCl, 1 CaCl _2, 3 EGTA, 0,5 KCl, _MgCl2 1, 2 ATP-Mg, 0,3 GTP-Na, 5 QX-314 de bromuro, 10 TES pH de 7,25, con CsOH.

4. La formación de un Giga Ohm (GΩ) sello para los experimentos de patch-clamp:

Las rebanadas de hipocampo del cerebro (Fig. 1A) se llevan a cabo en la parte inferior de la cámara de grabación de hilos de nylon en un alambre de platino en forma de U. Con el fin de visualizar la organización del tejido por ejemplo, la CA1 y 3 y en la región giro dentado del hipocampo en los cortes o las células específicas, se necesita un microscopio. La mayoría de los laboratorios utilizan un microscopio vertical, con objetivos que van desde 10x a 60x lo que permite a uno identificar regiones o células específicas del tejido. Sin embargo, para las rebanadas de parches, incluso un microscopio de disección se puede utilizar y luego identificar visualmente una región de parche pero no una celda específica. Este tipo de parches que se denomina "parches ciegos". Yon ambos casos, uno en la final es de parches de una sola célula en un área específica. La tasa de éxito es similar para los dos métodos. Aunque los cuerpos celulares de las células principales en el hipocampo se organizan en lámina altamente estructurados (por ejemplo, CA3/CA1 estrato pyramidale e identificado como bandas brillantes en la parte del cerebro del hipocampo) dispersos en todos los subcampos y los estratos del hipocampo son los cuerpos celulares de inhibidores interneuronas que constituyen cerca del 10% de la población total neuronal ^12. La interneurona ocasional o glia que puede ser reparado en el de células granulares o lámina neuronal piramidal puede ser diferenciado de las células principales de las diferentes propiedades eléctricas de estas células (ver El Libro Hipocampo ^13).

1. GΩ formación de sello. Durante este procedimiento, la pipeta de vidrio de alguna manera se convierte en fuertemente unido a la membrana celular y en la configuración de parches diferentes (véase más adelante, 4 y 5), podemos medir la actividad de GABA-activa los canales que se encuentran en la membrana celular.
   Coloque la pipeta en el soporte de la pipeta y ajuste la tapa que sujeta la pipeta. Ajustes en el 200B amplificador Axoclamp son: V-clamp, ganancia de 2, Filtro de 2 kHz, el potencial de explotación es 0 mV y estamos haciendo el experimento a través del ordenador utilizando el software pCLAMP.
2. Soplar en la boquilla que está conectada al tubo que conecta con el titular de la pipeta y cerrar la válvula entre la boquilla y el tubo. Esto crea una presión positiva en la pipeta. La presión positiva en la pipeta tiene dos funciones: en primer lugar, una corriente saldrá de la pipeta y una vez que la pipeta entre en la solución del baño le ayudará a mantener la punta de la pipeta limpia. En segundo lugar, la aplicación de una suave succión a la membrana celular a través del parche pipeta es una parte vital de la formación de una alta calidad, de alta resistencia del sello. El sello puede ser a menudo simplemente se formó mediante la apertura de la válvula que controla la presión de la pipeta. Debido a esto, asegúrese de que no hay fugas de aire. Puedes comprobar si hay fugas mediante la adopción de parte del titular de la pipeta, sumergirla en un vaso lleno de agua y soplar en la boquilla. Si ve burbujas escapar entonces esa parte no es lo suficientemente apretado.
3. Reducir su pipeta en la solución del baño. En la pantalla del ordenador en el que medir la resistencia pipeta verá un pulso cuadrado generado por un tren de pulsos 5 mV y un número que indica la resistencia de la pipeta. Un número más pequeño representa aberturas más grandes punta de la pipeta, pipetas mayor. Ajustar la pipeta de desplazamiento a 0.
4. Sellado de la membrana celular. Identificar la región o la celda que se va a parche, es decir, formar un sello en. Dentro de la parte del cerebro se puede identificar el gránulo giro dentado o la CA1 y CA3 regiones cuerpo de la célula piramidal del hipocampo como bandas luminosas (ver fig. 1A) con el aumento de 10x en el microscopio o se pueden identificar las neuronas piramidales de superficie individuales con el aumento 60X.
   1. Traiga su pipeta en el foco para que pueda ver tanto en su región / celular y la pipeta cuando se mira a través del microscopio ojo a balón parado.
   2. Coloque la pipeta por encima de la media de la celda de la región / con el movimiento grueso ajustes manipulador e inferior de la pipeta hasta que quede justo por encima, pero sin tocar el tejido.
   3. Muy suavemente bajar la pipeta en el centro de su región / celular utilizando la configuración de movimiento fino en el manipulador y, al mismo tiempo ver la pantalla del ordenador y realizar un seguimiento de su resistencia a la pipeta. Manténgase en movimiento la pipeta hasta que vea la resistencia de la pipeta cada vez más grandes (mayor número).
   4. Ahora, suavemente liberar la presión positiva en la pipeta mediante la apertura de la válvula. Esto equivale a una succión suave y muchas veces se forma un giga de sellado (sello de alta resistencia, GΩ) no automatically.If, a continuación, aplicar el vacío para la boquilla en la que previamente aplicada con presión positiva y el Giga-Seal formulario.
   5. Ahora ha obtenido la llamada celular-Attached patch-clamp de configuración (ver fig. 1B). Ajuste la compensación de capacitancia rápido y lento para cancelar los transitorios procedentes de la pipeta y el titular de la pipeta. En la pantalla de ordenador que ahora se ve una traza actual plana. Cuanto más alto sea el valor del sello es GΩ, la mejor relación señal-ruido tendrá en el único canal de grabaciones.

