Summary
Hier hebben we voorstellen eenvoudige methoden om hypoxie te induceren in celkweken en eenvoudige tests om de hypoxische status van de culturen te evalueren.
Abstract
Hypoxie is gedefinieerd als de vermindering of gebrek aan zuurstof in organen, weefsels en cellen. Deze daling van zuurstof spanning kan te wijten zijn aan een verminderde aanvoer van zuurstof (oorzaken zijn onvoldoende bloedvat netwerk, defecte bloedvat, en bloedarmoede) of een verhoogd verbruik van zuurstof ten opzichte van het aanbod (veroorzaakt door een plotselinge hogere celproliferatie tarief) . Hypoxie kan worden fysiologische of pathologische, zoals in vaste kanker 1-3, reumatoïde artritis, atherosclerose etc ... Elke weefsels en cellen hebben een andere staat aan te passen aan deze nieuwe voorwaarde. Tijdens de hypoxie, is hypoxia-induceerbare factor-alfa (HIF), die stabiel en regelt verschillende genen, zoals die betrokken zijn bij angiogenese of transport van zuurstof 4. De stabilisering van dit eiwit is een kenmerk van hypoxie, dus het detecteren van HIF wordt routinematig gebruikt om te screenen op hypoxie 5-7.
In dit artikel stellen we twee eenvoudige methoden om hypoxie te induceren in zoogdiercellen culturen en eenvoudige tests om de hypoxische status van deze cellen te evalueren.
Protocol
1. Hypoxie veroorzaakt door CoCl 2-oplossing
Kobalt (II) Chloride hexahydraat (CoCl 2 • 6H 2 O, MW = 237,9) is een chemische inductor van hypoxie-induceerbare factor-1.3 8. Dit product is oplosbaar in water (100 mg / ml), waardoor een heldere, rode oplossing.
- Bereid een 25mm voorraad oplossing in steriel dd water, (onmiddellijk voor te bereiden voor gebruik)
- Gebruik CoCl 2 op de uiteindelijke concentratie van 100 urn in uw reguliere media voor celkweek tot hypoxie veroorzaken.
- Voeg de CoCl 2 bevattende media aan je cellen en incubeer de culturen voor 24 uur in een conventionele incubator (37 ° C, 5% C0 2).
De bovenstaande concentratie werkt voor de cellijnen die we hebben getest, maar elke cel lijn moet worden getest bij verschillende concentraties (om een dosis-afhankelijke curve te stellen), evenals op de verschillende incubatie tijden om drugsgerelateerde toxiciteit te beperken en optimaliseren van de test.
2. Hypoxie geïnduceerd in Modulair Incubator Kamer
- Bereid ten minste twee identieke (twin cultuur) celculturen. Celculturen kunnen worden in vaten, borden of cultuur gerechten. Voor het openen van de kamer, opent u eerst de twee witte plastic klemmen op de buizen bevestigd aan de kamer (buizen gebruikt voor de injectie / zuiveren van het hypoxische gas) en open voorzichtig de stalen ring klem.
- Laat de klem. Het deksel en bakken kunnen nu worden verwijderd.
- Plaats de celcultuur in de hypoxische kamer. Ook plaats een petrischaal met steriele water in de kamer om een adequate bevochtiging van de culturen te bieden.
- Plaats de "tweeling" celkweek in normoxia als controle.
- Zorg ervoor dat uw trays zijn beveiligd en niet bewegen, en sluit daarna de kamer met zijn deksel. De juiste positie van de stalen ring klem om de hermetische afsluiting van de kamer te verzekeren en te sluiten.
- Voor het maken van hypoxie, bevestig de slang aan op een "hypoxie tank" met een 1% O 2 gasmengsel. Als u een flow meter is aangesloten op uw tank uw kamer zal direct worden aangesloten op het (gas tank-flow meter-kamer). We maken gebruik van een flow meter opgenomen in onze regulator.
- Het is belangrijk om de meeste te verwijderen, zo niet alle aanwezige zuurstof in de kamer en in uw media, om dit te doen spoelen van de kamer door het openen van de gas tank met een debiet van 20 liter per minuut gedurende 7-10 minuten, daarna snel uit te schakelen van de gasstroom en volledig de kamer dicht bij het sluiten van beide witte klemmen.
- Ga terug de kamer om een conventionele incubator voor de gewenste periode. Als u grote culturen, laat de media in de cultuur om de-gas voor 1 - 2 uur en daarna spoelen te herhalen.
De bovenstaande stappen zijn gebaseerd op de constructor aanbevelingen '(Billups-Rothenberg, Inc). Zorg ervoor dat je benzinetank goed beveiligd te allen tijde.
Opmerkingen:
- Om de O 2 in de media is geadviseerd om opnieuw gas de kamer een keer na een drie uur-te elimineren.
- Voor incubatietijd langer dan 48 uur is het ook aangeraden om opnieuw gas de kamer.
