Summary
Le facteur limitant dans l'utilisation de l'adulte
Abstract
La mouche des fruits Drosophila melanogaster a apporté une contribution inestimable à la recherche en neurosciences et a été largement utilisée comme modèle pour les maladies neurodégénératives en raison de sa puissante génétique 1. L'œil de la mouche en particulier, a été l'organe de choix pour la recherche neurodégénérescence, étant la partie la plus accessible et la vie-dispensable de la drosophile système nerveux. Cependant la mise en garde importante des yeux intacts, c'est la difficulté, à cause de l'autofluorescence intense du pigment, dans les événements d'imagerie intracellulaire, telles que l'autophagie dynamiques 2, qui sont primordiales pour la compréhension de la neurodégénérescence.
Nous avons récemment utilisé la dissection et la culture du seul ommatidies 3 qui a été essentielle pour notre compréhension des dysfonctionnements autophagie dans un modèle de vol du Dentatorubro-pallido Atrophie (DRPLA) 3, 4.
Nous avons maintenant le rapport une description complète de cette technique (fig. 1), adapté de 5 études électrophysiologiques, qui est susceptible d'augmenter considérablement la possibilité de voler pour les modèles neurodégénérescence. Cette méthode peut être adaptée aux images en direct des événements subcellulaire et de surveiller l'administration de médicaments efficaces sur les cellules photoréceptrices (Fig. 2). Si elle est utilisée en combinaison avec 6-8 techniques de mosaïque, les réponses des cellules génétiquement différentes peuvent être dosés en parallèle (Fig. 2).
Protocol
1. Dissection de la rétine chez la drosophile
- Remplir un puits d'une lame de verre 3 puits avec du tampon phosphate salin (PBS 1X), puis par les mouches anesthésier CO 2. Les mâles et les femelles peuvent être utilisés pour cette expérience.
- Une fois que les mouches sont anesthésiés, ramasser une seule mouche à l'aide de pinces et le déposer dans le petit plat de PBS.
- Sous un microscope à dissection, pincez la trompe avec une pince, puis détacher la tête de l'organisme par la rupture du cou en utilisant une deuxième série de pinces.
- En tenant la tête de voler de la trompe, coupé en deux le long de la ligne médiane gauche / droite de la tête voler avec microciseaux de révéler le cerveau.
- Utiliser un embout de pipette coupé pour ramasser la rétine, et le transfert à un deuxième puits de la lame de verre 3-bien rempli de milieu de Schneider.
- Tout d'abord, éplucher la plupart de la cuticule tête et puis enlever le cerveau avec une pince. Gardez la rétine en sandwich entre la lame et la cornée.
- Ensuite, le transfert de la rétine sur un drop (50 pi) de milieu Schnieder fraîches placées directement sur la lame de verre.
2. Dissection de la ommatidies
- Selon le but final de la dissection (si l'imagerie immédiate ou la culture) et sur l'optique du microscope à fluorescence (directe ou inversée), cette étape peut se dérouler soit sur une lame de microscope ou dans une plaque de 24 puits. Pour le but final de cette dissection, les ommatidies seront disséquées directement sur la lame de verre.
- Saisissez soit l'extrémité la plus dorsale ou ventrale de la rétine avec une pince. Utiliser microciseaux, couper la rétine en deux le long de la ligne médiane dorsale / ventrale pour exposer les ommatidies dans le milieu de l'œil.
- Continuez à saisir la rétine telles que la cornée est orientée vers le bas et la lame vers le haut. En utilisant une aiguille de tungstène fines, détacher le ommatidies de la lame et la cornée.
- Simple ommatidies et des groupes d'ommatidies recueillera sur le fond du puits ou de diapositives. Enlevez tout débris importants qui peuvent avoir recueilli avant de procéder.
3. Le traitement, la coloration et l'imagerie
- Pour analyser l'autophagie, diluer 1:1000 Lysotracker dans la chute de Schneider (première diluée à 1:10 dans Schneider et puis ajouter 0,5 ul à la baisse sur la diapositive), mélanger et attendre 10 secondes.
- Retirer l'excès de liquide de la lame, en prenant soin de laisser derrière ommatidies. Il est préférable de faire avec une pointe de chargement de gel fine.
