Biology

Barcoded खमीर पुस्तकालय के प्रतियोगी जीनोमिक स्क्रीन

Published: August 11, 2011 doi: 10.3791/2864

Andrew M. Smith*^1,2, Tanja Durbic*^2,3, Julia Oh*⁴, Malene Urbanus^1,2, Michael Proctor⁵, Lawrence E. Heisler^2,3, Guri Giaever^2,6, Corey Nislow^1,2,3

¹Banting and Best Department of Medical Research and Department of Molecular Genetics, University of Toronto, ²Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto, ³Donnelly Sequencing Centre, University of Toronto, ⁴Genetics and Molecular Biology Branch, National Human Genome Research Institute, NIH, ⁵Stanford Genome Technology Center, Stanford School of Medicine, Stanford University, ⁶Department of Pharmaceutical Sciences, University of Toronto

* These authors contributed equally

Summary

हम व्यापक, निष्पक्ष विस्तृत जीनोम स्क्रीन विकसित किया है जीन दवा और जीन पर्यावरण बातचीत को समझने की. इन उत्परिवर्ती संग्रह स्क्रीनिंग के लिए तरीके प्रस्तुत कर रहे हैं.

Abstract

अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में प्रगति के पुण्य से, हम नया जीनोम अनुक्रम के लिए उपयोग लगभग दैनिक. इन अग्रिमों की गति में तेजी है, अधिक से अधिक गहराई और चौड़ाई का वादा किया. इन असाधारण अग्रिमों के प्रकाश में, तेज, समानांतर तरीकों के लिए जीन समारोह को परिभाषित करने के लिए की जरूरत कभी अधिक महत्वपूर्ण हो जाता है. जीनोम चौड़ा yeasts और ई. में विलोपन म्यूटेंट के संग्रह कोलाई जीन समारोह के कार्यात्मक विशेषताओं के लिए workhorses के रूप में सेवा की है, लेकिन इस दृष्टिकोण परिमाप्य नहीं है, वर्तमान जीन विलोपन दृष्टिकोण प्रत्येक जीन है कि एक को नष्ट कर दिया और सत्यापित जीनोम शामिल हजारों की आवश्यकता होती है. के बाद ही यह काम पूरा हो गया है हम उच्च throughput phenotyping का पीछा कर सकते हैं. पिछले दशक के दौरान, हमारी प्रयोगशाला प्रतिस्पर्धी, छोटी, उच्च throughput जीनोम चौड़ा assays कि समानांतर में किया जा सकता है है की एक पोर्टफोलियो परिष्कृत किया गया है. यह parallelization डीएनए 'टैग', या एक उत्परिवर्ती में 'बारकोड' के शामिल किए जाने की वजह से संभव है, और उत्परिवर्तन के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में सेवारत बारकोड के साथ एक बारकोड बहुतायत को मापने के लिए उत्परिवर्ती फिटनेस का आकलन कर सकते हैं. इस अध्ययन में, हम डीएनए अनुक्रम और barcoded उत्परिवर्ती संग्रह के बीच की खाई को भरने की तलाश है. यह पूरा करने के लिए हम एक संयुक्त transposon दृष्टिकोण व्यवधान बारकोडिंग कि खुल समानांतर बारकोड assays के नए अनुक्रम, लेकिन खराब रोगाणुओं विशेषता परिचय. इस दृष्टिकोण का वर्णन करने के लिए हम एक नई Candida albicans barcoded व्यवधान संग्रह मौजूद है और वर्णन कैसे दोनों माइक्रोएरे आधारित है और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण आधारित प्लेटफॉर्म 10,000 इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है - एक ही प्रयोग में +१०००००० जीन जीन और दवा जीन बातचीत.

Protocol

1. पृष्ठभूमि जानकारी

म्यूटेंट कि बारकोड टैग ले उत्पन्न करने के लिए वहाँ कई तरीके हैं. वर्तमान सोने के मानक खमीर पीटकर (YKO) प्रयोगशालाओं के एक संघ द्वारा बनाई गई और 2002 में ¹ पूरा संग्रह है. चूंकि मूल YKO पेश किया गया था, अन्य खमीर संग्रह किया गया है उत्पन्न, अलग तनाव की पृष्ठभूमि में अधिक अभिव्यक्ति constructs का उपयोग कर, और ई. जैसे अन्य रोगाणुओं में ² कोलाई. समानांतर में, barcoded shRNA पुस्तकालयों बनाने के प्रयास तेजी से आगे बढ़ रहा है, और वास्तव में, इन स्तनधारी संग्रह के लिए डिजाइन सिद्धांतों के कई खमीर से अपनाया गया है. प्रदर्शन कैसे barcoded transposons व्यवस्थित उत्परिवर्ती संग्रह बनाने के लिए एक तेजी से, व्यापक रूप से लागू की रणनीति किया जा सकता है, हम एक संग्रह है हम हाल ही में मानव कवक रोगज़नक़, Candida albicans में बनाया पर ध्यान केंद्रित. Candida पर हमारे काम एस में बारकोड स्क्रीन की सफलता के आधार पर किया गया था cerevisiae, और यहाँ एक उदाहरण जीव के रूप में प्रयोग किया जाता है. नमूना प्रोटोकॉल, कर सकते हैं मामूली संशोधनों के साथ किसी भी जीव है कि निलंबन संस्कृति में उगाया जा सकता है स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा. क्योंकि कुछ जीवों परिवर्तन की अपेक्षित उच्च दरों और कुशल mitotic पुनर्संयोजन के लिए एकदम सही विलोपन म्यूटेंट बनाने की जरूरत है, तदनुसार हम एक प्रोटोकॉल है कि इन विट्रो में transposon mutagenesis का उपयोग करता है के लिए एक जीनोमिक डीएनए पुस्तकालय mutagenize है विकसित की है, ^और तब Candida albicans के 3 में इन barcoded जीनोमिक टुकड़े तब्दील ^4,. जीनोम में मूल YKO संग्रह और जीन नेटवर्क ^5-8, जीनोम चौड़ा ⁹ haploinsufficiency, दवा लक्ष्य और ^10,11 कार्रवाई के तंत्र की प्रकृति पर मौलिक खोजों में अपनी भूमिका, और सभी जीनों की अनिवार्यता की सफलता से प्रेरित होकर ¹² हम अन्य रोगाणुओं के लिए इस दृष्टिकोण का विस्तार आशा अत्यंत उपयोगी हो जाएगा.

