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Neuroscience

Único Drosophila Dissection omatídeo e Imagem

doi: 10.3791/2882 Published: August 19, 2011

Summary

O fator limitante no uso do adulto

Abstract

A mosca da fruta Drosophila melanogaster fez contribuições inestimáveis ​​para pesquisa em neurociência e tem sido amplamente utilizado como modelo para doenças neurodegenerativas por causa de sua genética poderosa 1. O olho da mosca em particular, tem sido o órgão de escolha para a pesquisa neurodegeneração, sendo a parte mais acessível e de vida dispensáveis ​​do sistema nervoso Drosophila. No entanto, a ressalva importante de olhos intactos é a dificuldade, por causa da intensa autofluorescência do pigmento, em eventos intracelulares de imagem, como a autofagia dinâmica 2, que são fundamentais para a compreensão da neurodegeneração.

Temos utilizado recentemente a dissecção ea cultura de omatídeos única 3 que tem sido essencial para a nossa compreensão das disfunções autofágica em um modelo de voar (DRPLA) 3 de Dentatorubro-Pallidoluysian Atrofia, 4.

Temos agora um relatório de descrição abrangente dessa técnica (Fig. 1), adaptado de estudos eletrofisiológicos 5, que é provável expandir dramaticamente a possibilidade de voar por modelos neurodegeneração. Este método pode ser adaptado a imagem ao vivo de eventos subcelulares e para monitorar a administração da droga eficaz para células fotorreceptoras (Fig. 2). Se usado em combinação com técnicas de mosaico 6-8, as respostas das células geneticamente diferentes podem ser testadas em paralelo (Fig. 2).

Protocol

1. Dissecção da retina Drosophila

  1. Preencher um poço de uma lâmina de vidro 3-Bem com tampão fosfato salina (PBS 1X), e depois anestesiar voa de CO 2. Os machos e as fêmeas podem ser utilizados para este experimento.
  2. Uma vez que as moscas são anestesiados, pegar uma única mosca usando uma pinça e solte-o no prato pequeno de PBS.
  3. De acordo com um escopo de dissecação, aperte a tromba com uma pinça, e depois retirar a cabeça do corpo, cortando o pescoço com um segundo conjunto de fórceps.
  4. Segurando a cabeça voar a partir do proboscis, cortado pela metade ao longo da linha média esquerda / direita a cabeça voar com microtesoura para revelar o cérebro.
  5. Use uma ponteira de corte para pegar a retina, e transferir para um segundo poço da lâmina de vidro 3-Bem cheio com meio Schneider.
  6. Primeiro, descascar mais da cutícula cabeça e em seguida, retire o cérebro com uma pinça. Manter a retina colada entre a lâmina ea córnea.
  7. Em seguida, transferir a retina em uma gota (50 ul) de médio Schnieder fresco colocado diretamente da lâmina de vidro.

2. Dissecção da omatídeos

  1. Dependendo do objetivo final da dissecção (se a imagem imediata ou cultura) e na óptica do microscópio de fluorescência (direto ou invertido), esta etapa pode ter lugar numa lâmina de microscópio ou uma placa de 24 poços. Para o objectivo final desta dissecção, a omatídeos serão dissecados diretamente sobre a lâmina de vidro.
  2. Compreender tanto o fim mais dorsal ou ventral da retina com uma pinça. Usando microtesoura, corte a retina na metade ao longo da linha média dorsal / ventral para expor os omatídeos no meio do olho.
  3. Continuar a se agarrar a retina de tal forma que a córnea é voltado para baixo ea lâmina é virada para cima. Usando uma agulha de tungstênio fino, retire o omatídeos da lâmina e da córnea.
  4. Omatídeos individuais e grupos de omatídeos irá recolher no fundo do poço ou slide. Remova todos os maiores detritos que possam ter recolhido antes de prosseguir.

3. Coloração, tratamento e imagem

  1. Para analisar a autofagia, diluir 1:1000 Lyso Tracker na queda Schneider (primeiro diluir 1:10 em Schneider e adicione 0,5 mL para a queda no slide), misture e aguarde 10 segundos.
  2. Retire o excesso de líquido a partir do slide, tendo o cuidado de deixar para trás o omatídeos. Este é o melhor feito com uma ponta fina de gel loading.
  3. Adicionar uma gota de Vectashield para cobrir os omatídeos, cobrir com uma lamela e selar com verniz.

4. Resultados representativos:

A boa execução do protocolo deve deixar um número de omatídeos individuais e de pequenos grupos de omatídeos mantidos juntos por fragmentos de lâmina, mas bem separada do lado da córnea. Estes podem ser visualizados como neste exemplo para visualizar Atg8: GFP e Lyso Tracker, mostrando autofagossomas, lisossomos e autophagolysosomes (Fig. 3). O método pode ser usado para geração de imagens ao vivo, no entanto, neste caso, é de notar que a autofluorescência de meio Schneider fará com que seja difícil de distinguir os sinais de baixa intensidade fluorescente. Um problema adicional é que os grânulos de pigmento que permanecer solidários com os fotorreceptores são intensamente fluorescentes, especialmente no canal vermelho. Uma imagem de campo claro pode ser necessária para distingui-las das organelas genuíno.