- Ajouter une goutte de Vectashield pour couvrir les ommatidies, recouvrir d'une lamelle et scellez avec vernis à ongles.
4. Les résultats représentatifs:
La bonne exécution du protocole devrait laisser un certain nombre de ommatidies unique et de petits groupes d'ommatidies maintenues ensemble par des fragments de la lame, mais bien séparés sur le côté cornée. Ceux-ci peuvent être imagées comme dans cet exemple de visualiser Atg8: GFP et Lysotracker, montrant autophagosomes, les lysosomes et autophagolysosomes (Fig. 3). La méthode peut être utilisée pour l'imagerie en direct, mais dans ce cas il est à noter que l'autofluorescence du milieu de l'Schneider, il sera difficile de distinguer les signaux de faible intensité fluorescente. Un problème supplémentaire est que les granules pigmentaires qui restent attachés à la photorécepteurs sont intensément fluorescentes, en particulier dans le canal rouge. Une image en fond clair peuvent être nécessaires pour les distinguer des organites authentique.
Figure 1. Organigramme de la procédure pour obtenir une dissection ommatidies simples ou de petits groupes d'ommatidies de la rétine voler.
Figure 2. Variantes possibles du protocole simple de décrire ici, qui impliquent génétique de la mouche et le vieillissement en amont de la dissection et la coloration ou de culture jusqu'à 24 heures et en aval l'administration du médicament de la dissection.
Figure 3 scan confocale de autophagosomes et les lysosomes dans une seule ommatidie disséqué de aw; GMR-Gal4, UAS-Atro75QN; UAS-GFP.:: Atg8 / + fly, exprimant une polyglutamine Atrophin mutant et âgés de 12 jours à 29 ° C. Le panneau de fond clair (en haut à droite) affiche la structure presque intacte de l'ommatidie et le cadre indique la zone numérisée. Marques rouges lysosomes, vert l'autophagosomes, auto-lysosomes, résultant de la fusion des deux organites, apparaissent en jaune. Les flèches indiquent deux événements de fusion en cours entre autophagosomes et des lysosomes.
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Discussion
La dissection ommatidie seule présentée ici permet de collecter des informations plus profondes sur les processus biologiques cellulaires, comme la neurodégénérescence, quand modélisés dans l'œil de drosophile. Les neurones photorécepteurs sont plus facilement accessibles que d'autres neurones et ils cytoplasme est particulièrement importante, et donc adapté pour étudier la dynamique des vésicules, dans les cellules mêmes utilisé avec compétence dans de nombreux modèles pour quantifier la neurodégénérescence in vivo. L'aspect critique de la dissection est principalement la capacité à l'exécuter sur le tissu non fixé qui ne doit jamais être exposé à l'air ou de se tarir. Les possibilités d'expansion de cette technique de base sont telles (fig. 2) qu'il peut aussi bien révolutionner l'information obtenue à partir de modèles yeux de la neurodégénérescence, permettant toutes sortes de manipulations possibles dans une culture primaire de neurones couplés à des modifications génétiques possibles étonnant de mouches .
En combinaison avec les techniques de mosaïque, extrêmement utile dans 9 études neurodégénérescence, il peut permettre l'identification des cellules des altérations biologiques dans un sous-ensemble spécifique des mutants ommatidies, en présence de contrôles poids de la mouche même.
Lorsque disséqué ommatidies sont maintenues en culture, reponses à des drogues comme la rapamycine 10 ou 11 peuvent être parquat mieux contrôlés et quantifiés que lorsqu'il est administré à des mouches vivant. La principale limitation de ce système est constitué par le temps de survie des ommatidies disséqué dans la culture, que nous n'avons pas été en mesure d'étendre bien au-delà de 24 heures.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous remercions Bernard Charroux pour les discussions. Ce travail a été financé par l'École KCL biomédicale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Portable CO2 Dispenser | Flystuff | 59-150 | Refills also available |
| DUMONT Tweezer No 5 | Agar Scientific | T5034 | |
| 3-Well Glass Slide | EMS | 71561-01 | |
| Micro scissors | VWR international | HAMMHSB516-09 | |
| Schneider’s Medium | VWR international | 733-1663 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| Superfrost Slides | VWR international | 631-0108 | |
| Vectashield with Dapi | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Coverslips | VWR international | 631-1336 |
References
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