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Medicine

Procedimento de punção cecal Ligadura

doi: 10.3791/2860 Published: May 7, 2011

Summary

O modelo do rato de ligadura e punção cecal como uma ferramenta valiosa para o estudo da sepse humana.

Abstract

Sepse humana é caracterizada por um conjunto de reações sistêmicas em resposta à infecção intensivo e massivo que não conseguiu ser contido localmente pelo anfitrião. Atualmente, ocupa o sepse entre os dez maiores causas de mortalidade nas unidades de terapia intensiva EUA 1. Durante a sepse, há duas fases estabelecidas hemodinâmicas que podem se sobrepor. A fase inicial (hiperdinâmico) é definido como uma produção maciça de citocinas pró-inflamatórias e espécies reativas de oxigênio por macrófagos e neutrófilos, que afeta a permeabilidade vascular (levando à hipotensão), a função cardíaca e induz a alterações metabólicas, culminando com necrose de tecidos e falência de órgãos. Consequentemente, a causa mais comum de mortalidade é lesão renal aguda. A segunda fase (hipodinâmicos) é um processo anti-inflamatório envolvendo apresentação de antígenos alterados monócitos, diminuição da proliferação de linfócitos e função e aumento da apoptose. Este estado conhecido como imunossupressão ou depressão imunológica aumenta consideravelmente o risco de infecções nocosomial e, finalmente, a morte. Os mecanismos destes processos fisiopatológicos não estão bem caracterizados. Porque ambas as fases da sepse pode causar danos irreversíveis e irreparáveis, é essencial para determinar o estado imunológico e fisiológicas do paciente. Esta é a principal razão pela qual muitas drogas terapêuticas falharam. A mesma droga dada em diferentes estágios de sepse pode ser terapêutico ou de outra forma prejudicial ou não têm nenhum efeito 2,3. Para entender sepse em vários níveis é fundamental para ter um modelo animal adequado e abrangente, que reproduz o curso clínico da doença. É importante caracterizar os mecanismos fisiopatológicos que ocorrem durante a sepse e controlar as condições do modelo para testar potenciais agentes terapêuticos.

Para estudar a etiologia da sepse humana pesquisadores desenvolveram diferentes modelos animais. O modelo mais utilizado é a ligadura cecal clínicos e punção (CLP). O modelo CLP consiste na perfuração do ceco permitindo a liberação de material fecal na cavidade peritoneal para gerar uma resposta exacerbada imune induzida por infecção polimicrobiana. Este modelo cumpre a condição humana que é clinicamente relevante. Como em humanos, ratos que passam por CLP com reposição volêmica mostram a fase (início), primeiro hiperdinâmica que com o tempo progride para a fase (final) segundo hipodinâmicos. Além disso, o perfil de citocinas é semelhante ao observado na sepse humana, onde há aumento da apoptose de linfócitos (revisto em 4,5). Devido aos mecanismos de múltiplas e sobrepostas envolvidos na sepse, os pesquisadores precisam de um modelo adequado de gravidade da sepse controlada a fim de obter resultados consistentes e reprodutíveis.

Protocol

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1. Ligadura cecal e punção como um modelo de camundongo para Sepsis Humanos

Para este procedimento C57BL / 6 ratos (7-9 semanas de idade) são utilizados.

