Konkurrenskraftiga Genomic skärmar av streckkodade Jäst bibliotek

Summary

Vi har utvecklat omfattande, objektiva genomet hela skärmar för att förstå gen-läkemedel och gen-miljö interaktioner. Metoder för screening av dessa muterade samlingar presenteras.

Abstract

Genom framsteg i nästa generations sekvensering teknik har vi tillgång till nya genomet sekvenser nästan dagligen. Tempot i dessa framsteg accelererar, lovande större djup och bredd. Mot bakgrund av dessa extraordinära framsteg, blir behovet av snabba, parallella metoder för att definiera genfunktion allt viktigare. Samlingar av genomet hela radering mutanter i jäst och E. coli har fungerat som arbetshästar för funktionell karakterisering av geners funktion, men detta tillvägagångssätt är inte skalbar, aktuell gen-radering tillvägagångssättet förutsätter att vart och ett av tusentals gener som utgör en arvsmassa som ska tas bort och verifieras. Först efter detta arbete är klart kan vi följa med hög genomströmning fenotypning. Under det senaste decenniet har vårt laboratorium förfinat en portfölj av konkurrenskraftiga miniatyriserade, med hög genomströmning genomet hela analyser som kan utföras parallellt. Denna parallellisering är möjligt på grund av införandet av DNA "taggar" eller "streckkoder," i varje mutant, med streckkod fungerar som en proxy för mutationen och en kan mäta streckkoden överflöd att bedöma muterade fitness. I denna studie vill vi fylla gapet mellan DNA-sekvens och streckkodade mutant samlingar. För att åstadkomma detta presenterar vi en kombinerad transposon störning-streckkodning synsätt som öppnar upp parallella streckkod analyser till nyligen ordnat, men dåligt kännetecknas mikrober. För att illustrera denna metod presenterar vi en ny Candida albicans streckkodade störningar insamling och beskriva hur både microarray-baserade och nästa generations sekvensering-baserade plattformar kan användas för att samla in 10.000 - 1.000.000 gen-genen och drog-gen interaktioner i ett enda experiment.

Protocol

1. Bakgrundsinformation

Det finns flera sätt att generera mutanter som bär streckkod taggar. Den nuvarande guldmyntfoten är jästen Knockout (YKO) samling som skapats av ett konsortium av laboratorier och avslutades 2002 ^1. Sedan den ursprungliga YKO infördes, har andra jäst samlingar tagits fram, i olika stam bakgrund, med hjälp av över-uttryck konstruktioner, och i andra mikrober såsom E. coli ^2. Parallellt är strävan att skapa streckkodade shRNA bibliotek går snabbt, och i själva verket har många av de konstruktionsprinciper för dessa däggdjur samlingar antagits från jäst. Att visa hur streckkodade transposoner kan vara en snabb, allmänt gällande strategi för att skapa systematiska mutant samlingar, fokuserar vi på en samling vi nyligen skapade i den mänskliga svamp patogener, Candida albicans. Vårt arbete med Candida byggde på framgångarna med streckkod skärmar i S. cerevisiae, och används här som ett exempel organism. Provet protokollet kan med smärre modifieringar användas för att screena en organism som kan odlas i suspension kultur. Eftersom få organismer har den erforderliga höga omvandling och effektiv mitotiska rekombination som behövs för att skapa perfekta radering mutanter, därför utvecklade vi ett protokoll som använder transposon mutagenicitet in vitro mutagenize en genomisk DNA-bibliotek, och sedan omvandlas dessa streckkodade genomiska fragment i Candida albicans ^{3 , 4.} Inspirerad av framgången med den ursprungliga YKO insamling och dess roll i grundläggande upptäckter om karaktären av genen nät ^5-8, genomet hela haploinsufficiency ^9, drog mål och verkningsmekanism ^10,11 och essentiala av alla gener i arvsmassan ¹² räknar vi med att bredda denna metod inom andra mikrober kommer att bli mycket givande.