नीचे प्रोटोकॉल मानता है कि वांछित उत्परिवर्ती संग्रह (जैसे YKO या Candida albicans के विघटन संग्रह) बनाया गया है और व्यक्तिगत संग्रहीत उपभेदों के रूप में उपलब्ध है . तनाव के निर्माण के एक विस्तृत वर्णन के ^लिए 1,13,14 देखें .

2. एक ही पूल में व्यक्तिगत म्यूटेंट का मिश्रण

जमा सेल aliquots (-80 ° C पर अनिश्चित काल के संग्रहीत किया जा सकता है) को उत्पन्न करने के लिए एक सप्ताह की अनुमति दें.
हित के उपभेदों के लिए जमे हुए ग्लिसरॉल शेयरों पूरी तरह से पहले गला लें, लेकिन कोशिकाओं 2hrs> thawed रहना नहीं है.
एक 96 अच्छी तरह से पिन उपकरण जीवाणुरहित, किसी भी शेष कोशिकाओं, 70% इथेनॉल स्नान में 2 dips (जैसे विंदुक टिप बॉक्स lids), पिन उपकरण लौ और 1 मिनट के लिए शांत द्वारा पीछा हटाने के लिए पानी में पिन उपकरण डुबकी. लौ करने के लिए देखभाल पिन उपकरण इथेनॉल स्नान से दूर ले लो. इथेनॉल स्नान के स्तर पानी के स्नान में स्तर को पार करने के लिए सुनिश्चित करें सभी ले कोशिकाओं flamed और हटा रहे हैं चाहिए. हर 4-6 pinnings पानी बदलें.
एक thawed प्लेट 96 अच्छी तरह ज़ुल्फ़ में बाँझ 96 अच्छी तरह से पिन उपकरण धीरे डालें और एक Nunc ओमनी उचित एंटीबायोटिक सहित YPD - अगर युक्त ट्रे कोशिकाओं हस्तांतरण. कालोनियों आगे बढ़ें जब तक वे 30 पर अधिकतम आकार तक पहुँचने डिग्री सेल्सियस (2 - 3 डी). प्लेटों के संरक्षण के लिए, हम यह सबसे ~ 384 उपभेदों के साथ एक एकल ओमनी - ट्रे पर चार 96 अच्छी तरह प्लेटें को मजबूत करने के लिए उपयोगी पाते हैं.
बाद कालोनियों हो गए हैं, किसी भी गुम या धीमी गति से बढ़ रही उपभेदों ध्यान दें और इन पर Repin ~ उपभेदों के बाकी के रूप में सेल जन 2X.
एक सूक्ष्म जीव विज्ञान (लौ और बाँझ labware के साथ वातावरण में कार्य करना, 5-10 मिलीलीटर मीडिया के साथ बाढ़ की थाली, एक सेल स्प्रेडर के साथ 5 मिनट और resuspend कालोनियों के लिए सोख एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में लिक्विड प्लस कोशिकाओं डालो, और ग्लिसरॉल जोड़ने 15% या DMSO के लिए 7% (/ खंड खंड).
आयुध डिपो ₆₀₀ के पूल उपाय और 15% ग्लिसरॉल या DMSO के 7% से युक्त मीडिया के साथ 50 आयुध डिपो ₆₀₀ मिलीग्राम / के अंतिम एकाग्रता को समायोजित (मन्दन या centrifugation द्वारा).
पीसीआर पट्टी ट्यूबों और फ्रीज में 40 μl मात्रा में -80 पर विभाज्य ° सी.

3. प्रायोगिक पूल वृद्धि

इस प्रक्रिया चित्रा 1 में उल्लिखित है.

पिघलना बर्फ पर पूल aliquots (पीसीआर नलियों में). यदि रोबोटिक्स का उपयोग नहीं, तो चरण 5 पर जाएँ.
तत्काल दवा या पसंद की शर्त के साथ मीडिया में पूल (gently!) पतला, 48 अच्छी तरह से एक थाली में 700 μl की कुल मात्रा में .०,६२५ _के 600 आयुध डिपो में inoculating . कम से कम एक थाली पर उपयुक्त विलायक नियंत्रण शामिल है. प्रयोगों है कि विकास के पाँच पीढ़ियों से परे का विस्तार (1 से अधिक अच्छी तरह से अर्थात्) के लिए, मीडिया या पसंद की शर्त के साथ सटे कुओं, लेकिन सं कोशिकाओं को भरने.
एक प्लास्टिक की थाली मुहर के साथ सील, अगर हालत एरोबिक विकास (उदाहरण के लिए, गैर उफानने योग्य कार्बन सूत्रों) की आवश्यकता है, पियर्स प्रत्येक अच्छी तरह से पक्ष की ओर सील झिल्ली में छेद करने के लिए एक 21 गेज सुई का उपयोग करें.
एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में आगे बढ़ें, के साथ एक प्रयोगात्मक determi 30 ° C पर मिलातेनेड मिलाते आहार (जैसे उच्चतम सेटिंग (या हिलनेवाला तापमान नियंत्रित), पढ़ने कुओं से कम 14 मिनट हिला, मिलाते हुए फिर से शुरू). सेल निलंबन के भाग रोबोट द्वारा काटा जा सकता है और यूज़र - डिफ़ाइंड पीढ़ी समय अंक, आमतौर पर 5, 10, 15 और विकास के 20 पीढ़ियों पर रोबोट डेक पर ठंड की थाली पर बचाया. (Http://med.stanford.edu/sgtc/technology/access.html, संपर्क विवरण सी. Nislow या जी Giaever के लिए).
मैनुअल सेल के विकास के लिए, एक प्रारंभिक 0.002 के ₆₀₀ आयुध डिपो में एक 250 मिलीलीटर संस्कृति फ्लास्क में एक 50 मिलीलीटर संस्कृति का टीका लगाना . 250 rpm पर 30 ° C पर हिलाएँ तक कोशिकाओं ~ विकास के 10 पीढ़ियों के लिए 2.0 के _{अंतिम} 600 आयुध डिपो (Saccharomyces या Candida के लिए) तक पहुँचने . विकास की अतिरिक्त पीढ़ियों एक ताजा फ्लास्क में 2.0 0.02 के लिए वापस एक OD600 पर गिराए कोशिकाओं द्वारा प्राप्त किया जा सकता है.
फसल काटने वाले प्रत्येक सुरक्षित लॉक microcentrifuge ट्यूबों में नमूना / समय बिंदु के लिए कोशिकाओं के कम से कम ~ 2 आयुध _डिपो 600 इकाइयों .