  1. Anestesiar o rato pela injeção intraperitoneal de uma solução de 1:1 de quetamina (75mg/kg) e xilazina (15mg/kg). Como referência, injetar 30 mL da solução de 1:01 em um rato pesando 20 gramas. Alternativamente, os camundongos podem ser anestesiados com isoflurano inalado através de um vaporizador anestésico.
  2. Raspar o abdome do rato e desinfectar área pela solução betadine primeira aplicação seguido por limpeza com uma gaze com álcool 70% (número 1 na seqüência imagem abaixo). Clorexidina pode ser utilizada como um anti-séptico alternativa. Opcional: uma cortina estéril pode ser usada para manter a área limpa.
  3. Sob condições assépticas, uma prática 1 a 2 cm laparotomia mediana e expor o ceco com intestino adjacente (2 e 3).
  4. O ceco é firmemente ligada com um fio de seda 6.0 (6-0 PROLENE, 8680G, Ethicon) em sua base abaixo da válvula íleo-cecal, e é perfurado uma ou duas vezes com uma agulha de calibre 19 (4 e 5) na mesma lado do ceco. Por favor, note que o comprimento do ceco ligada definido como a distância entre a extremidade distal do ceco ao ponto de ligadura vai determinar o grau de severidade. A distância de> um centímetro produz sepse de alta qualidade, enquanto uma distância de 1 cm ≤ produz meio-de-baixo grau sepse. Observe também que utilizando o método de perfuração cecal mostrado aqui é diferente do padrão através de e através da técnica de punção (introdução de uma agulha através do ceco). Ambos os métodos de produzir o resultado confiável sepse mesmo. No entanto, uma desvantagem da técnica de ponta a ponta é que não facilita controlar a quantidade de fezes extrudados quando o ceco é espremido.
  5. O ceco é, então, pressiona suavemente para expulsar uma pequena quantidade de fezes dos locais de perfuração (6). O ceco é retornado para a cavidade peritoneal e peritônio é fechado com 6,0 suturas de seda. (7).
  6. A pele é fechada com grampos Reflex 7mm (RS-9258, Instrumentos Cirúrgicos Roboz) ou grampos de sutura Michel (7 mm, RS-9270) (8).
  7. Ressuscitar ratos através da injeção por via subcutânea 1 ml de solução pré-aquecido 0,9% com uma agulha de 25G. Esta medida fluidoterapia irá induzir a fase hiperdinâmica da sepse. Este passo crítico é descrito mais adiante na seção de discussão.
  8. Opcional: Inject por via subcutânea buprenorfina (0,05 mg / kg de peso corporal) ou tramadol (20mg/kg peso corporal) para analgesia pós-operatória. Ser advertidos de que estes opiáceos pode suprimir a respiração e locomoção e estes efeitos podem ser interpretados como sinais de sepsis.
  9. Os animais são colocados temporariamente em uma almofada de aquecimento ou, alternativamente, voltou imediatamente para uma gaiola com a exposição a uma lâmpada de aquecimento infravermelho de 150W, até que se recuperar da anestesia. O tempo de recuperação é de 30 min a 1 hora.
  10. Fornecer acesso livre à comida e água (hidrogel) colocado no fundo da gaiola.
  11. Ratos são monitorados a cada 12 horas para a sobrevivência de uma a duas semanas ou eutanásia em momentos diferentes para análise de parâmetros diferentes.

Como controle para o projeto experimental, os animais sham iria seguir a técnica de laparotomia sem ligadura e punção.
Seis a 12 horas após o procedimento cirúrgico os ratos se tornarão letárgicos e desenvolver febre, piloereção, diarréia, encolhendo-se, mal-estar e, todos os sintomas de sepse. Camundongos com sepse grave muito mal consegue se mover antes da morte e exibem uma diminuição drástica da temperatura corporal. Neste ratos etapa deve ser sacrificados para evitar a dor e sofrimento prolongado.

Figura 0

2. Mais comuns Parâmetros Analisados

Para avaliar o resultado do procedimento, diversos parâmetros podem ser analisados ​​em órgãos, extratos celulares ou fluidos corporais. Amostras podem ser coletadas em momentos diferentes de 3 horas para uma semana após o procedimento cirúrgico.

