Summary
Den begränsande faktorn i användningen av den vuxna
Abstract
Bananfluga Drosophila melanogaster har gjort ovärderliga bidrag till neurovetenskaplig forskning och har använts allmänt som en modell för neurodegenerativa sjukdomar på grund av dess kraftfulla genetik 1. Flugan ögat i synnerhet har orgeln i valet för neurodegeneration forskning, är den mest lättillgängliga och livet onödigt del av Drosophila nervsystemet. Men den stora varning av intakt ögon är svårigheten, på grund av den intensiva autofluorescens av pigment, i bildbehandling intracellulära förlopp, såsom autophagy dynamik 2, som är utomordentligt viktig för förståelsen av neurodegeneration.
Vi har nyligen använt dissekering och kultur av enstaka ommatidia 3 det har varit viktigt för vår förståelse av autophagic dysfunktioner i en fluga modell av Dentatorubro-Pallidoluysian Atrofi (DRPLA) 3, 4.
Vi rapporterar nu en omfattande beskrivning av denna teknik (Figur 1), anpassat från elektrofysiologiska studier 5, vilket sannolikt kommer att öka dramatiskt möjligheten att flyga modeller för neurodegeneration. Denna metod kan anpassas till bilden leva subcellulära händelser och för att övervaka effektivt läkemedel administration på ljusmätare celler (Fig. 2). Om den används i kombination med mosaik tekniker 6-8, kan svaren från genetiskt olika celler analyseras parallellt (Fig. 2).
Protocol
1. Dissekering av Drosophila näthinnan
- Fyll en en brunn i en 3-Tja glasskiva med fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS 1X) och sedan söva flugor av CO 2. Både hanar och honor kan användas för detta experiment.
- När flugorna är sövd, plocka upp en enda fluga med hjälp av pincett och släppa den i den lilla skålen med PBS.
- Enligt en dissekera omfattning, klämma snabel med pincett, och sedan bort huvudet från kroppen genom att bryta nacken med en andra uppsättning tång.
- Håll flyger huvudet från snabel, halveras längs vänster / höger mittlinjen i farten huvudet med microscissors att avslöja hjärnan.
- Använd ett tips skär pipett för att plocka upp på näthinnan, och överför till en andra brunn på 3-Well glasskiva fylld med Schneider medium.
- Först skala bort det mesta av huvudet nagelband och ta sedan bort hjärnan med pincett. Håll näthinnan inklämt mellan lamina och hornhinnan.
- Därefter överför näthinnan på en droppe (50 l) av färska Schnieder medelstora placeras direkt på glaset bilden.
2. Dissekering av ommatidia
- Beroende på den slutliga syftet med dissektion (om omedelbar bildframställning eller kultur) och på optiken i fluorescerande mikroskop (direkt eller inverterad) kan detta ske antingen på ett objektglas eller i ett 24-brunnar. För de sista Syftet med denna dissektion kommer ommatidia skall dissekeras direkt på objektglas.
- Ta tag antingen den mest dorsala eller ventrala änden av näthinnan med pincett. Använda microscissors, klipp näthinnan i hälften längs ryggens / ventrala mittlinjen för att exponera ommatidia i mitten av ögat.
- Fortsätt att ta tag i näthinnan så att hornhinnan är vänt nedåt och lamina är vänd uppåt. Använda en fin volfram nål, lossa ommatidia från lamina och hornhinnan.
- Singel ommatidia och grupper av ommatidia kommer att samla på botten av brunnen eller glida. Ta bort alla större skräp som kan ha samlats innan du fortsätter.
3. Behandling, färgning och bildhantering
- Att analysera autophagy, späd 1:1000 Lysotracker i Schneider drop (första späda ut 1:10 i Schneider och sedan lägga till 0,5 l av nedgången på bilden), blanda och vänta i 10 sekunder.
- Ta bort överflödig vätska från bilden, var noga med att lämna ommatidia bakom. Detta görs bäst med en fin gel loading spets.
- Tillsätt en droppe Vectashield att täcka ommatidia, lägg på ett täckglas och förslut med nagellack.
4. Representativa resultat:
Den goda utförande av protokollet ska lämna ett antal enstaka ommatidia och små grupper av ommatidia hålls samman av fragment av lamina men trevligt separerade på hornhinnan sidan. Dessa kan avbildas som i detta exempel att visualisera Atg8: GFP och Lysotracker, visar autophagosomes, lysosomer och autophagolysosomes (Fig. 3). Metoden kan användas för live-avbildning, men i detta fall är det värt att notera att autofluorescens av Schneiders mediet kommer att göra det svårt att skilja lågintensiv fluorescerande signaler. En ytterligare fråga är att pigmentkorn som sitter kvar på fotoreceptorer är intensivt fluorescerande, speciellt i den röda kanalen. En brightfield bild kan krävas för att skilja dem från äkta organeller.