- Zuurstof sensoren (elektroden / manometer) die het mogelijk maken metingen van de O 2 in cellen / kamer zal zorgen voor een meer nauwkeurige meting van de intracellulaire / kamer O 2 bevatten).
- Kweken van cellen die op verschillende tijdstippen moeite om een tijd-curve te maken zou helpen bij het bepalen van de optimale tijd expressie van HIF-1α in uw cellen.
3. Evaluatie van Hypoxie
- HIF-1 α detectie door western blot.
- Opnieuw te openen uw kamer zoals beschreven in paragraaf 2.2 en onmiddellijk uw culturen op ijs.
- Lyse hypoxie worden behandeld en niet-behandelde cellen met 5% SDS-oplossing in de platen vervolgens overbrengen naar de cel lyzate buizen, ultrasone trillingen, spindown de cel puin en het verzamelen van de supernatant.
- Meet eiwitconcentratie met behulp van BCA kit, voor te bereiden monsters door het toevoegen van laadbuffer en de verwarming op 95 ° C gedurende 5 minuten.
- Electrophorese eiwitten op een 8% SDS-polyacrylamide gel en transfer naar nitrocellulosemembranen.
- Blokkeren de membraan in PBS dat 5% niet-vette droge melk en 0,1% Tween 20 bij kamertemperatuur gedurende 1 uur of bij 4 ° C gedurende de nacht op shaker.
- Immunoblot 's nachts met anti-HIF-1α primair monoklonaal antilichaam (1 / 600) in dezelfde buffer bij 4 ° C.
- Was drie keer in PBS met 0,1% Tween 20 bij kamertemperatuur, 5min telkens en incubeer met HRP-secundair antilichaam (1 / 2000) in PBS + 0,1% Tween 20 gedurende 45 minuten.
- Was drie keer in PBS met 0,1% Tween 20 bij kamertemperatuur, 5min / tijd.
- Gebruik Pierce ECL-kit en X-ray film aan het eiwit band tonen
- Hypoxie reagerende element (HRE).
HIF-1α regelt een groot aantal genen (dat wil zeggen VEGF, EPO) door binding aan een serie genaamd Hypoxie Regulering Element (HRE). Met behulp van HRE geassocieerd met een marker-gen it is het mogelijk om HIF-activiteit te detecteren 9. Voor het gebruik van deze methode, moet u eerst uw cellen transfecteren met een HRE-luciferase plasmide met behulp van een transfectie methode aangepast aan uw cellen. Zo gebruikten we Lipofectamine 2000. Cellen moeten worden getransfecteerd minstens 4 uur voor te worden geïncubeerd in hypoxie en normoxia. Deze keer kan het DNA van de cellen in te voeren, zodat deze eerste stap wordt niet beïnvloed door hypoxie. De luciferase signaal wordt gedetecteerd met behulp van een Luciferase Assay Kit.- Incubeer uw HRE-getransfecteerde cellen in hypoxie in modulaire kamer of gebruik HRE-getransfecteerde cellen geïncubeerd met CoCl 2, omvatten een normoxia controle.
- Na de gewenste incubatietijd, verwijder de groei medium van cellen.
- Spoel cellen in PBS, verwijder de PBS.
- Verdeel 400μl 1X lysis reagens in de cultuur schotel en schraap de bijgevoegde cellen, vervolgens overbrengen naar een micro-tube.
- Pellet puin door korte centrifugeren.
- Mix 20μl van cellysaten supernatant met 100μl van luciferase assay reagens en het meten van de luminescentie met behulp van een luminometer.
4. Representatieve resultaten:
In K562 cellen (humane leukemie cellijn) gecultiveerde twee dagen bij weinig zuurstof, in vergelijking met normoxia, hypoxie leidt tot een toename van HIF-1α eiwit dat werd gedetecteerd door western blot (figuur 1).
Met behulp van HRE-luciferase aangepaste 293-cellen (embryonale nier cellijn) gekweekt in hypoxie, een significante toename van HIF-1α activiteit werd gedetecteerd in hypoxische cellen (figuur 2).
Figuur 1: Verhoging van HIF-1α in hypoxische cellen. K562 cellen werden in cultuur normoxia en hypoxie (hypoxische kamer) voor 48 uur en geanalyseerd door western blot met behulp van een antilichaam dat specifiek is voor HIF-1α. Een antilichaam dat specifiek is voor actine werd gebruikt voor het laden te controleren.
Figuur 2: HIF-1α activiteit. HRE-luciferase aangepaste 293-cellen werden gekweekt in hypoxie en normoxia voor 48 uur en daarna gelyseerd met luciferase-signaal met behulp van een luciferase assay kit en een luminometer detecteren. De resultaten worden uitgedrukt als de relatieve luminescentie eenheid (RLU).
Discussion
Celproliferatie en levensvatbaarheid in hypoxische omstandigheden nogal variëren, afhankelijk van de celtypen. Daarom moet u de cel of het nummer van de culturen platen je begint met ervoor zorgen dat je genoeg cellen / eiwitten hebben voor uw experimenten.
