Summary
यहाँ हम सरल सेल संस्कृतियों और सरल परीक्षणों में hypoxia प्रेरित करने के लिए संस्कृतियों के hypoxic स्थिति का मूल्यांकन तरीकों का प्रस्ताव है.
Abstract
Hypoxia कमी या अंगों, ऊतकों, या कोशिकाओं में ऑक्सीजन की कमी के रूप में परिभाषित किया गया है. ऑक्सीजन तनाव की यह कमी ऑक्सीजन (कारण अपर्याप्त रक्त वाहिका नेटवर्क, दोषपूर्ण रक्त वाहिका, और एनीमिया शामिल हैं) में एक कम आपूर्ति या ऑक्सीजन की एक वृद्धि की खपत की आपूर्ति (अचानक उच्च सेल प्रसार की दर की वजह से) के सापेक्ष के लिए कारण हो सकता है है . Hypoxia शारीरिक या जैसे 1-3, रुमेटी गठिया, atherosclerosis, आदि के रूप में ठोस कैंसर में वैकृत हो ... प्रत्येक ऊतकों और कोशिकाओं को एक अलग क्षमता के लिए इस नई शर्त के लिए अनुकूल हो सकता है. Hypoxia के दौरान, hypoxia inducible कारक अल्फा (HIF) स्थिर है और angiogenesis या 4 ऑक्सीजन के परिवहन में शामिल लोगों के रूप में विभिन्न जीनों को नियंत्रित. इस प्रोटीन की स्थिरीकरण hypoxia की एक बानगी है, इसलिए का पता लगाने HIF नियमित hypoxia 5-7 के लिए स्क्रीन के लिए प्रयोग किया जाता है .
इस अनुच्छेद में, हम दो सरल स्तनधारी सेल संस्कृतियों और सरल परीक्षणों में hypoxia प्रेरित करने के लिए इन कोशिकाओं की hypoxic स्थिति का मूल्यांकन तरीकों का प्रस्ताव है.
Protocol
1. CoCl 2 समाधान द्वारा प्रेरित Hypoxia
कोबाल्ट (द्वितीय) क्लोराइड hexahydrate (2 CoCl • 6 2 हे, 237.9 मेगावाट =) hypoxia-inducible कारक 1.3 8 के एक रासायनिक inducer है. यह उत्पाद है (100 मिलीग्राम / एमएल) पानी में घुलनशील है, एक स्पष्ट, लाल समाधान उपज है.
- बाँझ dd पानी में एक 25mm शेयर समाधान तैयार करने के लिए, (उपयोग करने से पहले तुरंत तैयार)
- 100μM के अंतिम एकाग्रता में 2 CoCl अपने नियमित रूप से सेल संस्कृति मीडिया में hypoxia प्रेरित का उपयोग करें.
- अपनी कोशिकाओं को CoCl 2 युक्त मीडिया जोड़ें और एक पारंपरिक इनक्यूबेटर में 24hours के लिए संस्कृतियों सेते (37 डिग्री सेल्सियस, 5% C0 2) .
ऊपर एकाग्रता सेल लाइनों हम परीक्षण किया है, लेकिन विभिन्न सांद्रता (करने के लिए एक खुराक पर निर्भर वक्र स्थापित) पर प्रत्येक कोशिका लाइन परीक्षण किया जाना चाहिए के रूप में अच्छी तरह के रूप में विभिन्न ऊष्मायन समय के क्रम में मादक पदार्थों से संबंधित विषाक्तता सीमा और परख अनुकूलन के लिए काम करता है.
2. मॉड्यूलर इनक्यूबेटर चैंबर में प्रेरित Hypoxia
- कम से कम दो (जुड़वां संस्कृति) समान सेल संस्कृतियों की तैयारी. सेल संस्कृतियों बोतल, प्लेटें, या संस्कृति बर्तन में हो सकता है. कक्ष खोलने के पहले दो सफेद प्लास्टिक चैम्बर (इंजेक्शन / hypoxic गैस purging के लिए इस्तेमाल किया ट्यूबों) और धीरे से इस्पात की अंगूठी दबाना खोलने जुड़ी ट्यूब पर स्थित clamps खुला.
- क्लैंप रिलीज. ढक्कन और ट्रे अब हटाया जा सकता है.
- Hypoxic कक्ष में सेल संस्कृति प्लेस. इसके अलावा एक पेट्री कक्ष में बाँझ पानी युक्त संस्कृतियों के पर्याप्त humidification प्रदान पकवान जगह है.
