Ein optimiertes Protokoll für die Aufzucht Fopius arisanus, Fliegt ein Parasitoid von Tephritid Fruit

Summary

Fopius arisanus ist ein Ei-Larven-Parasitoiden von Tephritid Fruchtfliegen, die erfolgreich in der biologischen Bekämpfung dieser wichtigen tropischen Schädlinge eingesetzt wird. Wir beschreiben hier ein optimiertes Protokoll für die Aufzucht von F. arisanus im kleinen Maßstab mit leicht verfügbaren Materialien.

Abstract

Fopius arisanus (Sonan) ist ein wichtiger Parasitoiden von Tephritid Fruchtfliegen für mindestens zwei Gründen. Erstens ist es der eine von nur drei opiine Parasitoide bekannt, die Gastgeber während der Ei-Stufe ¹ zu infizieren. Zweitens hat es eine breite Palette von möglichen Fruchtfliege Gastgeber. Vielleicht aufgrund seiner Lebensgeschichte, F. arisanus wurde eine erfolgreich zur biologischen Bekämpfung von Fruchtfliegen in mehreren tropischen Regionen ^2-4 verwendet. Ein Hindernis für die breite Nutzung von F. arisanus für Fruchtfliege Kontrolle ist, dass es schwierig, eine stabile Labor Kolonie ^5-9 etablieren. Trotz dieser Schwierigkeit, in den 1990er Jahren USDA-Forscher entwickelten eine zuverlässige Methode, um Labor-Populationen von F. halten arisanus ^10-12. Es gibt großes Interesse an F. arisanus Biologie ^13,14, insbesondere im Hinblick auf seine Fähigkeit, eine Vielzahl von Tephritid Gastgeber ^14-17 besiedeln; Interesse ist vor allem durch die alarmierende Ausbreitung der Bactrocera Fruchtfliege Schädlinge zu neuen Kontinenten in den letzten zehn Jahren ¹⁸ angetrieben. Weitere Forschung auf F. arisanus und weitere Einsätze dieser Art als biologisches Bekämpfungsmittel wird von Optimierungen und Verbesserungen von Zuchtmethoden profitieren. In diesem Protokoll und die damit verbundenen Video-Artikel beschreiben wir ein optimiertes Verfahren zur Aufzucht von F. arisanus auf einem zuvor beschriebenen Ansatz ^12. Die Methode, die wir hier beschreiben, ermöglicht die Aufzucht von F. arisanus in einem kleinen Maßstab, ohne die Verwendung von Obst, die Verwendung von Materialien in den tropischen Regionen der ganzen Welt und mit relativ geringen Handarbeit Anforderungen.

Protocol

1. Bereiten Host Fruchtfliege Eier für Parasitierung

1. Bereiten Sie ein Substrat für die Fruchtfliege Eier durch die Vorbereitung Agar (alternativ Gelcarin GP812, FMC Biopolymer, Ewing NJ; eine kostengünstigere Option) parasitiert ausgefüllt werden Gerichte, 10 cm in der Länge pro Seite und 1,5 cm Tiefe. Bereiten Agar in einer Konzentration von 9 g pro Liter Wasser.
2. Füllen Sie Speisen bis zum Rand mit flüssigem Agar (ca. 70ml), und es ihnen ermöglichen, abkühlen und sich verfestigen (mindestens 45 Minuten).
3. Sobald der Agar-Blöcke fest sind, tragen eine einzelne Schicht von Tissue-Papier (eine einzelne Lage aus Georgia Pacific "Präferenz" Batch-Gewebe), die Oberseite eines jeden Blocks. Das Gewebe sollte leicht kleben, um den Agar, weil der Oberfläche Feuchtigkeit.
4. Tragen Sie eine 0,5 ml Volumen Fruchtfliege Eier in Wasser, um das Gewebe bedeckte Oberfläche des Agar-Blöcke unterbrochen. In unserem Insektarium, entspricht dies etwa 6000 Eier von Bactrocera dorsalis (12000 Eier pro ml).
5. Verwenden Sie ein sauberes 2,5 cm breiten Pinsel in Wasser getaucht, um die Fruchtfliege Eier gleichmäßig über die Gewebeoberfläche.
6. Legen Sie die Fruchtfliege Eier unter dem unteren Bildschirm des Parasitoiden Käfige Eiablage zu ermöglichen. Tippen Sie auf der Unterseite des unteren Bildschirm, um tote Parasiten, die die Eier behindern können, zu entfernen. Es ist am besten, wenn der untere Bildschirm nicht berührt die Eier.
7. Lassen Sie die Parasiten über Nacht und in den nächsten Tag oviposit, etwa 21 Stunden. Dies ist ausreichend Zeit für einen hohen Prozentsatz der Eier parasitiert werden. Längere Belichtungszeiten Risiken superparasitization.