ध्यान दें: हमेशा एक प्रारंभिक सेल नमूना लेने के (अर्थात् एक "t0 समय बिंदु") पूल के 1-2 ₆₀₀ आयुध डिपो जोड़ने सीधे फ्रीजर aliquots से एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब और प्रसंस्करण के रूप में वर्णित किसी भी नव निर्मित पूल में प्रारंभिक तनाव प्रतिनिधित्व का आकलन नीचे.

4. जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण, पीसीआर और माइक्रोएरे संकरण या अनुक्रमण

2 ~ से ₆₀₀ आयुध डिपो Zymo अनुसंधान YeaStar किट के साथ निर्माता के निर्देशों के अनुसार कोशिकाओं के (मैं प्रोटोकॉल अगर खमीर डीएनए का उपयोग कर), या किसी अन्य उपयुक्त ब्याज के जीव (विशिष्ट तरीका मानक phenol / क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण शराब वर्षा के बाद काम करता है जीनोमिक डीएनए शुद्ध अच्छी तरह से विविध रोगाणुओं के लिए). YeaStar किट का उपयोग कर अगर, 0.1X ते के 300 μL के साथ डीएनए बजाय elute 1X ते 60 के प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट μL की. जीनोमिक डीएनए -80 डिग्री सेल्सियस पर अनिश्चित काल के संग्रहीत कर सकते हैं
33 μl DDH ₂ हे, 6 μl ₂ MgCl बिना 10X पीसीआर बफर, 3 μl 50 मिमी ₂ MgCl, 1.2 μl: प्रत्येक नमूने के लिए दो पीसीआर प्रतिक्रियाओं, uptags के लिए और एक downtags के लिए, के रूप में प्रतिक्रिया शर्तों के साथ सेट 10 मिमी dNTPs, 1.2 μl 50 अप सुक्ष्ममापी या नीचे प्राइमर मिश्रण, 0.6 μl 5 यू / μl Taq पोलीमरेज़, ~ 15 μl में 0.1 μg जीनोमिक डीएनए. कुल मात्रा 60 μl है. सी. 72 फिर ° 3min सी, और 4 पर पकड़ °, 94 ° C 3 मिनट, 94 के 30 चक्र ° 30 सी, 55 ° 30 सी, 72 ° सी 30: निम्नलिखित शर्तों के तहत Thermocycle परिणामस्वरूप एक जेल पर पीसीआर उत्पादों की जाँच करें, दोनों PCRs के लिए एक 60 बीपी उत्पाद संकरण और बारकोड अनुक्रमण के लिए amplicons) के लिए 130bp के लिए इस्तेमाल किया amplicons के लिए उम्मीद है. पीसीआर उत्पादों तो -80 ° अनिश्चित काल के सी पर संग्रहीत किया जा सकता है.
Prewarm संकरण ओवन के तापमान से 42 डिग्री सेल्सियस और उबलते पानी स्नान और बर्फ बाल्टी बर्फ पानी घोल युक्त सेट.
पूर्व गीला धीरे धीरे 120 μl 1X संकरण बफर के साथ भरने के द्वारा arrays.
42 में संकरण बफर में सेते डिग्री सेल्सियस और 10 मिनट के लिए 20 rpm.
नमूना प्रति संकरण मिश्रण, प्लस एक बफर के रूप में अतिरिक्त के 90 μl तैयार, के रूप में इस प्रकार है: 75 μl 2X संकरण बफर, 0.5 μl B213 नियंत्रण oligonucleotide (0.2 एफएम / μl), 12 μl मिश्रित oligonucleotides (12.5 बजे / μl), 3 μl ताला टॉप 0.5 मिलीलीटर ट्यूबों में 50X Denhardt) समाधान.
120 150 μL की कुल मात्रा के लिए μl संकरण मिश्रण करने के लिए 30 μl uptag पीसीआर और 30 μl downtag पीसीआर जोड़ें. दो मिनट कम से कम 2 मिनट के लिए और बर्फ के पानी में सेट के लिए उबाल लें. संक्षेप में ट्यूब से पहले स्पिन उपयोग करने के लिए.
बफर पूर्व - संकरण arrays से निकालें और 90 μl संकरण / पीसीआर मिश्रण जोड़ें. वाष्पीकरण को रोकने के लिए, सरणी gaskets के साथ एक स्पॉट कठिन को कवर. 42 पर 16 घंटे के लिए संकरण डिग्री सेल्सियस, 20 rpm.
हौसले से 600 नमूना प्रति μl बायोटिन लेबलिंग मिश्रण प्लस एक अतिरिक्त तैयार, के रूप में इस प्रकार है: 180 μl 20X SSPE, 12 μl 50X है Denhardt, 6 μl 1% 20 बीच (/ खंड खंड), 1 μl 1 मिलीग्राम / एमएल streptavidin-phycoerythrin, 401 μl DDH ₂ ओ अंधेरे में स्टोर सभी streptavidin पीई नमूने. 2 मिलीलीटर ट्यूबों में 600 μl विभाज्य. चिप्स से कठिन स्पॉट निकालें.
धीरे धीरे arrays से विंदुक द्वारा संकरण मिश्रण और हटाने के 120 μl धो ए Affymetrix fluidics स्टेशन प्रधानमंत्री के साथ प्रोटीन भरने.
निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक Affymetrix fluidics स्टेशन का उपयोग करते हुए, निम्नलिखित संशोधनों के साथ "जीन Flex_Sv3_450" प्रोटोकॉल का उपयोग सरणियों धो: 1 धो के साथ एक अतिरिक्त कदम एक धुंधला (1 चक्र, दो घोला जा सकता है) पहले, बी तापमान 42 डिग्री के बजाय सी धो 40 डिग्री सेल्सियस, 42 पर दाग ° सी बजाय 25 डिग्री सेल्सियस यह भी संभव है पोस्ट संकरण धोने, बायोटिन धुंधला, और पोस्ट धुंधला धोने मैन्युअल प्रदर्शन (396 पृ 15 संदर्भ में देखें). Fluidics आपरेशन के बाद, fluidics स्टेशन "SHUTDOWN_450" प्रोटोकॉल चलाते हैं.
धोने के बाद, सुनिश्चित करने के लिए, कोई हवाई बुलबुले मौजूद हैं. यदि आवश्यक 90 μl धो एक विंदुक और धीरे धीरे जोड़ने जब तक बुलबुले गायब. अगर वहाँ किसी भी निशान या एस.एम.सरणी सतह पर udges, isopropanol के साथ कांच की खिड़की साफ करने के लिए और एक प्रकार का वृक्ष मुक्त ऊतक. Gaskets / septa से अधिक ताजा कठिन स्पॉट लागू करें और जगह स्कैनर में arrays.
560 एनएम के एक उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य में एक Affymetrix GeneArray स्कैनर में स्कैन करें.