- नियंत्रण के रूप में "जुड़वां" normoxia में सेल संस्कृति रखें.
- सुनिश्चित करें कि आपके ट्रे और सुरक्षित नहीं चलती, और तब अपने ढक्कन के साथ चैम्बर बंद. सही ढंग से स्टील की अंगूठी दबाना स्थिति चैम्बर के hermetical बंद सुनिश्चित करने के लिए और इसे बंद.
- Hypoxia बनाने के लिए, एक "hypoxia टैंक" के लिए ट्यूबिंग हे 1% 2 गैस मिश्रण युक्त देते हैं. यदि आप एक प्रवाह मीटर है अपने टैंक से जुड़े सीधे अपने कक्ष (गैस टैंक प्रवाह मीटर कक्ष) से जोड़ा जाएगा. हम एक प्रवाह हमारे नियामक में शामिल मीटर का उपयोग करें.
- यह महत्वपूर्ण है के लिए सबसे दूर अगर कक्ष में ऑक्सीजन और अपने मीडिया में उपस्थित नहीं, ऐसा करने के 7-10 मिनट के लिए 20 लीटर प्रति मिनट की एक प्रवाह दर पर गैस की टंकी को खोलने के द्वारा चैम्बर फ्लश, तो जल्दी से बंद गैस प्रवाह और पूरी तरह से दोनों सफेद clamps के समापन के द्वारा चैम्बर बंद.
- एक पारंपरिक इनक्यूबेटर करने के लिए समय की अवधि के लिए वांछित कक्ष लौटें. यदि आप बड़े संस्कृतियों का उपयोग की अनुमति है, de-1 के लिए गैस संस्कृतियों में मीडिया - 2 घंटे और फिर फ्लश दोहराने.
उपरोक्त कदम निर्माता सिफारिशों '(Billups Rothenberg, इंक) पर आधारित हैं. सुनिश्चित करें कि आप गैस की टंकी ठीक सभी समय पर सुरक्षित हैं.
नोट:
- आदेश में 2 हे तो इसे फिर से गैस करने की सलाह दी है 1-3hours बाद चैम्बर एक बार मीडिया में निहित को समाप्त करने के लिए .
- ऊष्मायन 48hours की तुलना में लंबे समय के लिए यह भी फिर से गैस चैम्बर के लिए सलाह दी जाती है.
- ऑक्सीजन सेंसर (इलेक्ट्रोड / नापने का यंत्र) है कि अनुमति देते हैं 2 हे माप कोशिकाओं / चैम्बर में निहित / intracellular कक्ष 2 हे होते हैं) का एक और अधिक सटीक माप प्रदान करेगा .
- समय के विभिन्न लंबाई में संवर्धन कोशिकाओं के लिए एक समय वक्र बनाने के इष्टतम समय अपने विशेष कोशिकाओं में HIF-1α की अभिव्यक्ति का निर्धारण में मदद मिलेगी.
3. Hypoxia के मूल्यांकन
- HIF-1 पश्चिमी धब्बा के द्वारा α पता लगाने .
- अपने कक्ष फिर से खोलने के रूप में 2.2 खंड में वर्णित है और तुरंत बर्फ पर अपनी संस्कृतियों जगह.
- 5% की प्लेटों में एसडीएस समाधान के साथ hypoxia इलाज और गैर इलाज कोशिकाओं lyse तो ट्यूबों के लिए सेल lyzate हस्तांतरण, sonicate, सेल मलबे spindown और सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा.
- उपाय प्रोटीन एकाग्रता, बीसीए किट का उपयोग कर 5 मिनट के लिए लोड हो रहा है बफर और 95 में हीटिंग ° सी जोड़कर नमूना तैयार.
- एक 8% जेल एसडीएस polyacrylamide और nitrocellulose झिल्ली को हस्तांतरण पर Electrophorese प्रोटीन.
- कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए या 4 डिग्री सेल्सियस हिलनेवाला पर रात में पीबीएस में 5% गैर वसा शुष्क दूध झिल्ली युक्त और 0.1% बीच 20 ब्लॉक.
- 4 में एक ही बफर में विरोधी HIF-1α प्राथमिक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (1 / 600) के साथ रात भर Immunoblot ° सी.
- पीबीएस बीच 20 कमरे के तापमान, 5min हर बार और सेते में पीबीएस में एचआरपी माध्यमिक एंटीबॉडी (1 / 2000) + 0.1% बीच 20 के लिए 45 मिनट के साथ 0.1% से युक्त में 3 बार धोएं.