Protokollet nedan förutsätter att den önskade muterade kollektionen har skapats (t.ex. YKO eller Candida albicans störningar insamling) och finns som individuellt arkiverade stammar. För en detaljerad beskrivning av stam konstruktion se ^1,13,14.

2. Kombinera individuella mutanter till en enda pool

1. Låt en vecka för att generera sammanslagna cellen alikvoter (kan förvaras under obegränsad tid vid -80 ° C).
2. Tina frysta glycerol lager för stammar av intresset helt, men låt inte cellerna vara upptinade för> 2 timmar.
3. Sterilisera en 96-bra stift verktyg, doppa stiftet verktyget i vatten för att avlägsna eventuella kvarvarande celler, följt av 2 doppar i 70% etanol bad (t.ex. pipettspetsen låda lock), låga stiftet verktyget och svalna i 1 minut. Var noga med att flamma stiftet verktyget bort från etanolen bad. Nivån på etanol baden bör överstiga nivån i vattenbad så att alla överföringar cellerna flammade och tas bort. Byt vatten var 4-6 pinnings.
4. Sätt den sterila 96-väl pin-verktyg till en upptinad 96-brunnar, snurra försiktigt och överföra celler till en Nunc Omni fack som innehåller YPD-agar inbegripet lämplig antibiotika. Väx kolonier tills de når maximal storlek vid 30 ° C (2-3d). För att spara tallrikar, finner vi det mest användbara för att konsolidera fyra 96 ​​brunnar på en enda Omni-bricka med ~ 384 stammar.
5. Efter kolonier har ökat, notera eventuella saknade eller långsamt växande raser och Repin dessa på ~ 2X i cellmassan som resten av stammarna.
6. Att arbeta i en mikrobiologi miljö (med flammor och sterila laboratorieutrustning, översvämning tallrik med 5-10 ml media, blötlägg i 5 min och återsuspendera kolonier med en cell spridare. Häll vätskan plus celler i ett 50 ml koniskt centrifugrör och tillsätt glycerol till 15% eller DMSO till 7% (vol / vol).
7. Mät OD ₆₀₀ av poolen och justera (genom utspädning eller centrifugering) till en slutlig koncentration av 50 OD ₆₀₀ / ml med media som innehåller 15% glycerol eller 7% DMSO.
8. Alikvotera i 40 l volymer i PCR-band rör och fryser vid -80 ° C.

3. Experimentell pool tillväxt

Detta förfarande beskrivs i figur 1.

1. Tina pool alikvoter (i PCR-rör) på is. Om du inte använder robotteknik, gå till steg 5.
2. Omedelbart utspädd (gently!) poolen i media med läkemedel eller tillstånd val, ympas på en OD ₆₀₀ av 0,0625 i en total volym av 700 l i en 48-brunnar. Inkludera minst ett lämpligt lösningsmedel kontroll på tallriken. För experiment som sträcker sig utanför 5 generationer av tillväxt (dvs mer än en bra), fyll intilliggande brunnar med media eller villkor i val, men inga celler.
3. Tätning med en plastplatta tätning, om tillstånd kräver aerob tillväxt (t.ex. icke-jäsbara kolkällor), använd en 21 gauge nål och stick igenom hålen i membranet sigill mot sidan av varje brunn.
4. Växa i en spektrofotometer, skaka vid 30 ° C med ett experimentellt bestämningNed skaka behandling (t ex skaka 14 min på högsta inställningen (eller temperatur-kontrollerade shaker), läsa brunnar, återuppta skakningar). En del av cellsuspensionen kan skördas av roboten och sparas på en kall tallrik på robotliknande däck på användardefinierade poäng generationstid, typiskt 5, 10, 15 och 20 generationer av tillväxt. (Http://med.stanford.edu/sgtc/technology/access.html, för kontaktuppgifter C. Nislow eller G. Giæver).
5. För manuell celltillväxt, inokulera en 50 ml kultur vid en start OD ₆₀₀ av 0,002 i en 250 ml kultur kolv. Skaka vid 30 ° C vid 250 rpm tills cellerna når en slutlig OD ₆₀₀ på 2,0 (för Saccharomyces eller Candida) för ~ 10 generationer av tillväxt. Ytterligare generationer av tillväxt kan erhållas genom spädning av celler vid en OD600 på 2,0 till 0,02 i en fräsch kolv.
6. Harvest minst ~ 2 OD ₆₀₀ enheter av celler för varje prov / tid-punkt i Safe-Lock mikrocentrifugrör.