5. ऐरे विश्लेषण (एक उदाहरण प्राप्त Candida albicans के विघटन संग्रह के प्रयोग के लिए देखें चित्र 2)

ग़ैर मास्किंग: क्योंकि Affymetrix tag4 सरणी शामिल हैं 5 प्रत्येक बारकोड पूरक के replicates बेतरतीब ढंग से किसी भी बारकोड जांच है कि replicates और नकाबपोश हो सकता है त्याग से भटक छितरी हुई है. ऐसा करने के लिए, प्रत्येक सरणी सुविधा के लिए है कि 4 अन्य की तुलना में एक ग़ैर इसके संकेत पर आधारित प्रतीत होता है इस सुविधा का replicates है, हमारी पहली सॉफ्टवेयर 5 सुविधाओं कि संदिग्ध ग़ैर के चारों ओर की जाँच संदिग्ध के साथ 25 सुविधाओं के एक मैट्रिक्स का निर्माण केंद्र में सुविधा. यदि> इस क्षेत्र में 13/25 जांच को अधिक से अधिक 10% द्वारा अपने व्यक्तिगत उनके छंटनी को दोहराने के मतलब के प्रत्येक (मध्य प्रतिकृति तीन का मतलब, उच्चतम और निम्नतम प्रतिकृति को छोड़कर) से अलग, यह जांच तो आगे के विश्लेषण के से खारिज कर दिया है. क्योंकि ऐसे outliers सबसे अक्सर के बाद संकरण धोने विसंगतियों का परिणाम हैं, हम विस्तार या "पैड" क्षेत्र संदिग्ध जांच युक्त. एक 5 - जांच त्रिज्या के भीतर सभी जांच सहित पैड ऐसी जांच, के रूप में द्वारा परिभाषित _((1-x x 2) ⁺ 2 _{(1 y-y ²⁾} ²⁾ साढ़े 6 _{<जहां} x _{1, 2} एक्स _1, y, और ₂ y दो सुविधाओं के लिए एक्स और y निर्देशांक हैं. अंत में, जिसके लिए सुविधा पिक्सल के मानक विचलन (Affymetrix arrays के लिए. Cel फ़ाइल में शामिल) / सुविधा पिक्सल मतलब सुविधाओं त्यागें. Outliers हटाने के बाद, शेष सभी के लिए औसत तीव्रता मूल्यों replicates.
व्यर्थ टैग हटाना कम तीव्रता मूल्यों के साथ टैग: गरीब गुणवत्ता परिणाम देने के लिए और हटाया जाना चाहिए. इन कम तीव्रता जांच के लिए एक अपवर्जन cutoff के इस प्रकार के रूप में गणना की जा सकती है:
1. सरणियों के किसी भी जोड़ी उपचार नियंत्रण के लिए, प्रत्येक टैग के लिए लॉग इन ₂ ((मैं _{छ ग} ख) / (मैं _{छ टी} बी)) की गणना, जहाँ मैं _ग नियंत्रण तीव्रता है, मैं _टी उपचार तीव्रता है, और ख _छ असाइन नहीं की गई टैग जांच का मतलब तीव्रता है.
2. Uptag और तनाव से downtag अनुपात जोड़ी और प्रत्येक टैग जोड़ी के लिए, दो नमूनों में दो टैग के लिए कम से कम तीव्रता ले. इस न्यूनतम तीव्रता से अनुपात जोड़े के आधार पर क्रमबद्ध.
3. 50 रैंक अनुपात जोड़े पर एक स्लाइडिंग विंडो आकार का उपयोग करें, uptag और downtag खिड़की के भीतर अनुपात जोड़े के सहसंबंध की गणना. इसके अलावा पिछले चरण में गणना न्यूनतम तीव्रता के औसत की गणना.
4. 25 जोड़े द्वारा विंडो स्लाइड, और पिछले चरण दोहराएँ जब तक सभी जोड़ों को पार कर गया है.
5. सभी खिड़कियों के लिए सहसंबंध uptag downtag बनाम औसत न्यूनतम तीव्रता प्लॉट.
6. अंत में, एक तीव्रता दहलीज चुनते हैं, आम तौर पर हम तीव्रता मूल्य जहां सहसंबंध पहले अपने अधिकतम स्तर के 80% तक पहुँच का उपयोग करें. झंडा और आगे के विश्लेषण से निकालने के इस cutoff के नीचे किसी भी टैग.
संतृप्तता सुधार: क्योंकि बारकोड माइक्रोएरे पर प्रत्येक सुविधा संतृप्त हो सकता है, tag4 सरणी पर संकेत रैखिक टैग एकाग्रता के लिए संबंधित नहीं है. सही के लिए इस ^{संतृप्ति} 16 संदर्भ में वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए .
ऐरे सामान्य: प्रत्येक सरणी के लिए, uptags और downtags अलग मानक के अनुसार. सामान्य quantile uptags और बढ़ती तीव्रता के क्रम में downtags के लिए प्रत्येक सरणी से प्राप्त मान का रैंक. मतलब uptags और downtags के प्रत्येक सेट के लिए मानक के अनुसार करने के लिए, मतलब से विभाजित. सभी सरणियों का मतलब सामान्य एक दूसरे कदम के प्रत्येक सरणी का मतलब के लिए कच्चे डेटा बदलने निम्नलिखित है.
नियंत्रण उपचार की तुलना के लिए संवेदनशीलता स्कोर गिना: लॉग संवेदनशीलता का एक मीट्रिक के _रूप में 2 के अनुपात का उपयोग करें: प्रत्येक तनाव के लिए, _लॉग इन 2 _((μ g बो -) / _(μ जी टी बी)) की गणना, _जहां μ ग μ _टी, नियंत्रण नमूने के लिए तीव्रता उपचार के नमूनों के लिए मतलब तीव्रता मतलब है, और _ख छ असाइन नहीं की गई जांच का मतलब तीव्रता है . एक सकारात्मक लॉग ₂ अनुपात के साथ खींच के इलाज के लिए प्रति संवेदनशील हैं, और उन है कि प्रतिरोधी रहे हैं नकारात्मक _लॉग 2 अनुपात है .