Figur 1. Flödesschema för dissekering förfarandet för att erhålla enstaka ommatidia eller mindre grupper av ommatidia från flugan näthinnan.
Figur 2. Möjliga variationer av enkelt protokoll beskriver som innebär flyger genetik och åldrande uppströms dissekering och färgning eller odling upp till 24 timmar och drog nedströms administration av dissekering.
Figur 3 Confocal genomsökning av autophagosomes och lysosomer i en enda ommatidium skäras ut från AW, GMR-Gal4, UAS-Atro75QN, UAS-GFP:.: Atg8 / + fluga, som uttrycker en polyglutamine Atrophin mutant och åldrarna 12 dagar vid 29 ° C. Den brightfield panel (överst till höger) visar nästan intakt struktur ommatidium och ramen visar det skannade området. Röda märken lysosomer, grönt de autophagosomes, auto-lysosomer, vilket genom fusion av de två organeller, visas gult. De pilspetsar visar två pågående fusion händelser mellan autophagosomes och lysosomer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den enda ommatidium dissektion som presenteras här gör att insamlingen av djupare cellbiologiska information om processer som neurodegeneration, när modelleras i Drosophila ögat. Den fotoreceptor nervceller är mer lättillgängliga än andra nervceller och de cytoplasman är särskilt stor, och därför lämplig att studera vesikler dynamik, i samma celler som används skickligt i många modeller för att kvantifiera neurodegeneration in vivo. Den kritiska aspekten av dissektion är främst förmågan att utföra det på ofixerade vävnad som aldrig får utsättas för luft eller torka upp. Möjligheterna för expansion av denna grundläggande tekniken är sådana (Fig. 2) att det kan liksom revolutionera information från ögat modeller av neurodegeneration, vilket gör att alla typer av manipulationer möjligt i en primär neuronal kultur kopplad till den fantastiska genetiska modifieringar möjligt flugor .
I kombination med mosaik tekniker, mycket användbar i neurodegeneration studier 9 kan möjliggöra identifiering av cellbiologiska förändringar i en specifik del av mutant ommatidia, i närvaro av WT kontroller från samma flyga.
När dissekerade ommatidia hålls i kulturen, kan REPONSES att droger som rapamycin 10 eller parquat 11 vara bättre kontrolleras och kvantifieras än när det ges till levande flugor. Den största begränsningen i systemet utgörs av överlevnadstid för dissekerade ommatidia i kultur, som vi inte har kunnat expandera mycket längre än 24 timmar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Bernard Charroux för diskussioner. Detta arbete har finansierats av KCL Biomedicinska School.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Portable CO2 Dispenser | Flystuff | 59-150 | Refills also available |
| DUMONT Tweezer No 5 | Agar Scientific | T5034 | |
| 3-Well Glass Slide | EMS | 71561-01 | |
| Micro scissors | VWR international | HAMMHSB516-09 | |
| Schneider’s Medium | VWR international | 733-1663 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| Superfrost Slides | VWR international | 631-0108 | |
| Vectashield with Dapi | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Coverslips | VWR international | 631-1336 |
References
- Marsh, J. L., Thompson, L. M. Drosophila in the study of neurodegenerative disease. Neuron. 52, 169-178 (2006).
- Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
- Nisoli, I. Neurodegeneration by polyglutamine Atrophin is not rescued by induction of autophagy. Cell Death Differ. 17, 1577-1587 (2010).
- Charroux, B., Fanto, M. The fine line between waste disposal and recycling: DRPLA fly models illustrate the importance of completing the autophagy cycle for rescuing neurodegeneration. Autophagy. 6, 667-669 (2010).
- Hardie, R. C. Voltage-sensitive potassium channels in Drosophila photoreceptors. J Neurosci. 11, 3079-3095 (1991).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in neurosciences. 24, 251-254 (2001).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).
- Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila. Dev Biol. 351, 128-1234 (2011).
- Napoletano, F. Polyglutamine Atrophin provokes neurodegeneration in Drosophila by repressing fat. The EMBO journal. 30, 945-958 (2011).
- Ravikumar, B. Inhibition of mTOR induces autophagy and reduces toxicity of polyglutamine expansions in fly and mouse models of Huntington disease. Nature. 36, 585-595 (2004).
- Zou, S., Meadows, S., Sharp, L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genome-wide study of aging and oxidative stress response in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13726-13731 (2000).
