Summary
Здесь мы предлагаем простые методы, чтобы вызвать гипоксию в клеточных культурах и простые тесты для оценки гипоксического статуса культур.
Abstract
Гипоксия определяется как снижение или отсутствие кислорода в органы, ткани или клеток. Это снижение напряжения кислорода может быть связано с сокращение предложения в кислороде (причины включают недостаточное сеть кровеносных сосудов, дефектных кровеносных сосудов, анемия), либо к увеличению потребления кислорода относительно поставок (вызванное внезапным выше скорость размножения клеток) . Гипоксия может быть физиологическим или патологическим, например, в солидных раков 1-3, ревматоидный артрит, атеросклероз и т.д. ... Каждый тканей и клеток имеют различную способность адаптироваться к этим новым условиям. Во время гипоксии, гипоксии индуцибельной альфа-фактора (HIF) стабилизируется и регулирует различных генов, таких как тех, кто участвует в ангиогенезе или перенос кислорода 4. Стабилизация этого белка является отличительной чертой гипоксии, поэтому обнаружение HIF обычно используется для выявления гипоксии 5-7.
В этой статье мы предлагаем две простые методы, чтобы вызвать гипоксию в культурах клеток млекопитающих и простые тесты для оценки гипоксического состояния этих клеток.
Protocol
1. Гипоксия индуцированных CoCl 2 решения
Кобальта (II) хлорид гексагидрат (CoCl 2 • 6H 2 O, MW = 237,9) является химического индуктора гипоксия-индуцируемый фактор-1.3 8. Этот продукт растворим в воде (100 мг / мл), что дает ясный, красный раствор.
- Подготовка 25 мМ маточного раствора в стерильной воде дд, (готовить непосредственно перед употреблением)
- Используйте CoCl 2 в конечной концентрации 100 мкм в регулярных средах культуре клеток, чтобы вызвать гипоксию.
- Добавить CoCl 2, содержащих средства массовой информации со своими клетками и инкубировать культур на 24 часов в обычных инкубатор (37 ° С, 5% С0 2).
Выше концентрация работает на клеточных линиях, мы проверили, но каждой клеточной линии должны быть проверены в различных концентрациях (установить дозозависимый кривой), а также в разное время инкубации с целью ограничения, связанные с наркотиками токсичности и оптимизации анализа.
2. Гипоксия, индуцированной в модульной инкубатор палаты
- Подготовка по крайней мере два одинаковых (две культуры) клеточных культурах. Клеточные культуры могут быть в контейнерах, тарелки или культуры блюд. Чтобы открыть камеру, сначала откройте две белые пластиковые зажимы расположены на трубках прилагается к камере (трубы, используемые для инъекций / чистки гипоксических газа) и осторожно откройте зажим стальное кольцо.
- Отпустите зажим. Крышки и лотки теперь могут быть удалены.
- Место культуры клеток в гипоксической камере. Также место чашки Петри со стерильной водой в камере обеспечить адекватное увлажнение культур.
- Место "близнецов" в культуре клеток нормоксии в качестве контроля.
- Убедитесь, что ваш лотки закреплены и не движется, а затем закройте камеру с крышкой. Правильно положение зажима стальное кольцо для обеспечения герметичной закрытия камеры и закройте его.
- Чтобы создать гипоксии, приложите трубку к "гипоксия бак", содержащий 1% O 2 газовой смеси. Если у вас есть расходомер, подключенных к вашей камере танк будет иметь прямое отношение к нему (бензобак-расходомер-камеры). Мы используем расходомер включены в наш регулятор.
- Важно, чтобы удалить большинство, если не весь кислород присутствует в камере и в средствах массовой информации, сделать это флеш камере, открыв бензобак при скорости потока 20 литров в минуту в течение 7-10 минут, затем быстро выключить газа и полностью закрыть камеру, закрывая как белые, так зажимов.
- Вернуться к камере обычного инкубатор для желаемого периода времени. Если вы используете большой культуры, позволяют средства массовой информации в культур-де-газ в течение 1 - 2 часа, а затем повторить флеш.
Выше действия основаны на рекомендациях конструктор »(Биллапс-Ротенберг, Inc). Убедитесь, что вы топливный бак надежно закреплены на все времена.
Примечания:
- В целях устранения O 2, содержащихся в средствах массовой информации рекомендуется повторно газа камере сразу же после 1-3 часа.
- За время инкубации дольше, чем 48hours это также рекомендуется повторно газе камеры.
- Кислородные датчики (электроды / манометр), которые позволяют измерения О 2, содержащегося в клетках / камера обеспечит более точное измерение внутриклеточного / камеры O 2 содержат).