6. अनुक्रमण द्वारा barcoded खमीर उपभेदों की फिटनेस का आकलन

विलोपन के रूप में प्रोटीन के लिए वर्णित पूल से डीएनए अलग.
समग्र Illumina flowcell के लिए संकरण के लिए आवश्यक आम बारकोड प्राइमरों के दृश्यों और दृश्यों के शामिल प्राइमरों के साथ प्रत्येक 20 पूर्व uptag बारकोड बढ़ाना (Illumina प्राइमरों और amplicon का एक चित्र के लिए 3 चित्रा तालिका देखें). येप्राइमरों इस्तेमाल किया जा अतिरिक्त शुद्धि के बिना desalted कर सकते हैं. पीसीआर 100μL में किया जाता है, निम्नलिखित शर्तों के साथ Invitrogen प्लेटिनम पीसीआर Supermix (Cat. सं 11306-016) का उपयोग कर: 95 ° C / 3 मिनट, 94 के 25 चक्रों ° C/30 सेकंड, 55 ° C/30 सेकंड, 68 ° C/30 सेकंड, 68 ° C/10 मिनट बाद.
पीसीआर उत्पाद (~ 130bp) Qiagen MinElute 96 UF पीसीआर शोधन किट (Cat. सं 28051) के साथ शुद्ध.
पीसीआर शुद्धि के बाद, Invitrogen क्वांट यह dsDNA बीआर परख किट (कैट Q32853 नहीं) के साथ डीएनए यों. 260/280 रीडिंग पर भरोसा मत करो!
सामान्यीकृत डीएनए के 10μg/ml और पूल बराबर मात्रा डीएनए एकाग्रता सामान्यकरें.
3-4 घंटे के लिए इस्तेमाल किया वोल्टेज के आधार पर एक 12% polyacrylamide TBE जेल पर अलग जमा डीएनए.
Ethidium ब्रोमाइड (Sybr ग्रीन के रूप में अच्छी तरह से काम करना चाहिए) के साथ 30 मिनट के लिए जैल का दाग.
एक दीर्घ तरंग यूवी lightbox पर ब्याज की बैंड का पता लगाएँ (उपयुक्त चेहरा संरक्षण पहने), यह काट बाहर और डीएनए निकाले कुचलने का ^{उपयोग} और 17 विधि इथेनॉल वर्षा के बाद सोख.
पुष्टि करें कि उचित आकार डीएनए (130bp) पृथक किया गया है और कि प्राइमरों Agilent Bioanalyzer उच्च संवेदनशीलता डीएनए किट (बिल्ली सं 5067-4626) का उपयोग कर हटा दिया गया है.
नमूना अनुक्रमण:
1. Illumina GAIIx मंच:
  1. समूहों को एक एकल पढ़ें flowcell cBOT और एकल पढ़ें क्लस्टर पीढ़ी किट (बिल्ली सं GD-300-1001) का उपयोग उत्पन्न करता है. पढ़ें एक के लिए, और नीचे टैग संशोधित अनुक्रमण प्राइमरों एक 100um शेयर एकाग्रता में जमा कर रहे हैं और एक पट्टी ट्यूब (120 HT1 μl में प्रत्येक 100um अनुक्रमण प्राइमर के 0.6μL) में जोड़ा है. नुस्खा SR_Amp_Block_StripTubeHyb_v7.0 R1 समूहों उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
  2. जीनोम विश्लेषक IIx पर अनुक्रमण. 18 अनुक्रमण चक्र के बाद, मॉड्यूल बनती - अंत करने के लिए पहली कतरा संश्लेषित पट्टी और flowcell rehybridize प्रयोग किया जाता है, Illumina R1 (नीचे) का उपयोग कर. क्लस्टर पुनर्जीवित और 5 चक्रों के लिए अनुक्रम सूचकांक टैग पर कब्जा कर रहे हैं.
सूचकांक टैग अनुक्रम प्रयोगात्मक डिब्बे में बिन दृश्यों के लिए प्रयोग किया जाता है.
प्रत्येक प्रयोगात्मक बिन के भीतर, खमीर बारकोड अनुक्रम प्रत्येक बारकोड के लिए मायने रखता है की कुल संख्या दे गिनती कर रहे हैं.
गिनता quantile सामान्यीकृत कर रहे हैं ताकि प्रत्येक प्रयोग ही गिनती वितरण है. बारकोड माइक्रोएरे फिटनेस प्रयोगों, फिटनेस प्रत्येक तनाव के लिए दोष अनुपात के साथ सादृश्य द्वारा की गणना है _और लॉग 2 अनुपात (नियंत्रण / इलाज) के रूप में व्यक्त कर रहे हैं. सकारात्मक फिटनेस दोष स्कोर नशीली दवाओं के उपचार के दौरान तनाव बहुतायत में कमी को दर्शाता है और सुझाव है कि कि तनाव में नष्ट कर दिया जीन के जंगली प्रकार संस्करण है कि दवा या अवरोध करनेवाला के लिए प्रतिरोध के लिए आवश्यक है.

