Summary
वयस्क के उपयोग में सीमित कारक
Abstract
फल मक्खी ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान के लिए अमूल्य योगदान दिया है और अपने शक्तिशाली एक आनुवंशिकी के कारण neurodegenerative रोगों के लिए एक मॉडल के रूप में व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है. विशेष में उड़ आँख neurodegeneration अनुसंधान के लिए पसंद की अंग किया गया है, ड्रोसोफिला तंत्रिका प्रणाली के सबसे सुलभ और जीवन नगण्य हिस्सा जा रहा है . कठिनाई हालांकि बरकरार आँखों के प्रमुख चेतावनी है, क्योंकि वर्णक के तीव्र autofluorescence इमेजिंग भोजी गतिशीलता 2 के रूप में में intracellular घटनाओं, जो neurodegeneration के समझने के लिए सर्वोपरि हैं .
हमने हाल ही में विच्छेदन और एकल ommatidia 3 की संस्कृति है कि autophagic dysfunctions के हमारी समझ के लिए आवश्यक Dentatorubro - Pallidoluysian शोष के एक मक्खी मॉडल (DRPLA) 3, 4 में किया गया है का इस्तेमाल किया है.
अब हम इस तकनीक का व्यापक वर्णन (1 छवि), electrophysiological 5 अध्ययन है, जो नाटकीय रूप से neurodegeneration मॉडल के लिए उड़ान भरने की संभावना का विस्तार होने की संभावना है से अनुकूलित रिपोर्ट. इस विधि छवि subcellular घटनाओं रहते हैं और फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं पर प्रभावी दवा प्रशासन की निगरानी (छवि 2) के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. यदि मोज़ेक 6-8 तकनीकों के साथ संयोजन में उपयोग किया जाता है, आनुवंशिक रूप से विभिन्न कक्षों की प्रतिक्रियाओं समानांतर में assayed किया जा सकता है (छवि 2).
Protocol
1. ड्रोसोफिला रेटिना के विच्छेदन
- फॉस्फेट के साथ एक अच्छी तरह से एक ग्लास 3 खैर स्लाइड भरें खारा buffered (1X पीबीएस), और तब सीओ 2 द्वारा मक्खियों anesthetize. दोनों पुरुषों और महिलाओं को इस प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- एक बार मक्खियों anesthetized हैं, एक एकल संदंश का उपयोग कर उड़ लेने और पीबीएस के छोटे पकवान में ड्रॉप.
- एक विदारक गुंजाइश के तहत, संदंश के साथ सूंड चुटकी, और तब संदंश का एक दूसरे सेट का उपयोग गर्दन विच्छेद के द्वारा शरीर से सिर अलग.
- सूंड से उड़ सिर होल्डिंग, बाएँ / सही midline मस्तिष्क प्रकट microscissors के साथ उड़ सिर के साथ आधे में कटौती.
- एक कट विंदुक टिप का उपयोग करने के लिए रेटिना लेने, और 3-खैर ग्लास श्नाइडर माध्यम से भरा स्लाइड के एक अच्छी तरह से दूसरा करने के लिए स्थानांतरण.
- सबसे पहले, दूर छील सिर छल्ली के सबसे और फिर संदंश के साथ मस्तिष्क हटाने. लामिना और कॉर्निया के बीच sandwiched रेटिना रखें.
- अगले, ताजा Schnieder सीधे रखा गिलास स्लाइड के माध्यम से एक बूंद (50 μl) पर रेटिना हस्तांतरण.
2. Ommatidia के विच्छेदन
- विच्छेदन (तत्काल इमेजिंग या संस्कृति चाहे) के अंतिम उद्देश्य पर और फ्लोरोसेंट खुर्दबीन (सीधे या उल्टे) की प्रकाशिकी पर निर्भर करता है, इस कदम की जगह या तो एक खुर्दबीन स्लाइड पर या 24 अच्छी तरह से एक थाली में ले जा सकते हैं. इस विच्छेदन के अंतिम उद्देश्य के लिए, ommatidia गिलास स्लाइड पर dissected सीधे हो जाएगा.
- या तो संदंश के साथ रेटिना की सबसे पृष्ठीय या ventral अंत समझ. Microscissors का प्रयोग, पृष्ठीय / वेंट्रल midline के साथ आधे में रेटिना कटौती करने के लिए आंखों के बीच में ommatidia बेनकाब.
- जैसे रेटिना कि कॉर्निया नीचे का सामना करना पड़ रहा है और लामिना का सामना करना पड़ रहा है समझ करने के लिए जारी रखें. ठीक टंगस्टन सुई का प्रयोग, लामिना और कॉर्निया से ommatidia अलग.
- एकल ommatidia और ommatidia के समूहों अच्छी तरह से या स्लाइड के नीचे पर एकत्रित करेगा. किसी भी बड़े मलबे कि आगे बढ़ने से पहले एकत्र हो सकता है निकालें.
3. उपचार धुंधला हो जाना, और इमेजिंग
- भोजी का विश्लेषण करने के लिए, Schneider ड्रॉप में 1:1000 Lysotracker (Schneider में पहली जलमिश्रित 1:10 और तब स्लाइड पर ड्रॉप करने के लिए 0.5 μl जोड़ने), मिश्रण पतला और 10 सेकंड रुको.
- स्लाइड से अधिक तरल निकालें, ommatidia पीछे छोड़ सावधान किया जा रहा है. यह एक ठीक जेल लोड हो रहा है टिप के साथ सबसे अच्छा किया है.