Notera: Alltid samla en start cellprov (dvs en "T0 tidpunkt") för att bedöma inledande påfrestningar representation i nyskapade pool genom att lägga till 1-2 OD ₆₀₀ av pool direkt från frysen prov till ett 1,5 ml rör och behandling som beskrivs nedan.

4. Genomiska DNA-extraktion, PCR och microarray-hybridisering eller sekvensering

1. Rena genomiskt DNA från ~ 2 OD ₆₀₀ av celler med Zymo Forskning YeaStar kit enligt tillverkarens instruktioner (protokoll I om du använder jäst DNA) eller annan lämplig metod som är specifik för organismen av intresse (standard fenol / kloroform extraktion följt av alkohol nederbörd fungerar väl för olika mikrober). Om du använder YeaStar kit, eluera DNA med 300 mikroliter av 0,1 x TE stället för de 60 mikroliter 1X TE anges i protokollet. Genomisk DNA kan förvaras under obegränsad tid vid -80 ° C.
2. Ställ upp två PCR-reaktioner för varje prov, en för uptags och en för downtags, med reaktionen villkor som följer: 33 l DDH ₂ O, 6 l 10X PCR-buffert utan MgCl _2, 3 l 50 mM MgCl _2, 1,2 l 10 mM dNTPs, 1,2 l 50 mikroM Upp eller Ner primermix, 0,6 l 5 U / l Taq-polymeras, ~ 0,1 mikrogram arvsmassans DNA i 15 l. Total volym är 60 l. Thermocycle under följande förhållanden: 94 ° C 3 min, 30 cykler av 94 ° C 30-talet, 55 ° C 30-talet, 72 ° C 30s, därefter 72 ° C 3min, och hålla vid 4 ° C. Kontrollera den resulterande PCR-produkterna på en gel, en 60 bp produkt för både PCR väntas amplicons används för hybridisering och 130bp för amplicons för streckkod sekvensering). PCR-produkterna kan sedan förvaras vid -80 ° C på obestämd tid.
3. Prewarm hybridisering ugnen till 42 ° C och inrätta ett kokande vattenbad och is hink med en is-vatten slurry.
4. Pre-väta matriserna genom att långsamt fylla med 120 l 1X hybridisering buffert.
5. Inkubera i hybridisering buffert vid 42 ° C och 20 rpm i 10 minuter.
6. Förbered 90 l av hybridisering blandning per prov, plus ett extra som buffert, enligt följande: 75 l 2X hybridisering buffert, 0,5 l B213 kontroll oligonukleotid (0,2 FM / l), 12 l blandad oligonukleotider (12,5 PM / l), 3 l 50X Denhardt lösning) i lås-top 0,5 ml rör.
7. Tillsätt 30 l uptag PCR och 30 l downtag PCR till 120 l hybridisering mix för en total volym på 150 mikroliter. Koka i 2 minuter och ställ in i is-vatten i minst 2 minuter. Kortfattat snurra rören före användning.
8. Ta bort pre-hybridisering buffert från matriser och tillsätt 90 l hybridisering / PCR mix. För att förhindra avdunstning, täck arrayen packningar med en Tough-Spot. Hybridisera i 16 timmar vid 42 ° C, 20 rpm.
9. Färskt förbereda 600 l blandning biotin märkning per prov plus en extra, enligt följande: 180 l 20X specialföretag, 12 l 50X Denhardt-talet, 6 l 1% Tween 20 (vol / vol), 1 l 1 mg / ml streptavidin-fykoerytrin, 401 l DDH ₂ O. Förvara alla streptavidin-PE prover i mörker. Alikvotera 600 l till 2 ml rör. Ta bort Tough-Spots från marker.
10. Långsamt bort hybridisering mix från matriser med pipett och fyll microarrays med 120 l Tvätta A. Prima Affymetrix Fluidics stationen.
11. Tvätta arraysanvändande en Affymetrix Fluidics station enligt tillverkarens anvisningar, med hjälp av "Gene-Flex_Sv3_450" protokoll med följande ändringar: 1 extra steg med tvätta en (1 cykel, 2 mixar) innan färgning, Wash B temperaturen 42 ° C istället för 40 ° C, fläckar vid 42 ° C istället för 25 ° C. Det är också möjligt att utföra tjänsten hybridisering tvätta, de biotin färgning, och efter färgning tvätta manuellt (se sid 396 i referens 15). Efter Fluidics verksamhet, kör Fluidics stationen "SHUTDOWN_450" protokoll.
12. Efter tvätt, se till att inga luftbubblor förekommer. Om det behövs lägger 90 l tvätta en och pipettera långsamt tills bubblorna försvinner. Om det finns några märken eller SMudges på matrisen yta, rengör glasfönster med isopropanol och en luddfri vävnad. Applicera färsk Tough-Spots över packningar / septa och placera arrayer i skannern.
13. Scanna in en Affymetrix GeneArray scanner vid ett utsläpp våglängd på 560 nm.