नोट: सरणी संकरण के लिए एक विकल्प के रूप में बार - seq को ध्यान में रखते. उच्च throughput अनुक्रमण की लागत कम है, के टैग बहुतायत के एक readout के रूप में उच्च throughput क्रमबद्ध का उपयोग के साथ संभव होता जा रहा है और कई मामलों ^में, अधिक लागत प्रभावी 18 है. इस तरह, प्रवर्धित पीसीआर उत्पाद सीधे संकेत तीव्रता के रूप में एक सरणी के लिए संकरित के रूप में के बजाय 'मायने रखता है' के रूप में मापा जाता है. यह झूठी नकारात्मक और सकारात्मक है कि पार संदूषण, संतृप्ति, या बहुत अधिक या बहुत कम संकेत तीव्रता से उत्पन्न होने वाले मुद्दों टैग से उठता समाप्त है. इसके अलावा, कई प्रयोगों से पहले संयुक्त किया जा सकता है है एक 4-8 आधार ^{डीएनए} 19 सूचकांक के अलावा द्वारा अनुक्रमण . क्योंकि खमीर बारकोड 20 बीपी, एक एकल, 2 कदम 26-28 कुर्सियां पढ़ा दोनों मल्टीप्लेक्स सूचकांक और अद्वितीय बारकोड कब्जा 100 चरम के लिए अनुमति देता है + बहुसंकेतन हैं. इस लेखन के समय, बार कोड प्रोटीन अधिक बार seq एक लागत लाभ प्रदान करता है, और इसके अलावा, बार seq स्वाभाविक लचीला है ऐसी है कि पढ़ता / रन बढ़ जाती है की संख्या के रूप में, बहुसंकेतन के स्तर को आगे कम लागत में वृद्धि कर सकते हैं . कई "मध्य क्षमता" प्रमुख मंच निर्माताओं में से सब से आगे sequencers बार seq करने के लिए पसंद की readout बनने की संभावना अनुक्रमण के साथ प्रजातंत्रीय बनाना होगा,.

इस प्रोटोकॉल भी Illumina HiSeq2000 पर मान्य किया गया है .

Saccharomyces cerevisiae वृद्धि पर नियंत्रण में एक मौलिक जैविक सवाल पता बार - seq के उपयोग के एक उत्कृष्ट प्रदर्शन ग्रेशम एट अल द्वारा हाल ही में एक अध्ययन में प्रस्तुत किया ^है. 20 जो कई महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक डिजाइन और व्याख्या दिशानिर्देश रूपरेखा .

7. जमा स्क्रीनिंग डेटा की मान्यता

किसी भी कार्यात्मक जीनोमिक्स स्क्रीन से परिणाम पृथक संस्कृति में अलग - अलग उपभेदों का उपयोग कर सत्यापित किया जाना चाहिए. एक प्रयोग संवेदनशील उपभेदों की संख्या के मामले में अलग उम्मीदवार उपभेदों की संख्या का चयन करने के लिए पुष्टि क्योंकि कुछ हद तक मनमाना है. एक गाइड के रूप _में लॉग 2 अनुपात या z स्कोर द्वारा सबसे ज्यादा संवेदनशील उपभेदों रैंकिंग और उम्मीदवारों के शीर्ष 25-50% का परीक्षण (जो आम तौर पर 2-3 मानक डे के लिए अनुवादपूल में सभी उपभेदों) के माध्य से viations लागत और लाभ के बीच एक अच्छा संतुलन है. व्यक्तिगत पुष्टियों किसी भी फ्लास्क में किया जा सकता है, लेकिन हम 96 अच्छी तरह प्लेटें में वृद्धि के 5 पीढ़ियों मिलाते स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में मीडिया के 100 μl में 0.06 _आयुध डिपो, 600 के एक प्रारंभिक inoculum का उपयोग, माप हर 15 मिनट में ले (चित्रा 4 देखें) के लिए इन परीक्षणों प्रदर्शन .