- पीबीएस 0.1% बीच 20 से युक्त कमरे के तापमान / 5min समय में 3 बार धोएं.
- पियर्स ईसीएल किट का प्रयोग करें और एक्स - रे फिल्म प्रोटीन बैंड शो
- Hypoxia उत्तरदायी तत्व (HRE).
HIF-1α एक दृश्य के लिए बाध्य बुलाया Hypoxia विनियमन तत्व (HRE) द्वारा कई जीन (यानी VEGF, ईपीओ) को नियंत्रित. मैं एक मार्कर जीन HRE से जुड़े का उपयोगटी संभव है HIF गतिविधि का पता लगाने के 9. इस विधि का उपयोग करने के लिए, पहले आप एक HRE-luciferase एक अभिकर्मक अपनी कोशिकाओं को अनुकूलित विधि का उपयोग प्लाज्मिड के साथ अपने कोशिकाओं transfect की जरूरत है. उदाहरण के लिए हम 2000 Lipofectamine इस्तेमाल किया. कक्ष के लिए कम से कम 4 घंटे ट्रांसफ़ेक्ट पहले hypoxia और normoxia में incubated की जरूरत है. इस बार डीएनए कोशिकाओं में प्रवेश करने के लिए इतना है कि इस दिशा में पहला कदम hypoxia से प्रभावित नहीं है की अनुमति देता है. luciferase संकेत luciferase परख किट का उपयोग कर पता चला है.- Hypoxia में अपने HRE - ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं या मॉड्यूलर कक्ष में सेते HRE - ट्रांसफ़ेक्ट 2 CoCl साथ incubated कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए, एक normoxia नियंत्रण शामिल हैं.
- वांछित ऊष्मायन अवधि के बाद, मध्यम विकास कोशिकाओं से हटा दें.
- पीबीएस में कोशिकाओं कुल्ला, Pbs हटा दें.
- संस्कृति डिश में 400μl 1X lysis अभिकर्मक बांटना और संलग्न कोशिकाओं परिमार्जन, तो उन्हें एक माइक्रो ट्यूब को हस्तांतरण.
- संक्षिप्त centrifugation द्वारा गोली मलबे.
- सेल के मिक्स 20μl luciferase परख अभिकर्मक के 100μl के साथ सतह पर तैरनेवाला lysates और उपाय एक luminometer का उपयोग luminescence.
4. प्रतिनिधि परिणाम:
K562 कोशिकाओं (मानव लेकिमिया सेल लाइन) में कम ऑक्सीजन में सभ्य 2 दिन normoxia की तुलना में, hypoxia के HIF-1α प्रोटीन है कि पश्चिमी धब्बा (चित्रा 1) के द्वारा पता लगाया गया था की वृद्धि लाती है.
उपयोग HRE-luciferase 293 कोशिकाओं (भ्रूण गुर्दे सेल लाइन) संशोधित hypoxia में सुसंस्कृत, HIF-1α गतिविधि की वृद्धि महत्वपूर्ण hypoxic कोशिकाओं में पाया गया था (चित्रा 2).
चित्रा 1: hypoxic कोशिकाओं में HIF-1α बढ़ाएँ. 48 घंटे के लिए K562 कोशिकाओं normoxia और hypoxia (hypoxic कक्ष) में संस्कृति और पश्चिमी धब्बा द्वारा HIF-1α के लिए एक विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग विश्लेषण. Actin के लिए एक एंटीबॉडी विशिष्ट लदान नियंत्रण के लिए इस्तेमाल किया गया था.
Figure2: गतिविधि HIF-1α. HRE luciferase संशोधित 293 कोशिकाओं और 48 घंटे के लिए hypoxia के normoxia में सुसंस्कृत थे और तब luciferase luciferase परख किट और एक luminometer का उपयोग कर संकेत का पता लगाने lysed. परिणाम रिश्तेदार luminescence इकाई (RLU) के रूप में व्यक्त कर रहे हैं.
Discussion
सेल और hypoxic परिस्थितियों में प्रसार व्यवहार्यता एक बहुत सेल प्रकार के आधार पर बदलती हैं. इसलिए, आप सेल नंबर या संस्कृतियों प्लेटें आप सुनिश्चित करें कि आप अपने प्रयोगों के लिए पर्याप्त कक्षों / प्रोटीन होगा बनाने के साथ शुरू की संख्या को समायोजित करना चाहिए.