5. Array analys (se figur 2 för en erhållas exempel med hjälp av Candida albicans störningar insamling)

1. Extremvärde maskering: Eftersom Affymetrix TAG4 rad innehåller 5 replikat av varje streckkod komplement utspridda slumpmässigt någon streckkod sond som avviker från det replikat kan maskeras och kasseras. För att göra detta, för varje rad funktion som verkar vara ett extremvärde baseras på sin signal jämfört med de 4 andra replikat av den här funktionen undersöker vår mjukvara först den 5 funktioner som omger den misstänkte avvikare producerar en matris av 25 funktioner med den misstänkte funktionen i centrum. Om> 13/25 sonder i det här området skiljer sig från var och en av deras individuella trimmat sina replikera medelvärdet (medelvärdet av den mellersta tre replikat, varvid de högsta och lägsta replikat) med mer än 10%, detta är sonden sedan kastas från vidare analys. Eftersom sådana extremvärden är oftast ett resultat av post-hybridisering tvätt inkonsekvenser, expandera vi eller "pad" den region som innehåller misstänkta sonder. Pad sådan givare genom att ta med alla givare inom en 5-sond radie, enligt ((x _{1-x 2)} ² + (y _{1-y ²⁾ 2)} ^½ <6 där x _{1, 2} x, y _1, och y ₂ är x-och y-koordinater för de två funktionerna. Slutligen, kasta funktioner som standardavvikelse (som ingår i. CEL filen för Affymetrix matriser) av funktionen pixlar / medelvärde funktionen pixlar. Efter att extremvärden, replikerar genomsnittliga intensiteten värden för alla återstående.
2. Ta bort oanvändbara taggar: Tags med låg intensitet värden ger dåliga resultat och måste avlägsnas. Ett undantag cutoff för dessa låg intensitet givare kan beräknas enligt följande:
   1. För varje behandling kontroll par matriser, beräkna log ₂ ((i _{c-b g)} / (i _{t-b g))} för varje tagg, där jag _c är kontrollen intensitet, jag _t är behandlingen intensitet, och b _G är den genomsnittliga intensiteten av lediga taggen sonder.
   2. Para ihop uptag och downtag nyckeltal av påfrestningar och för varje tagg par, ta minsta ljusstyrka för de två taggarna i två prover. Sortera förhållandet paren av detta minimum intensitet.
   3. Använd ett skjutfönster storlek 50 på de rankade förhållandet par, beräkna korrelationen mellan uptag och downtag förhållandet par i fönstret. Också beräkna genomsnittet av de minsta ljusstyrkorna beräknats i föregående steg.
   4. Skjut fönstret med 25 par, och upprepar det föregående steget tills alla paren har överskridits.
   5. Plotta den genomsnittliga minsta ljusstyrka jämfört med uptag-downtag korrelation för alla fönster.
   6. Slutligen väljer en intensitet tröskel, oftast använder vi intensiteten värde där sambandet första gången legat över 80% av sin maximala nivå. Flagga och ta bort från vidare analys några taggar under denna cutoff.
3. Mättnad korrigering: Eftersom varje funktion på streckkoden microarray kan bli mättad, är signalen på TAG4 rad inte linjärt relaterad till taggen koncentration. För att korrigera för denna mättnad följa det protokoll som beskrivs i referens ^16.
4. Array normalisering: För varje array, normalisera uptags och downtags separat. För att quantile normaliseras, rangordna de värden som erhålls från varje array för uptags och downtags för att öka intensiteten. Att betyda normalisera för varje uppsättning uptags och downtags, dividera med medelvärdet. Den genomsnittliga normalisering av alla matriser är ett andra steg efter att omvandla rådata till medelvärdet av varje matris.