A veces puede ser ventajoso parche dentro de la rebanada del hipocampo. En algunos casos las células pueden ser saludables cuando no en la superficie, ya que están más protegidos. Además, en caso de que se está estudiando los efectos del medio extracelular en las funciones celulares, como efecto de las concentraciones extracelulares de GABA en la generación de tónica actual en las neuronas, los parches dentro de los tejidos puede ser una ventaja. El procedimiento de parcheo es el mismo que se ha descrito anteriormente, aparte de que no se suelte el popresión insensibles en la pipeta hasta la punta de la pipeta se encuentra dentro de la división.

5. Establecer la configuración de célula entera y las corrientes de grabación de células enteras:

1. En la configuración de la celda-adjunto, cambie el potencial de la pipeta a -60 mV o cerca del potencial de membrana de reposo de la célula.
2. El efecto de succión en la pipeta a través del tubo que está conectado al titular de la pipeta y, al mismo tiempo ver la pantalla del ordenador para observar el cambio en la resistencia y la capacitancia de los transitorios que aparecen una vez que han entrado en la célula. Cuando esto sucede, usted está en el modo de llamada de células enteras de configuración o de células enteras (Fig. 1B).
   La resistencia de la membrana celular varía de un tipo celular a otro y depende de la conductancia de los canales en la membrana y cuántos están abiertos. La capacitancia de la membrana celular varía según el tamaño de la célula. De succión debe ser, inicialmente con suavidad, pero si es difícil entrar en la fuerza de la célula más se puede aplicar. Los pulsos de aspiración también se puede utilizar.
3. A veces, una compensación por la resistencia que se desarrolla entre la pipeta y la célula es necesario. Esto se llama resistencia a la serie o de acceso (R o Ra) y la compensación se puede realizar a través del software o manualmente mediante un mando de control en el amplificador. En nuestros experimentos no compensan Ra pero los experimentos son rechazadas si varía en más del 25% de la resistencia inicial de acceso.
4. GABA corrientes activadas tónica registrada en el modo de células enteras.

En la configuración de célula completa en el hipocampo CA1 neuronas piramidales que establecer el potencial de retención de - 60 mV y espere 5 - 10 minutos que permite la solución de la pipeta que se equilibre con el interior de la célula. Durante este tiempo, la grabación se convierte en estable. Durante el experimento, no perder de vista el valor de la resistencia en serie.

Los experimentos se hacen en el voltaje-clamp y se mide la corriente a través de una población de canales en la membrana de células enteras. Se puede diferenciar entre GABA-activa de las corrientes sinápticas y extrasinápticos por la naturaleza fásica y tónica de las corrientes. El antagonista de SR95531 inhibe todas las corrientes de GABA _A. La disminución de la corriente de mantenimiento indica el nivel de la tónica actual de GABA-activa en la neurona.

Como estamos interesados ​​en la tónica GABA-activa actual que depende de la matriz extracelular, ambiente de GABA en el segmento que normalmente no se mancha las células en la superficie, sino más bien, las células dentro de la división. Agonistas y antagonistas que se utiliza para modular el GABA _A los canales se aplican en la solución del baño y hacer llegar a las células dentro de la rebanada. La tasa del flujo de solución en la cámara experimental es de 2 - 3 ml / min.

6. Grabación de un solo canal corrientes:

Los experimentos se hacen en el celular conectado, el dentro-fuera o fuera de la configuración de salida de patch-clamp (véase más adelante) y las corrientes de registro a través de un solo canal de moléculas, el único canal de corrientes. Configuración de Axoclamp 200B, V-clamp, el aumento de 500, filtro de 2 o 5 kHz. Con el software de control pCLAMP que el potencial de la pipeta, establecer la velocidad de muestreo de datos en no menos de 100 ms y grabar las corrientes. Con el fin de minimizar el ruido en las grabaciones de un solo canal el volumen de la solución del baño se mantiene bajo por lo que sólo cubre el sector.