2. Schraffuren und Verpuppung der von Parasiten befallenen Host Fruchtfliegen

1. Bereiten Sie die Aufzucht Behälter, indem Sie 3 bis 3,5 zubereitet Agarblöcken der parasitierten Eier pro 1,25 Liter Fruchtfliege Diät ¹⁹ mit Eiern nach oben.
2. Legen Sie die Diät-Container mit Eiern auf einer Riser über eine 1,5 cm dicke Schicht aus feinem grade Vermiculit oder gewaschenem Sand in einen größeren Behälter Verpuppung. Decken Sie die Verpuppung Behälter mit Deckel und Klebeband die Kanten der mit Klebeband. Vermiculite können nach Sichtung (siehe unten) verwendet werden.
3. Stellen Sie sicher, dass genügend Raum zwischen der Spitze der Diät-Container und die Verpuppung Behälterdeckel für Taufliegen-Larven kriechen heraus und 'pop' ²⁰ in den vemiculite unten.
4. Bewegen Verpuppung Container zu einem Raum bei 27 ° C und 80% relative Luftfeuchtigkeit (RH) für eine Woche. Deckel Behälter mit einem dunklen Tuch für die ersten vier Tage, dann entfernen Sie das Tuch für die verbleibenden Tage.
5. Entfernen Larven Ernährung nach einer Woche haben einmal Larven knallte und betrat das Vermiculit für Verpuppung. Wenn es Larven im Vermiculit sind, damit sie sich zu verpuppen Nacht.
6. Sieve die Puppen aus der Vermiculit. Beginnen Sie mit einem groben Sieb (ca. 3 mm) verwenden Sie dann eine Hand Sieb, um alle verbleibenden Klumpen von Vermiculit entfernen.

3. Trennung und Sortierung

1. Pupa mit F. arisanus kann teilweise aus unparasitized Fruchtfliegen werden nach ihrer Größe getrennt. Sammeln Puppe zwischen 1,65 und 2,26 mm im Durchmesser, da diese für parasitierten fliegt angereichert werden. ¹² Puparia, die kleiner enthalten meist unterdimensioniert Parasitoide, größere Puppe enthalten meist Fliegen sind. Beachten Sie auch, dass für die parasitierten Puppen der Anteil der Frauen positiv korreliert mit der Größe ^12.
2. Eine Vielzahl von Methoden eingesetzt werden, um Puppen nach Größe zu sortieren. Wir beschreiben eine mechanische Methode mit einem benutzerdefinierten Format Sortierer ^21.
3. Legen Sie Puppen in den Trichter an der Spitze eines Vibrationsförderer, die sich langsam nährt die Größe Sorter.
4. Feed the Puppen in der Größe Sorter, die aus einem Paar leicht divergent Walzbarren zu einem Winkel von 30 ° besteht. Die Puppen Drop individuell nach Größe in ein Array von Slots, die in zehn getrennten Behältern durch einen Trichter leer.
5. Sammeln Puppen aus dem Becher in der Größenordnung von 1,65 bis 2,26 mm und legen Sie sie in einem Käfig Entstehung für 7 Tage, bis die meisten Fliegen aus dem unparasitized Puppen entstanden.
6. Als Nächstes verwenden Sie ein Fan auf leere puparia von denen, die noch mit Insekten zu trennen.

4. F. arisanus Entstehung und Aufrechterhaltung

1. Um die Kolonie von F. halten arisanus einen Parasitoid Haltekäfigs mit einem abnehmbaren Glasfront, ca. 25 cm in der Länge pro Seite. Der Käfig hat 1mm ² Screening auf der Oberseite und zwei Seiten. Die Rückseite des Käfigs befindet sich in einer Gummi-Blatt mit einer 9 cm Loch für den Zugang abgedeckt. Der Boden des Käfigs ist ein Schnitt auf der Innenseite mit 1-2mm ² Bildschirm groß genug, um die Platzierung von zwei Agar-Blöcke mit Fruchtfliege Eier für Parasitoid Eiablage ermöglichen abgedeckt.
2. Die Käfige sollten auch eine getönte Teil entlang der unteren Viertel der Glasfront zum Licht, das Parasitoid Gedränge an der Vorderseite des Käfigs können, was zu erhöhten Mortalität zu minimieren.
3. Es werden ca. 11 g dieser AuswahlTed Puppen in Kunststoff-Behälter ca. 9 cm im Durchmesser. Dabei sollte sich ca. 600-700 Parasiten pro Käfig. Größe Auswahl sollte in etwa 60% Frauen führen.
4. Bringen Sie geschirmte Deckel der Behälter. Die Deckel sind mit ² mm 2-Screening, die es erlauben erwachsenen F. abgedeckt werden arsianus die Behälter beim Austritt verlassen, sondern enthält alle verbleibenden Fruchtfliegen.
5. Pflegen Sie die Parasiten bei 24 ° C und ca. 45% RH mit einem 12:12 Photoperiode und gute Belüftung. Wenn hohe Mortalität beobachtet wird, kann die Umstellung der Käfige im Freien für ein paar Stunden am Tag oder Erhöhung Lüftung reduzieren. Parasiten sollten bereit sein, oviposit in einer weiteren Woche und sollten produktiv sein für zwei weitere Wochen.
6. Streak unverdünnt gesponnen Honig am oberen Rand der Käfige mindestens dreimal pro Woche oder wenn die zur Verfügung Honig trocken ist. Übernehmen Sie die gesponnen Honig in schmalen Streifen mit einer Fingerspitze. Beachten Sie, dass, wenn die Streifen zu schwer sind der Honig wird in den Käfig tropft, wenn zu hell der Honig wird schnell austrocknen und erfordern häufige reapplication.
7. Legen Sie Agarblöcken (10 cm x 10 cm x 4 cm) auf den Gipfeln der Käfige, um Feuchtigkeit, um die Parasiten geben. Diese sollten zwei Mal pro Woche gewechselt werden.