5. Beräkning av känslighet poäng för kontroll-behandling jämförelser: För att använda log ₂ nyckeltal som ett mått av känslighet: För varje stam, beräkna log ₂ ((μ _{c-b g)} / (μ _{T-B g)),} där μ _c är medelintensiteten för kontrollprover, är μ _t medelvärdet intensiteten för behandling prover, och _b G är medelvärdet intensitet lediga sonder. Stammar med en positiv log ₂ förhållandet är känsliga för behandling, och de som är resistenta negativa log ₂ nyckeltal.

6. Bedöma lämplighet streckkodade jäststammar av sekvensering

1. Isolera DNA från radering pooler som beskrivs för mikroarrayer.
2. Förstärk varje 20-Mer uptag streckkod med komposit primers består av sekvenser av den gemensamma streckkoden primers och de sekvenser som krävs för hybridisering till Illumina flowcell (se tabell över Illumina primers och Figur 3 för ett diagram över amplicon). Dessaprimers kan användas desalted utan ytterligare rening. PCR utförs i 100μL, med hjälp av Invitrogen Platinum PCR Supermix (kat. nr 11.306-016) med följande villkor: 95 ° C / 3 min, 25 cykler av 94 ° C/30 sek, 55 ° C/30 sek, 68 ° C/30 sek, följt av 68 ° C/10 min.
3. Rena PCR-produkten (~ 130bp) med Qiagen MinElute 96 UF-PCR Purification Kit (kat. nr 28.051).
4. Efter PCR-rening, kvantifiera DNA med Invitrogen Quant-IT dsDNA BR-analys Kit (Cat No Q32853). Lita inte på 260/280 avläsningar!
5. Normalisera DNA-koncentration till 10μg/ml och poolen lika stora volymer av normaliserade DNA.
6. Separata poolade DNA på en 12% polyakrylamid TBE gel i 3-4 timmar beroende på begagnade spänning.
7. Stain geler med etidiumbromid (Sybr Grön ska fungera lika bra) i 30 minuter.
8. Leta bandet av ränta på en långvågig UV-ljusbord (bär lämpligt ansiktsskydd), klippa ut och packat upp DNA med trängseln och njut metod ¹⁷ följt av etanol nederbörd.
9. Kontrollera att lämplig storlek DNA (130bp) har isolerats och att grundfärger har tagits bort med hjälp av Agilent Bioanalyzer Hög känslighet DNA-kit (Cat nr 5067-4626).
10. Exempel sekvensering:
    1. Illumina GAIIx plattform:
       1. Generera kluster på en enda Läs flowcell med CBOT och Single-Läs Kit Cluster Generation (Kat nr GD-300-1001). För Läs 1, upp och ner-taggen ändras sekvensering grundfärger samlas på ett 100uM lager koncentration och läggs till en remsa-rör (0.6μL varje 100uM sekvensering grundfärg i 120 l HT1). Recept SR_Amp_Block_StripTubeHyb_v7.0 används för att generera R1 kluster.
       2. Sekvensering på Genome Analyzer IIx. Efter 18 sekvensering cykler, är parade ändmodul används för att skala den syntetiserade första delen och rehybridize de flowcell, med hjälp av Illumina R1 (nedan). Kluster är regenereras och sekvenseras för 5 cykler att fånga index taggen.
11. Indexet taggen sekvens används för att bin sekvenser i experimentella papperskorgar.
12. Inom varje experimentella bin, är jästen streckkod sekvenser stämde att ge ett totalt antal räknas för varje streckkod.
13. Räknar är quantile normaliseras så varje experiment har samma antal fördelning. I analogi med fitness streckkod microarray experiment, lämplighet defekt nyckeltal för varje stam beräknas och uttrycks som log ₂ ratio (kontroll / behandling). Positiva fitness defekt poäng innebär en minskning av stammen överflöd under behandling och föreslår att vildtyp version av genen utgått i det stam krävs för motstånd mot att läkemedlet eller hämmare.