8. प्रतिनिधि परिणाम

एक बार एक जीनोम चौड़ा स्क्रीन पूर्ण है, और सरणियों सामान्यीकृत किया गया है और प्रत्येक तनाव का व्यवहार एक नियंत्रण उपचार की तुलना में डेटा (जैसे माइक्रोएरे तीव्रता की तुलना या / मायने रखता है तनाव अनुक्रमण द्वारा) सबसे आसानी से जीन के साथ एक एक्सेल फ़ाइल में हेरफेर कर रहे हैं log2 अनुपात द्वारा नियंत्रण / प्रयोग के स्थान पर रहीं. इस तरीके में, अधिक से अधिक नकारात्मक log2 अनुपात, अधिक संवेदनशील है कि विशेष तनाव परीक्षण हालत है. ये एक्सेल फ़ाइलें रेखांकन सॉफ्टवेयर संकुल की एक किस्म में प्लॉट किया जा सकता है है. हम यह आसान को खोजने के लिए y अक्ष और जीन या एक्स अक्ष पर ओआरएफ नाम पर log2 अनुपात साजिश है. चित्रा 2a में दिखाए गए उदाहरण में, Clotrimazole उपचार (एक ज्ञात रोधी एजेंट) के ऐसे एक भूखंड दिखाया गया है. सभी तनाव है कि 2 के एक log2 अनुपात के साथ इलाज के लिए काफी संवेदनशील होते हैं लाल रंग में हाइलाइट किया जाता है, और हम आमतौर पर प्रत्येक उत्परिवर्ती के व्यक्तिगत विकास assays में दवा की एक ही एकाग्रता की उपस्थिति में इस तरह के उपभेदों के कई सत्यापित होगा. इस उदाहरण में, 4 उपभेदों प्रकाश डाला ERG2 NCP1, और ERG11 के 2 स्वतंत्र alleles जाना जाता है, Clotrimazole के प्रोटीन लक्ष्य. इन 4 जीनों के प्रत्येक सीधे ergosterol biosynthesis, कोलेस्ट्रॉल के बराबर खमीर में शामिल है. उदाहरण के लिए, NCP1 NADP साइटोक्रोम P450 रिडक्टेस कि ergosterol biosynthesis में शामिल है और जो जुड़ा हुआ है और Erg11 साथ coordinately विनियमित है encodes . इस उदाहरण में तथ्य यह है कि ज्ञात दवा लक्ष्य (Erg11) इस निष्पक्ष स्क्रीन में पहचान की है, लक्ष्य मार्ग के रूप में अच्छी तरह के रूप में कई अन्य प्रमुख घटकों पर प्रकाश डाला गया. अंत में, लाल रंग में प्रकाश डाला जीन के कई जीन है कि ergosterol biosynthesis में या अलग जैविक प्रक्रियाओं में शामिल किया जा सकता है प्रतिनिधित्व करते हैं. जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, प्रत्येक एक जमा स्क्रीन में संवेदनशील के रूप में पाया तनाव व्यक्तिगत विकास परख में अपनी संवेदनशीलता के रूप में सत्यापित किया जाना चाहिए. 2b चित्र में दिखाए गए उदाहरण में, चार उपभेदों उनकी कमी आई माता पिता के जंगली प्रकार तनाव, BWP17 के सापेक्ष विकास पर आधारित Clotrimazole के प्रति संवेदनशील होने की पुष्टि कर रहे हैं. ये व्यक्तिगत विकास घटता ऐसे जमा जीन दवा स्क्रीन की एक महत्वपूर्ण विशेषता पर प्रकाश डाला, कि एक विशेष तनाव की पूर्ण रैंक है अपनी संवेदनशीलता का सही स्तर को प्रतिबिंबित जरूरी नहीं. इसके अलावा, चित्रा 2b भी प्रत्येक जीन के लिए एकाधिक alleles इस मामले में होने के मूल्य से पता चलता है संवेदनशीलता, दो erg11 व्यवधान म्यूटेंट थोड़ा भिन्न है. संवेदनशीलता की डिग्री के साथ इन अवरोधों की प्रकृति correlating कार्रवाई की दवाओं तंत्र में अतिरिक्त अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं.

चित्रा 1 जमा वृद्धि परख और बारकोड का पता लगाने के लिए कार्यप्रवाह. संस्कृतियों जमा कोशिकाओं के thawed aliquots (चरण 1) के साथ inoculated हैं, और फिर पीढ़ियों के वांछित संख्या (चरण 2) या तो यन्त्र - मानव के लिए हो (एक ऑप्शन) या मैन्युअल (विकल्प बी). कक्ष centrifugation द्वारा harvested रहे हैं (कदम 3) और जीनोमिक डीएनए तो काटा कोशिकाओं (4 कदम) से अलग है, uptags और downtags स्वतंत्र (कदम 5) परिलक्षित कर रहे हैं, और एक सरणी (6a कदम या अनुक्रम सीधे 6b कदम) संकरित.

चित्रा 2. नमूना डेटा के प्रोटोकॉल के कुछ बिंदुओं पर एकत्र . (ए) स्क्रीनिंग परिणाम ⁽¹³ से अनुकूलित) से नमूना डेटा. टैग म्यूटेंट के पूल Clotrimazole और DMSO (नियंत्रण) की उपस्थिति में 20 पीढ़ियों के लिए हो गया था. ₂ अनुपात (नियंत्रण तीव्रता / तीव्रता उपचार) प्रवेश की गणना और जीन की एक समारोह के रूप में प्लॉट. अति संवेदनशील उपभेदों (लाल) Clotrimazole, ERG11p के जाना जाता है लक्ष्य भी शामिल हैं. ध्यान दें कि इस परख अक्सर यौगिक वास्तविक लक्ष्य के अलावा अन्य संवेदनशील म्यूटेंट uncovers. आम तौर पर, इन म्यूटेंट उन है कि लक्ष्य के साथ synthetically का कार्य कर रहे हैं, उन है कि एक सामान्य प्रतिक्रिया है / तनाव उपचार का हिस्सा हैं, या झूठी सकारात्मक है कि पुष्टि करने में विफल रहे हैं. (बी) पुष्टि डेटा का उदाहरण ⁽¹³ से अनुकूलित). परिणाम के जमा वृद्धि assays से व्यक्तिगत संस्कृति में तनाव बढ़ द्वारा मान्य किया जा सकता है और जंगली प्रकार के विकास (काला) के खिलाफ तुलना.