कोबाल्ट क्लोराइड विधि के लिए सस्ती और तेजी से लाभ है. यह उत्पाद है HIF-1/3α inducing द्वारा hypoxia mimics लेकिन भी अन्य जीन को नियंत्रित कर सकते हैं, यकीन है कि इस उत्पाद के अन्य क्या प्रभाव यह समारोह और अपने विशेष कोशिकाओं के फेनोटाइप पर "नकल के स्वतंत्र रूप से हो सकता है की जाँच द्वारा अपनी परियोजना के लिए अनुकूलित है hypoxic प्रभाव ". एक और भी hypoxia नकल के लिए इस्तेमाल दवा Deferoxamine mesylate (डीएफओ, 100 सुक्ष्ममापी अंतिम एकाग्रता में प्रयोग किया जाता) है. इन दवाओं का उपयोग experimentator "hypoxic हालत को प्रभावित किए बिना संस्कृति की थाली / फ्लास्क / पकवान कई बार खोलने के लिए अनुमति देता है.
ऑक्सीजन गैस मिश्रण में निहित के स्तर अपने प्रयोगों और सेल प्रकार के आधार पर hypoxia के मूल्यों के रूप में ऊतकों और सेल प्रकार के आधार पर भिन्न भिन्न हो सकते हैं. दरअसल, कुछ कोशिकाओं को 5% में hypoxic हे 2 अन्य की जरूरत है कम से कम 1% 2 हे hypoxic जा रहे हैं. 5% सीओ 2 गैस मिश्रण करने के लिए जोड़ा जाता है संस्कृतियों के पीएच को स्थिर, गैस के बाकी आमतौर पर नाइट्रोजन है.
Hypoxic कक्षों दवाओं है कि सेल व्यवहार ऑक्सीजन तनाव की स्वतंत्र वैकल्पिक कर सकते हैं का उपयोग नहीं करने का लाभ है. हालांकि, प्रयोग के सभी प्रकार के ऑक्सीजन के रूप में प्रत्येक खोलने पर कक्ष फिर से प्रवेश करती है और इस तरह hypoxia कम किया जा सकता है. आप अपने प्रयोगों में इस पहलू पर विचार करना चाहिए; / पुनः oxygenation hypoxia एक विशिष्ट शर्त है कि कुछ प्रकार की कोशिकाओं को प्रभावित कर सकते हैं. एक विकल्प के लिए hypoxia (पूर्व मिश्रित गैस टैंक या गैस मिश्रण प्रणाली के लिए जुड़ा) workstations या बड़ा hypoxia इनक्यूबेटर (दस्ताना बॉक्स के साथ hypoxia प्रसंस्करण चैम्बर) है कि प्रयोग मीडिया को बदलने के लिए और सतत hypoxic वातावरण में कोशिकाओं में हेरफेर की अनुमति देता का उपयोग करने के लिए है. विभिन्न hypoxic कक्षों पिछले एक दशक से अधिक commercialized है और अपने प्रयोगशाला, परियोजनाओं, अंतरिक्ष, आकार बजट, और प्रयोग किया जाता अनुसार चुना जाना चाहिए. हमेशा अच्छा है और अपने कक्ष के उपयोग की स्थिति सुनिश्चित करने के लिए सही संस्कृति शर्तों की गारंटी है. सामान्य में एक कक्ष का उपयोग करते समय, hypoxia के स्तर पर विभिन्न गैस घोला जा सकता है (यानी 1%, 5% 10% ऑक्सीजन) का चयन करके modulated किया जा सकता.
HIF-1α का पता लगाने के बारे में, यह जानना महत्वपूर्ण है कि कुछ कैंसर कोशिका लाइन normoxia में व्यक्त HIF-1α. इसलिए यह महत्वपूर्ण है के लिए एक normoxia नियंत्रण का उपयोग करने के लिए इन सेल लाइनों में HIF के बेसल स्तर निर्धारित है. HIF-1α भी सेल उत्तेजना या तनाव के बाद गैर घातक कोशिकाओं में normoxia में मौजूद हो सकता है. यह भी अगर इन कोशिकाओं को भूखे हैं हो सकता है यकीन है कि अपने सेल संस्कृतियों ठीक और फ़ीड कर रहे हैं बनाए रखा.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-HIF-1α | Invitrogen | 458400 | |
| Cobalt (II) Chloride | Sigma-Aldrich | C8661-25G | |
| Incubator Chamber | Billups-Rothenberg, Inc. | MIC-101 | |
| HRE-Luciferase plasmid | Addgene | Plasmid 26731 |
References
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