Obs: Med tanke på Bar-artiklar som ett alternativ till array hybridisering. Med kostnaderna för hög genomströmning sekvensering minskar, med hög genomströmning sekvensering som en avläsning av tagg överflöd blir möjligt och i många fall är mer kostnadseffektivt ^18. På så sätt förstärks PCR-produkten mäts direkt som "räknas" snarare än som signalstyrka som hybridiseras till en array. Detta eliminerar falska negativ och positiv som uppstår taggen korskontaminering, mättnad, eller frågor som uppstår i mycket hög eller mycket låg signal intensiteter. Dessutom kan flera experiment kombineras innan sekvensering genom tillägg av en 4-8 bas DNA-index ^19. Eftersom jästen streckkoder 20 bp, en enda, 2-steg läsa av 26-28 baser fångar både multiplex index och unik streckkod, vilket möjliggör extremt 100 + multiplexering. Vid tidpunkten för denna skrift erbjuder Bar-artiklar en kostnadsfördel under streckkod microarrays, och dessutom är Bar-artiklar till sin natur flexibelt så att som antalet läsningar / run ökar, kan nivån av multiplexering öka för att ytterligare minska kostnaderna . Flera "mid-kapacitet" sequencers från alla de stora plattformen tillverkare kommer att ytterligare demokratisera Bar-artiklar, med sekvensering sannolikt att bli avläsning av valet.

Detta protokoll har också validerats på Illumina HiSeq2000.

En utmärkt demonstration av användningen av Bar-artiklar att ta itu med en grundläggande biologisk fråga i Saccharomyces cerevisiae tillväxt kontroll presenteras i en färsk undersökning från Gresham, et al. ²⁰ som översikt flera viktiga experimentell design och riktlinjer tolkning.

7. Validering av poolade screeningdata

Resultaten från någon funktionell genomik skärm bör kontrolleras med hjälp av de enskilda stammar i isolerade kulturen. Eftersom varje experiment kommer att skilja sig i termer av antalet känsliga stammar, välja hur många kandidaten stammar för att bekräfta är något godtyckligt. Som en guide som rangordnar de mest känsliga stammar av log ₂ kvot eller Z-score och testa den översta 25-50% av kandidaterna (som vanligtvis översätts till 2-3 standard devälkända teorin för avvikelser från medelvärdet av alla stammar i poolen) är en bra balans mellan kostnad och nytta. Individuella bekräftelser kan göras i någon kolv men vi utföra dessa tester för 5 generationer av tillväxten i 96 brunnar med hjälp av en start inokulum av 0,06 OD ₆₀₀ i 100 l av media i en skakande spektrofotometer, med mätningar var 15 minuter (se figur 4) .