- Культивирование клеток на различных длинах время, чтобы раз-кривой поможет определить оптимальное время выражение HIF-1α в вашей конкретной клетки.
3. Оценка Гипоксия
- HIF-1 α обнаружения иммуноблоттинга.
- Снова откройте вашу камеру, как описано в разделе 2.2 и сразу же разместить культур на льду.
- Lyse гипоксии лечение и необработанными клетками с 5% SDS решение в пластинах затем передать ячейки лизат для труб, разрушать ультразвуком, spindown ячейки мусором и собирать супернатант.
- Мера концентрации белка использованием BCA комплект, подготовить образец путем добавления буфера загрузки и отопления при температуре 95 ° С в течение 5 мин.
- Electrophorese белков на 8% SDS-полиакриламидном геле и трансфер в нитроцеллюлозных мембран.
- Блок мембраны в PBS, содержащем 5% обезжиренного сухого молока и 0,1% Твин-20 при комнатной температуре в течение 1 часа при температуре 4 ° С в течение ночи на шейкере.
- Вестернблот ночь с анти-HIF-1α первичных моноклональных антител (1 / 600) в том же буфере при 4 ° C.
- Промыть 3 раза в PBS, содержащем 0,1% Твин-20 при комнатной температуре, 5мин каждый раз, инкубировать с HRP-вторичными антителами (1 / 2000) в PBS + 0,1% Твин-20 в течение 45 мин.
- Промыть 3 раза в PBS, содержащем 0,1% Твин-20 при комнатной температуре, 5 мин / времени.
- Используйте Пирс ECL комплект и рентгеновской пленки, чтобы показать белка группы
- Гипоксия Отзывчивый Element (HRE).
HIF-1α регулирует многочисленные гены (например, VEGF, EPO), связываясь с последовательностью называется гипоксия регулирующий элемент (HRE). Использование области прав человека, связанные с маркерный ген ят можно обнаружить HIF деятельности 9. Чтобы использовать этот метод, сначала нужно для трансфекции клеток с вашей HRE-люциферазы плазмиды использованием метода трансфекции адаптированы к вашим клеткам. Например, мы использовали Lipofectamine 2000 года. Клетки должны быть трансфицированных не менее 4 часов, прежде чем быть инкубировали при гипоксии и нормоксии. Это время позволяет ввести ДНК клеток так, чтобы этот первый шаг не зависит от гипоксии. Люциферазы сигнала определяется с помощью люциферазы Kit анализа.- Инкубируйте ваш HRE-трансфекции клеток в гипоксии в модульной камеры или использовать HRE-трансфекции клетки инкубировали с CoCl 2, включают контроль нормоксии.
- После желаемого инкубации удалить питательную среду из клеток.
- Промыть клеток в PBS, удалить PBS.
- Внесите 400μl 1X реагента лизис в культуре блюдо и скрести прилагается клеток, а затем передавать их на микро трубки.
- Гранул мусора краткие центрифугирования.
- Смешать 20 мкл надосадочной клеточных лизатов с 100 мкл реагента люциферазы Анализ и измерения люминесценции использованием люминометра.
4. Представитель Результаты:
В клетках К562 (линии клеток человека лейкемия) культурный 2 дня в странах с низким кислорода, по сравнению с нормоксии, гипоксия вызывает увеличение HIF-1α белок, который был обнаружен иммуноблоттинга (рис. 1).
Использование HRE-люциферазы модифицированный 293 клеток (эмбриональные линии клеток почек) культивировали в гипоксией, значительное увеличилось на HIF-1α активность была обнаружена в гипоксических клеток (рис. 2).
Рисунок 1: Увеличить HIF-1α в гипоксических клеток. К562 Клетки культуры в нормоксии и гипоксии (гипоксическая камеры) в течение 48 часов и анализируется иммуноблоттинга использованием антител, специфичных для HIF-1α. Антитела, специфичные для актин был использован для управления загрузкой.
Figure2: HIF-1α деятельности. HRE-293 люциферазы изменение клетки культивировали в условиях гипоксии и нормоксии в течение 48 часов, а затем разрушается для обнаружения сигнала с помощью люциферазы люциферазы набор анализов и люминометра. Результаты выражаются в относительных единицах свечения (РГ).
Discussion
Клеточную пролиферацию и жизнеспособность в условиях гипоксии очень сильно варьируются в зависимости от типа клеток. Поэтому, вы должны настроить номер мобильного или номер культур пластин вы начинаете с, чтобы убедиться, у вас будет достаточно клеток / белки для ваших экспериментов.