  1. Sobrevivência camundongos.
  2. Citocinas e quimiocinas na cavidade, soro peritoneal e extratos de órgãos.
    1. Interleucina-6: Produzido e lançado por monócitos, células dendríticas, macrófagos, células B, células T, granulócitos, mastócitos e tipos de células muito mais. Ela desempenha um papel importante na reação de fase aguda e inflamação.
    2. Fator de necrose tumoral α: Pleiotrophic citocina que desempenha um papel central na inflamação e apoptose. Produzido por monócitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas e fibroblastos.
    3. nterleukin-1β: Produzido por monócitos, células NK, células dendríticas, células B e células T. Induz febre e síntese de proteínas de fase aguda.
    4. Interleucina 10: Promove a absorção fagocíticas e Th2, mas suprime antigen apresentação e respostas Th1 pró-inflamatórias.
    5. Interleucina 10: Promove a absorção fagocíticas e Th2, mas suprime a apresentação de antígenos e respostas Th1 pró-inflamatórias.
    6. Monócitos quimiotáticos proteína-1 (também conhecido como CCL2): Recrutas monócitos, células T de memória e células dendríticas aos locais de lesão tecidual e infecção.
    7. KC (CXCL1): Produzido por macrófagos e células endoteliais. KC rato é um atrativo de neutrófilos potente e ativador.
    8. RANTES: A quimiotática de monócitos. Pode chemoattract CD4 unstimulated + / CD45RO + células de memória T CD4 e estimulado + e CD8 + T com nd ve e fenótipos de memória.
    9. Interferon-γ: Secretada por células Th1, células T citotóxicas, células dendríticas e natural killer (NK). Aumenta a apresentação de antígenos e atividade lítica de macrófagos e suprime a atividade das células Th2. Promove a adesão e de ligação necessários para a migração de leucócitos e promove a atividade das células NK.
    10. Alta mobilidade do grupo B-1 de proteínas: No monócitos é um fator nuclear kappa B ativador pela ligação ao receptor celular para produtos de glicação antecedência final (RAGE), ativando a liberação de mediadores pró-inflamatórios na fase tardia da sepse.
  3. Determinação mieloperoxidase em órgãos como medida de infiltração de neutrófilos. Mieloperoxidase (MPO) é uma enzima peroxidase presente em abundância na maioria dos granulócitos neutrófilos. É uma proteína lisossomal armazenado em grânulos azurófilos dos neutrófilos. MPO tem um pigmento heme, que faz com que sua cor verde nas secreções ricas em neutrófilos, como o pus e algumas formas de muco.
  4. Bactérias carga em órgãos e sangue, medida como o número de unidades formadoras de colônia por mililitro.

3. Resultados representante

O procedimento CLP foi realizada inicialmente em camundongos C57BL / 6. Testamos vários parâmetros para modular a gravidade da sepse, alterando o comprimento da ligação e da espessura da agulha, conforme mostrado nas Figuras 1 e 2. Entre esses dois fatores, o comprimento da ligadura parece ser mais eficaz do que a espessura da agulha para alterar a sobrevivência por cento. Conforme mostrado na Figura 1, aumentando o comprimento da ligação por mais de um centímetro provoca um aumento da mortalidade de 100% em comparação com camundongos com uma ligadura de ≤ 1cm. Aumentando a espessura da agulha também diminuiu a sobrevivência por cento de 100% (com uma agulha 22G) para 55% (usando uma agulha 19G) com dois furos. Também testamos o efeito do CLP em camundongos C57BL / 6 e 129SvJ ratos para determinar se diferentes linhagens de camundongos mostrar susceptibilidade semelhantes ou distintas para CLP-induzida a sepse. A Figura 3 mostra que, nas mesmas condições, os ratos foram 129SvJ mais suscetíveis à infecção do que C57BL / 6, indicado por uma porcentagem de mortalidade aumentou.

Figura 1
Figura 1. Efeito do comprimento da ligadura do ceco na sobrevivência animal. CLP foi realizada em camundongos C57BL / 6 com dois diferentes comprimentos de ligadura cecal. Este único parâmetro afeta drasticamente a sobrevida do animal desde que todos os animais do grupo com uma área de ligação mais do que 1 cm morreu em menos de três dias quando comparados com um grupo de animais com uma área de ligadura de 1 cm aprox. (N = 8).

Figura 2
Figura 2. Influência da espessura da agulha sobre a sobrevivência. CLP foi realizada em camundongos C57BL / 6 com dois tamanhos diferentes da agulha, 19G e 22G. Camundongos com o ceco perfurado com uma agulha de 19G mostrou uma sobrevida de 55-60%. Em contraste, os ratos com o ceco perfurado com uma agulha de 22G mostrou 100% de sobrevivência, embora eles experimentaram sintomas típicos de inflamação durante os primeiros 3-4 dias, o que desapareceu depois de 4 dias (n = 8).