8. Representativa resultat

När en genomet hela skärmen är klar och arrayer har normaliserats och beteendet hos varje virusstam jämfört med en kontrollgrupp behandling (t.ex. genom att jämföra microarray intensitet eller sekvensering räknas / stam) uppgifterna är mest lättmanipulerade i en Excel-fil med gener efter den log2 förhållandet mellan kontroll / experiment. På detta sätt, desto större negativa log2 förhållandet, desto mer känslig att särskilt anstränga sig för att testet skick. Dessa Excel-filer kan ritas i en mängd olika grafiska programvaror. Vi tycker att det är enklast att rita log2 nyckeltal på Y-axeln och genen eller ORF namn på X-axeln. I exemplet i figur 2a, är en sådan tomt på klotrimazol behandling (en känd antimykotika) visas. Alla stam som är betydligt känsligare för behandling med en log2 förhållandet 2 är markerade i rött, och vi skulle normalt verifiera många av sådana stammar hos enskilda tillväxt analyser av varje mutant i närvaro av samma koncentration av läkemedlet. I detta exempel är 4 stammar fram, NCP1, ERG2 och 2 oberoende alleler av ERG11, de kända proteinet målet klotrimazol. Alla dessa fyra gener är direkt inblandad i ergosterolbiosyntesen, jästen motsvarande kolesterol. Till exempel kodar NCP1 en NADP-cytokrom P450 reduktas som är inblandad i ergosterolbiosyntesen och som är associerat och coordinately regleras med Erg11. Detta exempel belyser det faktum att de kända drogen målet (Erg11) har identifierats i denna objektiva skärmen, liksom flera andra viktiga komponenter i målet väg. Slutligen är flera av de markerade gener i rött representerar gener som kan vara inblandade i ergosterolbiosyntesen eller i olika biologiska processer. Som nämnts ovan, bör varje stam upptäcks som känsliga i en sammanslagen skärm verifieras om dess känslighet i enskilda tillväxt analys. I exemplet som visas i figur 2b, finns fyra stammar bekräftats vara känsliga för klotrimazol baserat på deras minskad tillväxt i förhållande till vildtyp förälder stam, BWP17. Dessa individuella tillväxtkurvor belysa ett viktigt inslag i dessa poolade gen-läkemedel skärmar, det är den absoluta rangen av en särskild stam speglar inte nödvändigtvis den exakta graden av känslighet. Dessutom Figur 2b visar också värdet av att ha flera alleler för varje gen, i detta fall har de två erg11 störningar mutanter olika aning känslighet. Korrelera karaktären av dessa störningar med den grad av känslighet kan ge ytterligare insikt i droger verkningsmekanism.

Figur 1. Arbetsflöde för sammanslagna tillväxt analysen och streckkod upptäckt. Kulturer inokuleras med tinas alikvoter av sammanslagna celler (steg 1), och sedan odlas för önskat antal generationer (steg 2) antingen robot (Alternativ A) eller manuellt (Alternativ B). Celler skördas genom centrifugering (steg 3) och genomiska DNA är då isolerad från skördade celler (steg 4), är uptags och downtags oberoende förstärks (steg 5) och hybridiseras till en array (steg 6a eller sekvenseras direkt steg 6b).

