GABA-aktiverade Single-kanal och Tonic Strömmar i skivor Rat Brain

Summary

Vi använder den patch-clamp teknik för att mäta GABA-aktiverade enkanalig ström (GABAA kanaler, GABAA-receptorer) och det synaptiska och tonic ström de genererar i nervceller. Aktivering av kanalerna minskar neuronal retbarhet vid hälsa och sjukdom

Abstract

Den GABA _A-kanaler finns i alla nervceller och finns både på synapser och utanför synapser, där de genererar phasic och tonic strömmar respektive ^4,5,6,7 GABA _En kanal är en pentameric GABA-gated kloridkanal. Kanalen subenheter är grupperade i åtta familjer (α1-6, β1-3, γ1-3, δ, ε, θ, π och ρ). Två alphas, två betaversioner och en 3: ^e subenheten bilda funktionella kanal ^8. Genom att kombinera studier av subtyp specifika GABA-aktiverade en kanal molekyler med studier inklusive alla populationer av GABA _A-kanaler i neuron det blir möjligt att förstå de grundläggande mekanism neuroninhibitering och hur det moduleras av farmakologiska agenter.

Vi använder den patch-clamp teknik ^9,10 för att studera den funktionella egenskaperna hos GABA _A-kanalerna i levande nervceller i hippocampus hjärnan skivor och spela in en kanal och helcells-strömmar. Vi undersöker vidare hur kanalerna påverkas av olika GABA koncentrationer, andra droger och intra-och extracellulära faktorer. För detaljerad teoretisk och praktisk beskrivning av patch-clamp metoden se Single-Channel Recordings redigerad av B Sakman och E Neher ^10.

Protocol

1. Beredning av hjärnan skivor:

Experiment görs på hippocampus hjärnan skivor från födsel från 16 till 22 dagar gamla Wistar råttor.

1. Djuren offras genom halshuggning i enlighet med lokala etiska riktlinjer och godkända djur protokoll vård.
2. Snabbt bort hjärnan med en spatel och skär den längs mittlinjen med ett kirurgiskt blad (# 24). Placera varje halvklotet på en Whatman filterpapper med cut mot papperet.
3. Lägg en droppe superlim på provet disken och placera halvklotet ovanpå den med snittytan nedåt. Placera provet disken i klippkammare av vibratome som är fylld med en iskall artificiell cerebrospinalvätska (ACSF, se nedan 3.1).
4. Ställ in slice tjocklek till 400 mikroM och börja skära hjärnan. Du kommer att behöva skära av ca 2 mm av hjärnvävnad innan du når hippocampus.
5. Den hippocampus skivor läggs i ett glas Petri tallrik fylld med ACSF. Skylten är placerad på en svart bakgrund (t.ex. svart papper) för enkel visualisering av hippocampi. Isolera hippocampus från den omgivande vävnad med hjälp av vassa kirurgiska knivar. Var försiktig så att inte skjuta eller dra i vävnaden.
6. Segment inkuberas därefter i ACSF lösning vid 37,0 ° C i 1 timme och sedan förvaras i rumstemperatur tills experiment är klar. Under en timmes inkubation vävnad återhämtar sig från skador som följer av styckningen.

2. Beredning av pipetter för lappning:

1. Pipetter är gjorda av borsilikatglas kapillärer.
2. Plåstret-pipetter drog på en automatiserad eller manuell pipett avdragare resulterar i pipetter motstånd på 2 - 4 Mohm för hela cellen inspelningar eller 8 - 20m Mohm för enkel-kanals inspelningar när den är fylld med lämplig pipett lösning och badet lösningen är den ACSF (se nedan, 3.1).
3. Det pipetter vi använder för en kanal inspelningar poleras med hjälp av en microforge där värmen från en smält glas som sitter på platinatråd gör ytan jämnare. Samma borosilikatglas är som i patch-pipetter används för att bilda glaset droppen på tråd. Polering av pipetter detta sätt i vår erfarenhet skapar pipetter som bildar stabilare och högre motståndskraft sälar jämfört med pipetter slipats av värme från ett obestruket tråd eller genom en polering steg i automatiserade avdragare. Slutlig storlek pipetter varierar från 8 till 20 Mohm. Pipetter används i helcells-inspelningar är inte polerad.