- Vectashield की एक बूंद जोड़ें ommatidia को कवर करने के लिए, और nailpolish साथ coverslip मुहर लागू होते हैं.
4. प्रतिनिधि परिणाम:
प्रोटोकॉल का अच्छा निष्पादन एकल ommatidia और ommatidia के छोटे समूहों के एक नंबर छोड़ लामिना के टुकड़े के द्वारा एक साथ रखा, लेकिन अच्छी तरह से corneal तरफ अलग चाहिए. इन के रूप में इस उदाहरण में imaged किया जा सकता Atg8 कल्पना: GFP और Lysotracker autophagosomes lysosomes, और autophagolysosomes (3 छवि) दिखा. विधि रहते इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन इस मामले में यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि Schneider मध्यम autofluorescence कम तीव्रता फ्लोरोसेंट संकेत भेद करने के लिए यह मुश्किल कर देगा है. एक अतिरिक्त मुद्दा यह है कि वर्णक granules कि photoreceptors को संलग्न रहना तीव्रता लाल चैनल में विशेष रूप से फ्लोरोसेंट हैं. एक brightfield तस्वीर के लिए उन्हें वास्तविक organelles से अलग करने के लिए आवश्यक हो सकता है है.
चित्रा 1. विच्छेदन की प्रक्रिया का प्रवाह चार्ट मक्खी रेटिना से एकल ommatidia या ommatidia के छोटे समूहों को प्राप्त करने के लिए .
चित्रा 2 यहाँ सरल प्रोटोकॉल के संभावित बदलाव का वर्णन है कि मक्खी आनुवंशिकी शामिल है और और 24 घंटे और दवा विच्छेदन के प्रशासन बहाव के लिए धुंधला हो जाना या संवर्धन विच्छेदन के ऊपर उम्र बढ़ने.
चित्रा 3 Confocal autophagosomes और एक एकल ओ से dissected ommatidium में lysosomes के स्कैन, जीएमआर Gal4, यूएएस - Atro75QN; यूएएस GFP: Atg8 / उड़ +, 29 में एक पॉलीग्लुटामाइन Atrophin उत्परिवर्ती और वृद्ध 12 दिनों व्यक्त डिग्री सेल्सियस. brightfield पैनल (शीर्ष सही) ommatidium के लगभग बरकरार संरचना को प्रदर्शित करता है और फ्रेम स्कैन क्षेत्र इंगित करता है. लाल निशान lysosomes, हरी autophagosomes, ऑटो lysosomes, दो organelles के संलयन द्वारा परिणामस्वरूप, पीले दिखाई. arrowheads दो autophagosomes और lysosomes के बीच चल रहे संलयन घटनाओं से संकेत मिलता है.
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Discussion
एकल ommatidium यहाँ प्रस्तुत विच्छेदन neurodegeneration जैसे प्रक्रियाओं, जब ड्रोसोफिला आँख में मॉडलिंग के बारे में गहरी सेल जैविक जानकारी के संग्रह के लिए सक्षम बनाता है. फोटोरिसेप्टर न्यूरॉन्स अधिक आसानी से अन्य न्यूरॉन्स से सुलभ हैं और वे cytoplasm बहुत ही कई मॉडल में इस्तेमाल किया proficiently vivo में neurodegeneration यों कोशिकाओं में विशेष रूप से बड़ी है, और इस तरह पुटिका गतिकी का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है. विच्छेदन के महत्वपूर्ण पहलू मुख्य रूप से यह unfixed ऊतक कि हवा या सूख कभी नहीं उजागर करना चाहिए पर प्रदर्शन करने की क्षमता है. इस बुनियादी तकनीक का विस्तार के लिए संभावनाएं (छवि 2) ऐसी है कि यह रूप में अच्छी तरह से neurodegeneration मॉडल की नजर से प्राप्त जानकारी में क्रांतिकारी बदलाव हो सकता है कर रहे हैं, एक प्राथमिक neuronal मक्खियों में अद्भुत आनुवंशिक संभव संशोधनों के लिए मिलकर संस्कृति में जोड़तोड़ के सभी प्रकार संभव अनुमति .
मोज़ेक तकनीक, neurodegeneration नौ अध्ययन में अत्यंत उपयोगी के साथ संयोजन में यह wt नियंत्रण के बहुत ही मक्खी से उपस्थिति में उत्परिवर्ती ommatidia के एक विशिष्ट सबसेट में सेल जैविक परिवर्तन की पहचान की अनुमति हो सकती है.
जब dissected ommatidia संस्कृति में रखा जाता है, rapamycin 10 या 11 parquat जैसे दवाओं के लिए reponses बेहतर हो सकता है और नियंत्रित कर सकते हैं जब जीवित मक्खियों को दिलाई से मात्रा निर्धारित है. प्रणाली की मुख्य सीमा संस्कृति में dissected ommatidia, जो हम करने के लिए 24 घंटे से परे ज्यादा विस्तार करने में सक्षम नहीं किया गया है के अस्तित्व के समय द्वारा गठित की है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम विचार विमर्श के लिए बर्नार्ड Charroux धन्यवाद. इस काम KCL बायोमेडिकल स्कूल द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Portable CO2 Dispenser | Flystuff | 59-150 | Refills also available |
| DUMONT Tweezer No 5 | Agar Scientific | T5034 | |
| 3-Well Glass Slide | EMS | 71561-01 | |
| Micro scissors | VWR international | HAMMHSB516-09 | |
| Schneider’s Medium | VWR international | 733-1663 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| Superfrost Slides | VWR international | 631-0108 | |
| Vectashield with Dapi | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Coverslips | VWR international | 631-1336 |
References
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