Figur 2. Exempel på uppgifter som samlats in vid vissa punkter i protokollet. (A) Exempel på data från screening resultat (anpassad från ^13). Poolen av taggade mutanter var odlas för 20 generationer i närvaro av klotrimazol och DMSO (kontroll). Log ₂ ratio (kontroll intensitet / behandling intensitet) beräknades och ritas som en funktion av gener. Mycket känsliga stammar (röd) inkluderade kända målet för klotrimazol, ERG11p. Observera att denna analys ofta avslöjar andra känsliga mutanter utöver den sammansatta faktiska mål. I allmänhet är dessa mutanter är de som agerar syntetiskt med målet, de som ingår i en allmän stress / behandlingssvar, eller är falska positiva som misslyckas med att bekräfta. (B) Exempel på bekräftelse uppgifter (anpassad från ^13). Resultat från den poolade tillväxt analyser kan valideras genom att växa stammen i enskilda kultur och jämfört mot vildtyp tillväxt (svart).

Figur 3. Struktur amplicon produceras från poolade streckkoden analyser för microarray-hybridisering eller streckkod sekvensering. Den amplicon fram för varje muterade in samlingen innehåller homologi till genomet för integration (blå regioner märkt ATG och TAA), unika streckkoder (märkt AG och markeras med ett svart streck). För microarray-hybridisering, är den blå vanliga primers som används för att förstärka en 60bp sond för microarray-hybridisering. För streckkod sekvensering, förlängs grundfärg som används i PCR-reaktionen, som består av sekvenser som kodar för Illumina adaptern (röd stapel) och index över 6bases över luckor) och den blå gemensamma primer för uppströms primer, och samma komposit primer (minus den 6 basindex) för det andra primer.

Figur 4. Individuella Tillväxt analyser för 1) prescreening föreningar mot vildtyp jäst för att fastställa en lämplig dos för arvsmassan hela screening och 2) bekräftar resultat från genomet breda skärmar. (A) En 96 samt plan botten plattan är fylld med 100 l cellsuspension på en OD av 0,062. Varje brunn kan innehålla samma stam (för dos-bestämning) eller olika stammar och kombinationer av läkemedel (för bekräftelse analyser). 2 l av substans (oftast löst i DMSO) läggs till och celler odlas med konstant skakning på 16-20 timmar vid 30 ° C. Den slutliga koncentrationen av DMSO bör inte överstiga 2%. I detta exempel, i varje brunn i plattan tillväxten kurvan ritas i svart mot en tomt på kontrollen tillväxtkurvan i rött. (B) Högre upplösning av flera prescreens uppnås med ett exempel drog överdrog ovanpå varandra. I denna titrering serie, är en IC _10-15 erhållits med lila dos och skulle vara lämplig för borttagning profilering (HIP och HOP). På grund av den icke-linjäritet vid högre optisk densitet, måste Tecan (eller liknande plattläsaren) ODS kalibreras med hjälp de som erhålls med en "traditionell" 1mm väg-längd kyvett.

Discussion

Här beskrivs vi ett protokoll som, med blygsamma ändringar, kan enkelt anpassas till ett brett spektrum av befintliga samlingar av streckkodade mutant samlingar av olika mikroorganismer för att skapa taggade muterade samlingar. Vi betonar att även om vi har rapporterat ett protokoll om taggade transposon mutagenes för patogena jäst C. albicans, en mycket liknande protokoll kunde anpassas till en mängd olika encelliga svampar. Ändrad fungerar detta protokoll och i bakterier ^13, och för närvarande samlingar för ytterligare ett antal svamp-och bakteriella genomen är under uppbyggnad. För närvarande ger denna analys är den enda heltäckande, genomet hela objektiva skärm för gen-småmolekylära interaktioner. En särskilt spännande inslag i analysen är att ingen tidigare kunskap av genen eller små molekyler krävs. Trots omfattningen och kraften i dessa analyser har deras överföras till andra laboratorier har hindrat något av den ursprungliga kapitalinvesteringar och IT-verktyg för analys av resultaten. Med antagandet av en ny generation sekvens utläsning kombinerat med kraftfulla verktyg för analys, förväntar vi oss att de har antagits öka.