3. Lösningar som används i experimenten:

Specifika lösningar används för en-kanal och helcells-inspelningar.

1. ACSF innehåller i mm: 124 NaCl, 26 NaHCO _{3, 3} KCl, 1,3 MgSO _4, 2,5 Na ₂ HPO _4, 2,5 CaCl _2, 10 glukos med pH 7,2 till 7,4 när bubblade med 95% O ₂ och 5% CO _2. Den ACSF ibland också kompletteras med andra näringsämnen såsom t.ex. laktat ^11.
2. Single-kanals inspelningar: Badet Lösningen är antingen ACSF eller i mm: 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl _2, 1,8 CaCl ₂ och 10 TES (N-tris [hydroxymetyl] metyl-2-aminoethanesulfonic surt) pH 7,25 och andra droger som kan behövas för den specifika experiment pipett lösningen för cell-anslutna och Inifrån-ut patchar i mm:. 140 Kolin Cl, 5 NaCl, ett KCl, en MgCl _2, 1,8 CaCl _2, 10 TES pH 7,25, 200 mikroM saclofen (GABAB antagonist) och 0 - 1 mikrometer GABA. För utsidan ut patchar i mm: 140 NaCl eller Kolin Cl, 0,3 KCl, 2 MgCl _2, 0,5 CaCl _2, 5 EGTA, 10 TES pH 7,2 till 7,4.
3. Hela-cellspänning-clamp inspelningar: Badet lösning:. Skivor är perfusion (2 - 3 ml / min) med ACSF nu innehåller också kynurensyra (3 mm) och andra läkemedel som kan behövas för den specifika experiment pipett lösningen innehåller i mm: 140 CsCl, 1 CaCl _2, 3 EGTA, 0,5 KCl, 1 MgCl _2, 2 ATP-Mg, 0,3 GTP-Na, 5 QX-314 bromid, 10 TES pH 7,25 med CsOH.

4. Bildar en Giga Ohm (GΩ) tätning för patch-clamp experiment:

Den hippocampus hjärnan skivor (Fig. 1A) hålls längst ner på inspelningen kammare av nylon trådar på ett U-format platina tråd. För att visualisera vävnaden organisation t.ex. CA1 och 3 och dentate gyrus regionen i hippocampus skivor eller specifika celler behöver du ett mikroskop. De flesta laboratorier använder en upprätt mikroskop med mål som sträcker sig från 10x till 60X vilket möjliggör en att identifiera regioner eller specifika celler i vävnaden. Men för lappning skivor även en dissektion mikroskop kan användas och sedan visuellt identifiera en region för att lappa, men inte en specifik cell. Denna typ av lapp som kallas "blind lapp". Jagn båda fallen en i slutändan är patcha en enda cell i ett visst område. Framgången är likartad för de två metoderna. Även cellen organ av de viktigaste cellerna i hippocampus är organiserade i mycket strukturerad lamina (t.ex. CA3/CA1 stratum pyramidale och identifieras som ljusa band i hippocampus hjärnan slice) utspridda bland alla delområden och skikt av hippocampus är cellens organ hämmande interneuronen som utgör ca 10% av den totala neuronala befolkningen ^12. Tillfällig interneuron eller Glia som kan lagas i granulat cell eller pyramidformade neuronala lamina kan skiljas från den huvudsakliga cellerna av de olika elektriska egenskaperna hos dessa celler (se hippocampus Book ^13).