1. GABA canales activados en la configuración del celular conectado. Cuando haya obtenido un sello GΩ en la membrana que está en el modo celular conectado y se puede grabar de los canales que están en el parche de membrana encerrada por la pipeta (ver fig. 1B). Como el GABA no atraviesa la membrana celular, el GABA se pone en la solución de la pipeta para activar los canales en el parche. Extrasinápticos GABA canales activados activan con una latencia de hasta unos pocos minutos. El potencial de parche = - es decir, el potencial pipeta cuando en pCLAMP se establece la posibilidad de - 40 mV, se registra por la membrana despolarizada como 40 mV.
   La ventaja de la grabación en el modo celular conectado es que el canal está en su ambiente nativo y está en relación con las proteínas normales intracelulares y factores. La desventaja es que usted no sabe exactamente cuál es el potencial que está grabando y cuando no se conoce el potencial de membrana en reposo absoluto y el potencial de todo el parche está determinado tanto por el potencial de la pipeta y el potencial de reposo de la membrana de la célula.
2. GABA canales activados en la configuración de adentro hacia fuera. En el modo de celular conectado a Levante ligeramente la pipeta y se mueven hacia un lado y lejos de la corte mediante el uso de los movimientos finos de la micromanipulador. Usted tiene ahora un parche de adentro hacia fuera y puede grabar en el modo de adentro hacia fuera.
   Graba desde el parche de membrana que está rodeada por la pipeta (ver fig. 1B). Al igual que en el modo celular conectado a la quehan GABA en la solución de la pipeta para activar los canales. Sin embargo, las drogas que atraviesan la bicapa lipídica, como las benzodiazepinas, los barbitúricos, propofol, etc se pueden aplicar en la solución del baño, ya que será capaz de cruzar en la pipeta y modulan los canales [14]. El potencial de parche = - potencial de la pipeta y ya que no hay potencial de reposo de la membrana superpuesta como en el modo celular conectado, el potencial de parche es igual a la pipeta por ejemplo, posibles si se establece la posibilidad de participación en pCLAMP a -40 mV el parche potencial es exactamente 40 mV.
   La ventaja de la configuración de adentro hacia afuera es que se pueden aplicar medicamentos o enzimas para la superficie de la membrana interna y examinar si afecta a las propiedades del canal. La fuerza de hacer el parche de dentro a fuera no se aplica para el medio ambiente de la membrana de los canales de toma de la formación de esta configuración de parches desgarrada, potencialmente más suave para el complejo de canales que cuando el parche fuera-out se forma (véase más adelante) .
3. GABA canales activados en la configuración exterior de salida. En el modo de célula entera levante suavemente hacia arriba o retroceder la pipeta con los movimientos finos de su micromanipulador. Al mismo tiempo, ver la ventana en su computadora que muestra las propiedades de conexión. A medida que dibuja la pipeta fuera de la celda, verá los transitorios de capacidad desaparecerá y volverá a tener un sello GΩ. Ha formado un parche fuera de espera y puede grabar en el modo Fuera de salida.
   De alguna manera la membrana celular ha sellado sobre la abertura punta de la pipeta, el interior de la membrana se enfrenta al interior de la pipeta y el exterior original de la membrana se enfrenta a la cámara de grabación (Fig. 1B). Drogas GABA y otros que deben examinarse son ahora disuelto en la solución del baño. El potencial de parche = potencial pipeta como en el ejemplo, el modo de célula entera si se establece la posibilidad de participación en pCLAMP a 40 mV entonces el potencial de parches es exactamente 40 mV.
   Las ventajas de la modalidad fuera de espera es que se sabe con precisión cuál es su potencial de membrana es y como fuera de la membrana original, se enfrenta a la cámara experimental, los fármacos a utilizar puede ser disuelto en la solución del baño y de fácil aplicación y lavado de los canales. Las desventajas son que ya no pueden tener conectados al canal proteínas transmembrana intracelular e incluso los factores que pueden ser necesarios para la función completa de canales en la membrana tuvo que sellar en off y algunas moléculas se puede haber perdido o el medio ambiente local de la membrana distorsionada el proceso. Pero, en conjunto las configuraciones diferentes parche permite la disección de las propiedades del canal a nivel molecular que no es posible con cualquier otro método que hoy en día.