De Cobalt Chloride methode heeft het voordeel om goedkoop en snel. Dit product bootst hypoxie door het induceren van HIF-1/3α maar kunnen ook andere genen reguleren, zorg ervoor dat het product wordt aangepast aan uw project door te kijken welke andere effecten onafhankelijk van elkaar kan hebben voor de functie en fenotype van uw specifieke cellen van het "na te bootsen, hypoxische "effect. Een ander geneesmiddel ook gebruikt voor de hypoxie na te bootsen is deferoxamine mesylaat (DFO, gebruikt bij 100 uM eindconcentratie). Het gebruik van deze drugs kan de experimentator met de cultuur plaat / schaal / fles vele malen te openen zonder dat de "hypoxische toestand".
Het niveau van zuurstof in het gasmengsel kan variëren afhankelijk van uw experimenten en celtypes als hypoxie waarden variëren afhankelijk van de weefsels en celtypes. Inderdaad, sommige cellen hypoxische in 5% O 2 andere hebben minder dan 1% O 2 wordt hypoxie. 5% CO 2 wordt toegevoegd aan het gasmengsel om de pH van de culturen te stabiliseren, is de rest van het gas meestal stikstof.
Hypoxische kamers hebben het voordeel van het niet gebruiken van drugs die cel gedrag kan afwisselen onafhankelijk van de zuurstofspanning. Echter, niet alle types van experimenten worden gedaan als zuurstof weer in de kamer bij elke opening en dus vermindert hypoxie. Je zou kunnen overwegen deze factor in uw experimenten, hypoxie / re-oxygenatie is een specifieke aandoening die kan invloed hebben op bepaalde celtypen. Een alternatief is het gebruik van hypoxie werkstations (aangesloten op pre-mixed gas tanks of op gas mengsystemen) of groter hypoxie incubator (hypoxie verwerking van kamer met handschoenenkastje), waarmee de experimenten om media te veranderen en cellen te manipuleren in continue hypoxische omgeving. Diverse hypoxische kamers werden gecommercialiseerd de afgelopen tien jaar en dient te worden gekozen op basis van uw laboratorium gebruikte, projecten, ruimte, grootte en budget. Zorg altijd dat het goed gebruik en de conditie van uw Kamer om de juiste kweekomstandigheden te garanderen. In het algemeen bij het gebruik van een kamer, kan het niveau van hypoxie worden gemoduleerd door het selecteren van de verschillende gasmengsels (dwz 1%, 5% 10% zuurstof).
Wat betreft de detectie van HIF-1α, is het belangrijk te weten dat sommige kanker cellijn te uiten HIF-1α in normoxia. Het is daarom van cruciaal belang voor een normoxia-control te gebruiken om de basale niveau van HIF in deze cellijnen te bepalen. HIF-1α kunnen ook aanwezig in normoxia in niet-maligne cellen worden na cel stimulatie of stress. Dit kan ook optreden als deze cellen worden uitgehongerd, zorg ervoor dat je celkweken goed voeden en onderhouden.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-HIF-1α | Invitrogen | 458400 | |
| Cobalt (II) Chloride | Sigma-Aldrich | C8661-25G | |
| Incubator Chamber | Billups-Rothenberg, Inc. | MIC-101 | |
| HRE-Luciferase plasmid | Addgene | Plasmid 26731 |
References
- Swinson, D. E., O'Byrne, K. J. Interactions between hypoxia and epidermal growth factor receptor in non-small-cell lung cancer. Clin Lung Cancer. 7, 250-256 (2006).
- van Laarhoven, H. W. Hypoxia in relation to vasculature and proliferation in liver metastases in patients with colorectal cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 64, 473-482 (2006).
- Hockel, M. Intratumoral pO2 predicts survival in advanced cancer of the uterine cervix. Radiother Oncol. 26, 45-50 (1993).
- Semenza, G. L. HIF-1 and human disease: one highly involved factor. Genes Dev. 14, 1983-1991 (2000).
- Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1: master regulator of O2 homeostasis. Curr Opin Genet Dev. 8, 588-594 (1998).
- Tatum, J. L. Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy. Int J Radiat Biol. 82, 699-757 (2006).
- Brahimi-Horn, M. C., Pouyssegur, J. HIF at a glance. J Cell Sci. 122, 1055-1057 (2009).
- Piret, J. P., Mottet, D., Raes, M., Michiels, C. CoCl2, a chemical inducer of hypoxia-inducible factor-1, and hypoxia reduce apoptotic cell death in hepatoma cell line HepG2. Ann N Y Acad Sci. 973, 443-447 (2002).
- Emerling, B. M., Weinberg, F., Liu, J. L., Mak, T. W., Chandel, N. S. PTEN regulates p300-dependent hypoxia-inducible factor 1 transcriptional activity through Forkhead transcription factor 3a (FOXO3a). Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 2622-2627 (2008).