1. GΩ tätning bildas. Under detta förfarande glaspipett blir på något sätt tätt knuten till cellulära membran och i de olika patch konfigurationer (se nedan, 4 och 5) kan vi mäta aktiviteten av GABA-aktiverade kanaler som finns i cellmembranet.
   Placera pipetten i pipetten hållaren och dra åt locket som fäster pipetten. Inställningar på Axoclamp förstärkaren 200B är: V-klämma, Gain 2, Filter 2 kHz, är innehavet potentiella 0 mV och vi gör experimentet via datorn med PClamp programvara.
2. Blåsa i munstycket som är ansluten till röret som ansluter till pipetten hållaren och stäng ventilen mellan munstycket och röret. Detta skapar övertryck i din pipett. Det positiva trycket i pipetten har två funktioner, först kommer en ström komma ut ur pipetten och när pipetten in i badet lösning det kommer att hjälpa hålla pipettspetsen ren. För det andra, med ett lätt sug till cellmembranet via patch-pipetten är en viktig del av att bilda en hög kvalitet, hög motståndskraft tätning. Tätningen ofta kan enkelt bildas genom att öppna ventilen som styr pipetten trycket. På grund av detta, se till att inga luftläckage. Du kan enkelt testa för läckage genom att innehavaren med pipett doppa den i en bägare fylld med vatten och blåsa i munstycket. Om du ser några bubblor fly så att en del inte är tillräckligt stram.
3. Sänk din pipett i badet lösningen. På datorskärmen, där du mäta pipetten motståndet ser du en ruta puls som genereras av en 5 mV pulståg och en rad som talar om motståndet i din pipett. Mindre antal är större öppningar pipettspetsen, större pipetter. Justera pipetten offset till 0.
4. Tätning till cellmembranet. Identifiera regionen eller den cell du ska plåster, det vill säga bildar ett sigill på. Inom hjärnan skiva man kan identifiera dentate gyrus granulat eller CA1 och CA3 pyramidal cell delar av kroppen av hippocampus som ljusa band (se bild. 1A) med 10x förstoring på mikroskop eller vi kan identifiera de enskilda ytan pyramidformade nervceller med hjälp av 60X förstoring.
   1. Ta med pipett i fokus så att du ser både din region / cell och pipetten när du tittar i mikroskopet eye-bitar.
   2. Placera pipetten ovanför mitten av regionen / cell med grov-rörelsen manipulator inställningar och sänka pipetten tills den är precis ovanför, men inte vidröra vävnaden.
   3. Mycket försiktigt sänka din pipett till mitten av din region / cell med fina rörelser inställningar på roboten och samtidigt titta på datorskärmen och hålla koll på din pipett motstånd. Håll flytta pipett ned tills du ser motståndet av pipetten blir större (högre nummer).
   4. Nu, försiktigt släppa det positiva trycket i pipetten genom att öppna ventilen. Detta motsvarar en lätt sugning och ofta en Giga-tätning (högt motstånd tätning, GΩ) former automatically.If inte, då gäller sug på munstycket där du tidigare ansökt övertryck och Giga-Seal kommer att utgöra.
   5. Du har nu fått den så kallade cell-anslutna patch-clamp konfiguration (se bild. 1B). Justera snabb och långsam kapacitans kompensation för att avbryta transienter som kommer från pipetten och pipetten hållaren. På datorskärmen du nu se en plan nuvarande spår. Ju högre GΩ tätningen värdet är, desto bättre signal-brus-förhållande har du i den enda kanal inspelningar.

Det kan ibland vara fördelaktigt att patch inom hippocampus slice. I vissa fall cellerna kan vara friskare när de inte på ytan eftersom de är mer skyddade. Även om man studerar effekterna av den extracellulära miljön på cellulära funktioner, såsom effekten av extracellulära GABA koncentrationen på tonic nuvarande generationen i nervceller, patchning i vävnaden kan vara en fördel. Korrigeringsprocessen Proceduren är densamma som ovan bortsett från att man befriar inte pokänsliga tryck i pipetten tills pipettspetsen är inom segmentet.