चित्रा 3 माइक्रोएरे संकरण या बारकोड अनुक्रमण के लिए जमा बारकोड assays से उत्पादित amplicon की संरचना . प्रत्येक उत्परिवर्ती के लिए उत्पादन amplicon मैंसंग्रह n एकीकरण के लिए जीनोम (नीले ATG और TAA लेबल क्षेत्रों), अद्वितीय बारकोड (एजी लेबल और एक काले पानी का छींटा के द्वारा संकेत) अनुरूपता शामिल हैं. माइक्रोएरे संकरण के लिए, नीले आम प्राइमरों माइक्रोएरे संकरण के लिए एक 60bp जांच बढ़ाना करने के लिए उपयोग किया जाता है. बारकोड अनुक्रमण के लिए, विस्तारित प्राइमरों पीसीआर प्रतिक्रिया में इस्तेमाल किया जाता है, Illumina एडाप्टर (लाल पट्टी), और 6bases पार hatches के सूचकांक) और अपस्ट्रीम प्राइमर के लिए नीले रंग आम प्राइमर एन्कोडिंग दृश्यों के शामिल है, और एक ही समग्र (प्राइमर ऋण 6 दूसरे प्राइमर के लिए आधार) सूचकांक.

चित्रा 4 1 के लिए व्यक्तिगत विकास assays.) जंगली प्रकार खमीर के खिलाफ यौगिकों prescreening जीनोम चौड़ा स्क्रीनिंग और 2 के लिए एक उचित खुराक निर्धारित) जीनोम चौड़ा स्क्रीन से परिणाम की पुष्टि करते. (ए) 96 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे की थाली सेल निलंबन के 100 μl के साथ .062 के एक आयुध डिपो में भर जाता है. हर अच्छी तरह से एक ही (खुराक निर्धारण के लिए) तनाव या अलग तनाव और दवा के संयोजन (पुष्टि assays के लिए) शामिल कर सकते हैं. यौगिक (आमतौर पर DMSO में भंग) के 2 μl जोड़ी जाती है और कोशिकाओं को 30 में 16-20 घंटे के लिए लगातार मिलाते साथ बड़े हो रहे हैं डिग्री सेल्सियस DMSO के अंतिम एकाग्रता 2% से अधिक नहीं होनी चाहिए. इस उदाहरण में, अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक में वृद्धि वक्र काले रंग में लाल नियंत्रण में वृद्धि वक्र के एक भूखंड के खिलाफ प्लॉट किए जाते है. (बी) कई एक उदाहरण दवा के साथ एक दूसरे के शीर्ष पर मढ़ा प्राप्त prescreens की उच्च संकल्प छवि. इस अनुमापन श्रृंखला में, एक _10-15 आईसी बैंगनी खुराक के साथ प्राप्त की है और विलोपन की रूपरेखा (हिप हॉप) के लिए उपयुक्त होगा . उच्च ऑप्टिकल घनत्व में गैर linearity के कारण, Tecan ods (या किसी भी इसी तरह थाली पाठक) एक "पारंपरिक" 1mm क्युवेट पथ लंबाई के साथ प्राप्त उन का उपयोग कर calibrated किया जा चाहिए.

Discussion

यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल मामूली संशोधन के साथ, कि आसानी से अलग टैग उत्परिवर्ती संग्रह बना सूक्ष्मजीवों के barcoded उत्परिवर्ती संग्रह के मौजूदा संग्रह की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अनुकूलित किया जा सकता है उल्लिखित. हम जोर है कि जब तक हम टैग transposon mutagenesis पर रोगजनक खमीर सी. के लिए एक प्रोटोकॉल की सूचना दी है albicans, एक बहुत ही इसी तरह की प्रोटोकॉल अनेक जीवकोष कवक की एक विस्तृत विविधता के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. संशोधित, इस प्रोटोकॉल ¹³ बैक्टीरिया में अच्छी तरह से काम करता है, और वर्तमान में अतिरिक्त कवक और बैक्टीरिया जीनोम का एक नंबर के लिए संग्रह निर्माण के तहत कर रहे हैं. वर्तमान में, इस परख केवल व्यापक, जीनोम चौड़ा जीन छोटे अणु बातचीत के लिए निष्पक्ष स्क्रीन प्रदान करता है. परख की एक विशेष रूप से सम्मोहक सुविधा है कि जीन या छोटे अणु का कोई पूर्व ज्ञान की आवश्यकता है. गुंजाइश है और इन assays के सत्ता के बावजूद, उनके अन्य प्रयोगशालाओं के लिए transferability प्रारंभिक पूंजी और परिणामों के विश्लेषण के लिए निवेश सूचना उपकरण द्वारा किया गया है कुछ हद तक निस्र्द्ध. एक अगली पीढ़ी के अनुक्रम विश्लेषण के लिए मजबूत उपकरण के साथ संयुक्त readout की गोद लेने के साथ, हम उनकी गोद लेने में वृद्धि की उम्मीद है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम रॉन डेविस, एडम Deutschbauer, और विचार - विमर्श और सलाह के लिए टोरंटो विश्वविद्यालय में पूरे हिप हॉप प्रयोगशाला धन्यवाद. CN राष्ट्रीय मानव जीनोम रिसर्च इंस्टीट्यूट (अनुदान HG000205 संख्या), HG003317 RO1, CIHR एमओपी 84,305, और कनाडा के कैंसर सोसायटी (# 020,380) से अनुदान द्वारा समर्थित है. जो स्टैनफोर्ड जीनोम प्रशिक्षण कार्यक्रम (अनुदान संख्या T32 राष्ट्रीय मानव जीनोम रिसर्च इंस्टीट्यूट से HG00044) और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (अनुदान P01 संख्या GH000205) द्वारा समर्थित किया गया. GG NHGRI RO1 HG003317 और कनाडा के कैंसर सोसायटी, अनुदान 020380 #, टीडी और Donnelly अनुक्रमण केंद्र द्वारा समर्थित भाग में डीआरएस के अभिनव के लिए कनाडा फाउंडेशन से अनुदान द्वारा समर्थित है. बे्रन्डा एंड्रयूज और जैक ग्रीनब्लाट्ट. एम्स टोरंटो ओपन फैलोशिप के एक विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित है.