Figura 1
Figura 1. Fluxograma do procedimento de dissecção para obter omatídeos individuais ou pequenos grupos de omatídeos da retina voar.

Figura 2
Figura 2. Variações possíveis do protocolo simples descrevem que envolvem genética da mosca e envelhecimento upstream da dissecção e coloração ou cultura para até 24 horas ea jusante de drogas de administração da dissecção.

Figura 3
Figura 3 varredura confocal de autofagossomas e lisossomos em um único omatídeo dissecados de aw; GMR-Gal4, UAS-Atro75QN; UAS-GFP:.: Atg8 / fly +, expressando uma poliglutaminas Atrophin mutante e com idades entre 12 dias a 29 ° C. O painel de campo claro (à direita) exibe a estrutura quase intacta da omatídeo eo quadro indica a área digitalizada. Os lisossomos marcas vermelhas, verdes do autofagossomas, auto-lisossomos, resultando pela fusão das duas organelas, aparecem amarelo. Das setas indicam dois eventos de fusão em curso entre autofagossomas e lisossomos.

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Discussion

A dissecção omatídeo única apresentada aqui permite a coleta de informações mais profundas sobre os processos biológicos celulares, como neurodegeneração, quando modelada no olho Drosophila. Os neurônios fotorreceptores são mais facilmente acessível do que outros neurônios e eles citoplasma é particularmente grande, e, portanto, adequado para estudar a dinâmica da vesícula, nas células mesma usada eficientemente em muitos modelos para quantificar neurodegeneração in vivo. O aspecto crítico da dissecção é principalmente a capacidade de realizá-la no tecido não fixo que nunca deve ser exposto ao ar ou secar. As possibilidades de expansão desta técnica básica são tais (Fig. 2) que pode também revolucionar a informação obtida a partir de modelos de neurodegeneração olho, permitindo que todos os tipos de manipulações possíveis em uma cultura primária de neurônios acoplado à modificações genéticas incrível possível em moscas .

Em combinação com técnicas de mosaico, extremamente útil em estudos de neurodegeneração 9 pode permitir a identificação de célula alterações biológicas em um subconjunto específico de mutantes omatídeos, na presença de controles de peso da mosca mesmo.

Quando dissecados omatídeos são mantidos em cultura, reponses a drogas como a rapamicina 10 ou parquat 11 pode ser melhor controlada e quantificada do que quando administrado a moscas vivas. A principal limitação do sistema é constituído pelo tempo de sobrevivência dos omatídeos dissecada em cultura, que não temos sido capazes de se expandir muito além de 24 horas.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Agradecemos a Bernard Charroux para as discussões. Este trabalho foi financiado pela Escola KCL Biomédica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Portable CO2 Dispenser Flystuff 59-150 Refills also available
DUMONT Tweezer No 5 Agar Scientific T5034
3-Well Glass Slide EMS 71561-01
Micro scissors VWR international HAMMHSB516-09
Schneider’s Medium VWR international 733-1663
LysoTracker Red DND-99 Invitrogen L7528
Superfrost Slides VWR international 631-0108
Vectashield with Dapi Vector Laboratories H-1200
Coverslips VWR international 631-1336

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References

  1. Marsh, J. L., Thompson, L. M. Drosophila in the study of neurodegenerative disease. Neuron. 52, 169-178 (2006).
  2. Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
  3. Nisoli, I. Neurodegeneration by polyglutamine Atrophin is not rescued by induction of autophagy. Cell Death Differ. 17, 1577-1587 (2010).
  4. Charroux, B., Fanto, M. The fine line between waste disposal and recycling: DRPLA fly models illustrate the importance of completing the autophagy cycle for rescuing neurodegeneration. Autophagy. 6, 667-669 (2010).
  5. Hardie, R. C. Voltage-sensitive potassium channels in Drosophila photoreceptors. J Neurosci. 11, 3079-3095 (1991).
  6. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in neurosciences. 24, 251-254 (2001).
  7. Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).
  8. Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila. Dev Biol. 351, 128-1234 (2011).
  9. Napoletano, F. Polyglutamine Atrophin provokes neurodegeneration in Drosophila by repressing fat. The EMBO journal. 30, 945-958 (2011).
  10. Ravikumar, B. Inhibition of mTOR induces autophagy and reduces toxicity of polyglutamine expansions in fly and mouse models of Huntington disease. Nature. 36, 585-595 (2004).
  11. Zou, S., Meadows, S., Sharp, L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genome-wide study of aging and oxidative stress response in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13726-13731 (2000).
Único<em> Drosophila</em> Dissection omatídeo e Imagem
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Volpi, V., Mackay, D., Fanto, M. Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging. J. Vis. Exp. (54), e2882, doi:10.3791/2882 (2011).More

Volpi, V., Mackay, D., Fanto, M. Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging. J. Vis. Exp. (54), e2882, doi:10.3791/2882 (2011).

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