5. Upprättandet av helcells-konfiguration och inspelning helcells-strömmar:

1. I cellen-anslutna konfiguration, ändra pipetten potential till -60 mV eller nära den vila membranpotential i din cell.
2. Applicera sug att pipetten via slang som är ansluten till pipett hållaren och samtidigt titta på datorskärmen för att notera förändringar i motstånd och transienter kapacitans som visas när du har brutit sig in i cellen. När detta händer du är i den så kallade helcells-konfiguration eller helcells-läge (bild 1B).
   Cellmembranet motstånd varierar från en celltyp till en annan och beror på värmeledningsförmåga kanaler i membranet och hur många är öppna. Cellmembranet kapacitans varierar med storleken på cellen. Sug bör initialt vara försiktigt, men om det är svårt att bryta sig in i cellen mer kraft kan tillämpas. Pulser av sug kan också användas.
3. Ibland kan en ersättning för motstånd som utvecklas mellan pipetten och cellen krävs. Detta kallas serien eller tillgång motstånd (R eller RA) Ersättning och kan göras antingen via programvaran eller manuellt med en ratten på förstärkaren. I våra experiment har vi kompenserar inte Ra men experiment avslås om det varierar med mer än 25% från den ursprungliga tillgång till motstånd.
4. GABA-aktiverade tonic strömmar in i helcells-läge.

I hela-cells konfiguration i hippocampus CA1 pyramidala nervceller vi sätter innehavet potentialen på - 60 mV och vänta i 5 - 10 minuter gör att pipetten lösningen jämvikt med cellens inre. Under denna tid inspelningen blir stabil. Under experimentet vi hålla reda på värdet av serien motstånd.

Experiment görs i spänning-clamp och du mäta strömmen genom en population av kanaler i hela-cellmembranet. Man kan skilja mellan GABA-aktiverade Synaptic och extrasynaptic strömmar genom phasic och tonic natur strömmar. Den antagonist SR95531 hämmar alla GABA _A strömmar. Minskningen av hållström visar nivån av GABA-aktiverade tonic ström i neuron.

Eftersom vi är intresserade av tonic GABA-aktiverade ström som är beroende av den extracellulära, omgivande GABA i segmentet vi normalt gör patch inte cellerna på ytan, utan snarare, de celler inom segmentet. Agonister och antagonister som vi använder för att modulera GABA _A-kanalerna används i badet lösning och når cellerna inom segmentet. Frekvensen av lösningen flödet i experimentella kammaren är 2 - 3 ml / min.

6. Inspelning av en kanal strömmar:

Experiment görs i cellen-anslutna, insidan ut eller utsidan ut patch-clamp konfiguration (se nedan) och vi spela in strömmar genom en kanal molekyler, den enda kanalen strömmar. Inställningar på Axoclamp 200B, V-klämma, vinna 500, filter 2 eller 5 kHz. Med PClamp programvaran vi kontrollerar pipetten potential, ställ dataregistreringsfrekvens på inte mindre än 100 ìs och spela in strömmarna. För att minimera brus i en kanal inspelningar volymen av badet lösningen hålls låg så att den precis täcker segmentet.