Кобальта методом хлорид имеет то преимущество, чтобы быть недорогим и быстрым. Этот продукт имитирует гипоксии, вызывая HIF-1/3α, но может также регулирует иные гены, убедитесь, что этот продукт адаптирован к проекту, отметив, что другие последствия это может иметь для функции и фенотип вашей клетки независимо от "имитируют- гипоксических "эффект. Другой препарат также используется для имитации гипоксии дефероксамин мезилата (ДФО, используемых при 100 мкМ конечной концентрации). Применение этих препаратов позволяет экспериментатор, чтобы открыть пластины культура / блюда / колбу много раз, не затрагивая "гипоксического состояния".
Уровень кислорода, содержащегося в газовой смеси может варьироваться в зависимости от ваших экспериментов и типы клеток, как гипоксия значения изменяются в зависимости от ткани и типы клеток. Действительно, некоторые клетки гипоксических в 5% O 2 других нуждаются в меньшем количестве, чем 1% O 2, который будет гипоксических. 5% CO 2 добавляется в смеси газов для стабилизации рН культур, остальные газ обычно азота.
Гипоксическая камеры имеют то преимущество, не употребляющих наркотики, которые могут чередоваться поведение клеток независимо от напряжения кислорода. Тем не менее, не все виды экспериментов можно сделать, как кислород возвращается в камере при каждом открытии и тем самым уменьшает гипоксию. Вы должны учесть этот фактор в своих экспериментов; гипоксия / повторного оксигенации является специфическим условием, что может повлиять на некоторые типы клеток. Альтернативой является использование гипоксии рабочих станций (подключенных к предварительно смешанной танков газа или смеси газов систем) или больше гипоксии инкубатора (гипоксия камеры обработки перчаточном ящике), что позволяет экспериментов изменить средств массовой информации и манипулирования клеток в непрерывной гипоксической среде. Различные гипоксических камерах были коммерциализированы в течение последнего десятилетия и должны быть выбраны в соответствии с Вашей лаборатории использовали, проекты, пространства, размера и бюджета. Всегда проверяйте, хорошо использовать и состояние вашей камере, чтобы гарантировать правильное условиях культуры. В целом при использовании камеры, уровень гипоксии можно модулировать, выбрав различные смеси газов (например, 1%, 5% 10% кислорода).
Что касается обнаружения HIF-1α, важно знать, что некоторые линии раковых клеток выразить HIF-1α в нормоксии. Поэтому крайне важно использовать нормоксии-контроль для определения базального уровня HIF в этих клеточных линиях. HIF-1α могут также присутствовать в нормоксии в доброкачественных клеток после стимуляции клеток или стресса. Это также может произойти, если эти клетки голодали, убедитесь, что ваш клеточных культурах правильно питаться и поддерживать.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-HIF-1α | Invitrogen | 458400 | |
| Cobalt (II) Chloride | Sigma-Aldrich | C8661-25G | |
| Incubator Chamber | Billups-Rothenberg, Inc. | MIC-101 | |
| HRE-Luciferase plasmid | Addgene | Plasmid 26731 |
References
- Swinson, D. E., O'Byrne, K. J. Interactions between hypoxia and epidermal growth factor receptor in non-small-cell lung cancer. Clin Lung Cancer. 7, 250-256 (2006).
- van Laarhoven, H. W. Hypoxia in relation to vasculature and proliferation in liver metastases in patients with colorectal cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 64, 473-482 (2006).
- Hockel, M. Intratumoral pO2 predicts survival in advanced cancer of the uterine cervix. Radiother Oncol. 26, 45-50 (1993).
- Semenza, G. L. HIF-1 and human disease: one highly involved factor. Genes Dev. 14, 1983-1991 (2000).
- Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1: master regulator of O2 homeostasis. Curr Opin Genet Dev. 8, 588-594 (1998).
- Tatum, J. L. Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy. Int J Radiat Biol. 82, 699-757 (2006).
- Brahimi-Horn, M. C., Pouyssegur, J. HIF at a glance. J Cell Sci. 122, 1055-1057 (2009).
- Piret, J. P., Mottet, D., Raes, M., Michiels, C. CoCl2, a chemical inducer of hypoxia-inducible factor-1, and hypoxia reduce apoptotic cell death in hepatoma cell line HepG2. Ann N Y Acad Sci. 973, 443-447 (2002).
- Emerling, B. M., Weinberg, F., Liu, J. L., Mak, T. W., Chandel, N. S. PTEN regulates p300-dependent hypoxia-inducible factor 1 transcriptional activity through Forkhead transcription factor 3a (FOXO3a). Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 2622-2627 (2008).