7. Análisis de los resultados:

Las corrientes de un solo canal y de células enteras-son analizados con el software pCLAMP. Para los análisis de los acontecimientos sinápticos usamos Synaptosoft (GA, EE.UU.) o AXOGraph (Sydney, Australia).

8. Los resultados representativos:

Fig. 2A muestra de un solo canal corrientes activadas por la concentración de 20 nM de GABA en un parche de células se adjunta en las neuronas dentado gránulo giro. La latencia de la activación de la conductancia máxima del canal fue de 2 minutos y 38 segundos y la conductancia máxima fue de 44 PS ^15. El parche se despolariza por 40 mV. Fig. 2B muestra ejemplos de células enteras de fijación de voltaje, los registros actuales de las neuronas del hipocampo de rata identifiying tónica y fásica corrientes. El antagonista GABAA SR95531 inhibe tanto la extrasinápticos (tónica) y el sináptica generada (fásico) corrientes GABA-activa. Se aplicó el antagonista GABAA SR95531 (100 M) a (Ba) y giro dentado neurona (Bb) tratados con insulina las neuronas piramidales CA1 revela la tónica actual, el cambio en la corriente inducida por la línea de base SR95531 bloqueo de los canales extrasinápticos (Ba, b) y la desaparición de las corrientes sinápticas cuando SR95531 bloquea los canales sinápticos (Bb). En condiciones basales CA1 neuronas piramidales no tienen tónico GABA corrientes activadas ^6, pero cuando las neuronas son expuestas a concentraciones fisiológicas de insulina ⁴ GABA corrientes activadas tónico desarrollar.

Figura 1A. Tajada de cerebro de rata del hipocampo, las regiones identificadas están CA1 y CA3 capas de células piramidales y el giro dentado (DG) de la capa de células granulares. B. Esquema de patch-clamp configuraciones.

Figura 2A. Monocanal corrientes activadas por 20 nM GABA en un parche de células en la celda adjunta dentado gránulo giro en un trozo de cerebro de rata del hipocampo. Potencial de mantenimiento se despolariza 40 mV (potencial pipeta = -40 mV). El asterisco (*, un rastro ^º curso) identifica, desde donde las corrientes se muestra en el menor tiempo de escala (2rastro º curso) fue tomada de. B. de células enteras corrientes registró en el segmento del cerebro de hipocampo de rata en células granulares dentadas a. y b. giro neuronas piramidales CA1 en modo de voltaje-clamp en el potencial de reposo de -60 mV. Para el CA1 experimentos, los cortes fueron incubados en la insulina 1 nM durante 2 horas a temperatura ambiente antes de las corrientes se registraron.

Discussion

La corriente de célula entera representa el conjunto de las corrientes generadas por los canales activos en la célula. La farmacología específica y la permeabilidad de los canales de cloruro de GABAA permite identificar las corrientes asociadas a estos canales. La naturaleza transitoria de activación de los canales sinápticos y la activación tónica de los canales de extrasinápticos permite diferenciar fácilmente entre estas dos poblaciones de los canales GABAA expresado en una neurona. Sin embargo, sólo con un solo canal de grabaciones se puede estudiar las propiedades cinéticas de las moléculas de los canales que generan las corrientes tónico. A diferencia de los canales sinápticos que se activan a menos de 100 ms, los canales GABAA tónica se activan con una latencia en el rango de minutos desde el momento GABA se aplica ^{4,7,15,16,17,18.} Esta activación retardada de los resultados de los canales en que las propiedades de los canales que muchos no pueden ser estudiados usando células enteras grabaciones. En el ámbito de un solo canal de los diferentes sub-poblaciones de los canales GABAA pueden ser identificados en base a diferentes propiedades funcionales y farmacológicas. Por lo tanto, tomando una ventaja de lo que las diferentes configuraciones de patch-clamp tienen que ofrecer, es posible estudiar en detalle la función molecular y la farmacología de los canales activados por GABA que generan las corrientes tónico y sináptica de las neuronas.

Materials

Several patch-clamp hardware and software systems are available and they all operate using the same basic principles. In our laboratory we use the Axoclamp amplifiers and the PClamp software (Molecular Devices, USA) to record and analyze our experiments. Another popular brand is HEKA amplifiers and software (HEKA Elektronik , Germany) Microforge: Narishige MF-830 (Japan); Vibrotome: e.g. Leica VT1200S (Germany) or Campden Instruments vibrotome (UK); Microscope: Nikon Eclipse E600FN; Water bath; Micromanipulators: custom made and Narishige micromanipulators (Japan); Puller: DMZ-universal (Germany) or Narishige PC-10 (Japan). Electrode glass: GC150F-15 (Harvard Apparatus, UK).