1. GABA-aktiverade kanaler i Cell-anslutna konfiguration. När du har fått ett GΩ tätning på membranet du är i cellen-anslutna läget och du kan spela in från de kanaler som finns i membranet patch som omges av pipett (se bild. 1B). Som GABA inte passerar cellmembranet är GABA tas i pipetten lösningen för att aktivera kanaler i plåstret. Extrasynaptic GABA-aktiverade kanaler aktiveras med en fördröjning på upp till några minuter. Plåstret Potentialen är = - pipett potential dvs när PClamp du anger potentialen på - 40 mV, det registreras av membranet som depolarized 40 mV.
   Fördelen med att spela in i cellen-anslutna läget är att kanalen är i sin naturliga miljö och är i samband med den normala intracellulära proteiner och faktorer. Nackdelen är att du inte vet exakt vilken potential du spelar som du inte vet det absolut vila membran potential och den potential som plåstret bestäms både av pipett potentialen och vila membranpotential i cellen.
2. GABA-aktiverade kanaler i Inside-Out konfiguration. När i cellen-anslutna läge att försiktigt lyfta upp din pipett och flytta den åt sidan och bort från skiva med hjälp av fina rörelser micromanipulators. Du har nu en inifrån och ut plåster och kan spela i Inside-Out-läge.
   Du spelar in från plåstret av membran som omges av din pipett (se bild. 1B). Som i cellen-anslutna läge duhar GABA i pipetten lösningen för att aktivera kanalerna. Men, kan läkemedel som korsar membranet som bensodiazepiner, barbiturater, propofol etc. tillämpas i badet lösningen eftersom de kommer att kunna passera in i pipetten och modulera kanaler [14]. Plåstret potentiella = - pipett potential och eftersom det inte finns någon vila membranpotential överdrog som i den cell-anslutna läge är plåster som är lika med-pipett potentiella t.ex. om du ställer innehavet potential i PClamp till -40 mV sedan plåstret Potentialen är exakt 40 mV.
   Fördelen med insidan ut konfigurationen är att man kan använda droger eller enzymer för att den inre membran ytan och undersöka om det påverkar kanalen egenskaper. Kraften att göra inifrån och ut plåster gäller inte membranet miljön i kanalen gör bildandet av denna lurade plåster konfiguration potentiellt mer skonsam för kanalen komplicerat än när utomhustemperaturen ut patch bildas (se nedan) .
3. GABA-aktiverade kanaler i Outside-Out konfiguration. När i hela celler läge att försiktigt lyfta upp eller dra tillbaka pipetten med fina rörelser av dina mikromanipulator. Samtidigt titta på fönstret på din dator som visar plåstret egenskaper. När du drar pipetten bort från cellen ser du kapacitans transienter försvinner och du kommer återigen ha en GΩ tätning. Du har nu bildat en utanför-out patch och kan spela i Utanför ut-läge.
   På något sätt cellmembranet har förseglat över spetsen öppnandet av pipetten står på insidan av membranet pipetten interiören och den ursprungliga utsidan av membranet står inför inspelningen kammare (bild 1B). GABA och andra droger som skall undersökas är nu löst i badet lösningen. Plåstret potentiella = pipett potentiella precis som i helcells-läge, t.ex. om du ställer innehavet potential i PClamp till 40 mV sedan plåstret potentialen är exakt 40 mV.
   Fördelarna med utsidan ut-läge är att du vet exakt vad din membran potential och som membranet ursprungliga utanför står den experimentella avdelningen, läkemedel som ska användas kan upplösas i badet lösning och lätt appliceras på och tvättade bort kanaler. Nackdelarna är att du inte längre kan ha knutna till kanalen intracellulära och även transmembrane proteiner och faktorer som kan behövas för fullständig kanalen fungerar som membranet hade att försegla-over och en del molekyler kan ha gått förlorade eller den lokala membranet miljön förvrängd i processen. Men tillsammans de olika plåster konfigurationer gör dissekering av kanalen egenskaper på molekylär nivå som inte är möjligt med någon annan metod i dag.

7. Analysera resultat:

Den enda kanal och helcells-strömmar analyseras med PClamp programvaran. För analyser av synaptiska händelser som vi använder Synaptosoft (GA, USA) eller AXOGraph (Sydney, Australien).