Figura 3
Figura 3. Comparação da susceptibilidade a sepse entre duas linhagens de camundongos diferentes. O modelo CLP foi realizada em 129SvJ e C57BL / 6, nas mesmas condições. No final do período de avaliação por cento a sobrevivência da cepa 129SvJ foi de 25% menos do que na cepa C57BL / 6, indicando uma maior susceptibilidade à inflamação induzida por infecção polimicrobiana. (N = 6).

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Discussion

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Aqui nós mostramos em detalhes como realizar o modelo CLP em camundongos e modular o grau de severidade.

Comparado a outros modelos animais de sepse, CLP pode ser realizado em qualquer tensão do rato de diferentes idades e sexo. É um procedimento relativamente fácil e barato cirúrgico. Neste modelo, o grau de gravidade tem um impacto direto sobre a porcentagem de sobrevivência. O comprimento da ligação, a espessura da agulha e do número de punções são parâmetros que podem ser controlados para modular a gravidade / mortalidade da CLP. Conseqüentemente, para obter mudanças dramáticas em termos de gravidade CLP, o usuário pode alterar o comprimento da ligadura, enquanto ligeira modificação na gravidade pode ser introduzido, ajustando a espessura da agulha.

Outros parâmetros importantes que poderiam introduzir uma variabilidade substancial nos resultados do CLP são a tensão do rato 6,7, sexo 8 e idade do animal 9. A este respeito, mostram que linhagens de camundongos de exibição diferente suscetibilidades distintas para o procedimento quando realizado sob as mesmas condições. De fato, as diferenças nos níveis plasmáticos das citocinas e danos nos tecidos foram detectados entre linhagens de camundongos diferentes 10-12. Inclusão de reposição volêmica e administração de analgésicos são fatores que podem introduzir uma variabilidade significativa no modelo CLP. Por exemplo, reposição volêmica aumenta taxa de sobrevivência, possivelmente diminuindo a produção de início de citocinas pró-inflamatórias 11, 13, 14 mascarando os efeitos de potenciais intervenções terapêuticas. Em contraste, analgésicos narcóticos pode suprimir a respiração e na locomoção do animal e provocar um efeito irreversível não relacionada à sepse. Seu uso, portanto, pode influenciar a taxa de sobrevivência e função das células imunes 15.

Em conclusão, ao executar o modelo CLP em todas estas condições e os parâmetros técnicos devem ser cuidadosamente considerados, a fim de obter resultados reprodutíveis e consistentes. Portanto, um profundo conhecimento e domínio do procedimento é absolutamente necessário para executar o modelo CLP com precisão.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado por uma concessão do Departamento de Saúde da Pensilvânia.
Dr. Miguel Garcia Toscano foi um pós-doutorado na Universidade de Temple, financiado pela Fundação Martin Alfonso Escudero durante este estudo.
Queremos agradecer Iliya Yordanov e Kevin Kotredes para a confecção do vídeo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Ketaset 0856-2013-01
Xylazine AnaSed NADA# 139-236
Insulin syringe 29G Excel Scientific 26028
Silk suture, 6-0 PROLENE Ethicon Inc. 8680G
19G and 25G Needle BD Biosciences 305186
Shaver General Supply General supply
Infrared Heating lamp General Supply General supply
Michel wound clips 7mm Roboz Surgical Instruments Co. RS-9270
Ear Loop Mask Fisher Scientific 19-130-4181
Dissection scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS-6702
Betadine solution VWR international 63410-992
Surgical forceps Roboz Surgical Instruments Co. RS-5135
70% Isopropyl alcohol pad Fisher Scientific 22-031-350
Buprenorphine Bedford Laboratories 55390-100-10
Tramadol Sigma-Aldrich 42965

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References

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Toscano, M. G., Ganea, D., Gamero, A. M. Cecal Ligation Puncture Procedure. J. Vis. Exp. (51), e2860, doi:10.3791/2860 (2011).More

Toscano, M. G., Ganea, D., Gamero, A. M. Cecal Ligation Puncture Procedure. J. Vis. Exp. (51), e2860, doi:10.3791/2860 (2011).

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