8. Representativa resultat:

Fig.. 2A visar en kanal strömmar aktiveras av 20 nm GABA koncentrationen i en cell-anslutna patch i dentate gyrus granule neuron. Den fördröjning av aktivering av kanalens maximala ledningsförmågan var 2 minuter och 38 sekunder och den maximala konduktans var 44 pS ^15. Plåstret har depolarized med 40 mV. Fig.. 2B visar exempel på hel-cellspänning-clamp ström poster från råtta hippocampus neuroner som identifierar tonic och phasic strömmar. Den GABAA antagonist SR95531 hämmar både extrasynaptic-(tonic) och den synaptiska-genererade (phasic) GABA-aktiverade strömmar. Vi tillämpade GABAA antagonisten SR95531 (100 M) till (Ba) dentate gyrus neuron och (Bb) insulin behandlad CA1 pyramidal neuron avslöjar tonic aktuella med förskjutning i baslinjen nuvarande framkallas av SR95531 blockera extrasynaptic kanaler (Ba, b) och försvinnandet av synaptiska strömmar när SR95531 blockerar synaptiska kanaler (Bb). Enligt basala tillstånd CA1 pyramidala nervceller inte har tonic GABA-aktiverade strömmar ⁶ men när nervceller utsätts för fysiologiska koncentrationer av insulin ⁴ GABA-aktiverade tonic strömmar utvecklas.

Figur 1A. Rat hippocampus hjärnan skiva, identifierade regioner CA1 och CA3 pyramidal lager cellen och dentate gyrus (DG) granulat cellager. B. Schematisk patch-clamp konfigurationer.

Figur 2A. Singel-kanalen strömmar aktiveras av 20 nm GABA i en cell-ansluten plåster på dentate gyrus granule cell i en råtta hippocampus hjärna skiva. Holding potential depolarized 40 mV (pipett potentiella = -40 mV). Stjärnan (*, 1 ^m nuvarande spår) identifierar varifrån strömmar som visas på snabbare tid skala (2nd nuvarande spår) togs från. B. helcells-strömmar in i råtta hippocampus hjärnan skiva i a. dentate gyrus granulat cell och b. CA1 pyramidala neuron i spännings-clamp läget på anläggningen potential -60 mV. För CA1 experiment, skivor inkuberades i 1 nM insulin för 2 timmar i rumstemperatur innan strömmar har registrerats.

Discussion

Hela-cells nuvarande representerar ensemble som alstras av aktiva kanaler i cellen. De specifika farmakologi och klorid permeabilitet GABAA kanalerna gör det möjligt att identifiera strömmar i samband med dessa kanaler. Den övergående natur aktivering av synaptiska kanaler och tonic aktivering av extrasynaptic kanaler gör det lätt att skilja mellan dessa två populationer av GABAA kanaler som uttrycks i ett neuron. Kan dock bara med en kanal inspelningar en studie den kinetiska egenskaper kanalen molekyler som genererar tonic strömmar. Till skillnad från synaptiska kanaler som aktiveras inom 100 ìs, är de tonic GABAA kanalerna aktiveras med en fördröjning i storleksordningen minuter från tiden GABA används ^{4,7,15,16,17,18.} Detta försenade aktivering av kanalerna resulterar i att många kanalen egenskaper kan inte studeras med helcells-inspelningar. Vid en kanal nivå de olika sub-populationer av GABAA kanaler kan identifieras utifrån olika funktionella och farmakologiska egenskaper. Således, genom att ta en fördel av vad de olika patch-clamp konfigurationer har att erbjuda, är det möjligt att i detalj studera de molekylära funktion och farmakologi av GABA-aktiverade kanaler som genererar tonic och synaptic strömmar i nervceller.

Materials

Several patch-clamp hardware and software systems are available and they all operate using the same basic principles. In our laboratory we use the Axoclamp amplifiers and the PClamp software (Molecular Devices, USA) to record and analyze our experiments. Another popular brand is HEKA amplifiers and software (HEKA Elektronik , Germany) Microforge: Narishige MF-830 (Japan); Vibrotome: e.g. Leica VT1200S (Germany) or Campden Instruments vibrotome (UK); Microscope: Nikon Eclipse E600FN; Water bath; Micromanipulators: custom made and Narishige micromanipulators (Japan); Puller: DMZ-universal (Germany) or Narishige PC-10 (Japan). Electrode glass: GC150F-15 (Harvard Apparatus, UK).