5. Repräsentative Ergebnisse:

Wir berichten hier ergibt sich aus Verfahren zur Qualitätskontrolle auf der USDA-ARS F. durchgeführt arisanus Aufzucht-Betrieb in Hilo, Hawaii zwischen dem 5. Januar und 22. Juni 2010. Aufzucht an der Hilo Lage auf der Skala in diesem Video Artikel und Protokoll beschrieben wurde im August 2009 eingeleitet, und anfänglichen Problemen und Anpassungen mit dem neuen Standort war vor allem im Januar aufgelöst. Daher sind diese Daten repräsentativ für die Ergebnisse anderer Forscher erhalten ab ihrer Kolonie, wenn sie das Protokoll folgen wie beschrieben könnte und haben Erfahrung Aufzucht Insekten im Allgemeinen. Während dieser Zeit waren wir erhalten eine kleine Kolonie von F. arisanus: 4 Parasitoid Käfige pro Woche produziert, das entspricht etwa 3600 F. arisanus.

Eine erste Überprüfung von angereichertem Parasitierung Preise wurde durch Aufnahme eines 2-g-Probe von Puppen im Größenbereich von 1,65 durchgeführt - 2,26 mm (angereichert), bevor eine weitere Woche der Entwicklung in eine Holding-Käfig (dh unmittelbar nach dem Larvenstadium Ernährung entfernt wurde und die Puppen gesichtet und Größe sortiert. Wir bezeichnen diese als "frühe Puppen"). In den ersten drei Monaten des Jahres 2010 der mittlere Anteil Parasiten in der angereicherten Probe wurde 0,46 (SD = 0,18). In den folgenden Quartal bedeutet dies betrug 0,58 (SD = 0,08), was auf eine Stabilisierung der Kolonie und Aufzucht Verfahren am neuen Standort. Beachten Sie, dass das angereicherte Puppen, die nicht erfolgreich parasitiert jene, die nicht produziert hat Emergenzen und diejenigen, die Fliegen produziert sind.

Nach einer weiteren Woche in der Haltekäfigs Entfernen leerer puparia weitere zwei Gramm-Probe entnommen wurde ("late Puppen"). Fruchtfliegen unter 1% dieser zweiten Stichprobe vertreten. Der geringe Prozentsatz von Fruchtfliegen ist teilweise auf die frühere Entstehung von Fliegen im Vergleich mit Parasiten, so dass die meisten Fliegen in den Aufnahmebehälter blieb.

Schließlich gibt Abbildung 1 die Ausbeute in Puppenstadium Masse von Januar bis Juni 2010. Die Ausbeuten sind aus Puppen bereichert in der Größenordnung von Interesse, 1,65-2,26 mm gemessen. Die große Masse der "frühen Puppen" zu Beginn des Jahres zeigt einen hohen Anteil an Fruchtfliegen und unemerged Puppen damals, während Anpassungen an den neuen Standort gemacht werden.

Abbildung 1. Angereichertes (Puppenstadium Durchmesser 1,65-2,26 mm) frühen Ernte (unmittelbar nach Größe Auswahl) und "Ende" (nach dem Halten für eine Woche und Entfernen von leeren Hülsen) Puppen an der ARS-USDA F. ariasnus Kolonie in Hilo, Hawaii , Januar - Juni 2010

Discussion

In diesem Protokoll und begleitendes Video Artikel wir beschrieben haben, und ein optimiertes Protokoll demonstriert für die Aufzucht von F. ariasnus, ein Parasitoiden von Tephritid Fruchtfliegen im Labor. Dieses Protokoll wurde im Laufe der Jahre verfeinert, um die Menge von Arbeit und Spezialausrüstung benötigt, um eine Kolonie zu halten minimieren. Wir stellen fest, dass eine gut etablierte, produktive und stabile Kolonie von Host Fruchtfliegen für jeden Versuch der Aufzucht Parasitoide erforderlich ist. In unserem Insektarium wir Bactrocera dorsalis als Host Taufliege, aber auch andere Arten haben gezeigt, dass kompetente Gastgeber sowie ^14-17 werden.

Mehrere Aspekte der F. arisanus Kolonie Wartung bleiben, erkundet zu werden. Dazu gehören die Rate der Labor-Anpassung in dieser Art ^10, Mechanismen des Lernens ²² und die genetischen Veränderungen, die mit der Anpassung und Mechanismen, die in Host Fruchtfliege Plastizität beteiligt sein können auftreten könnten.

B. dorsalis in Französisch-Polynesien, B.: In den letzten zehn Jahren gab es mehrere Beispiele für die Ausbreitung von Dacine fliegt in der ganzen Welt, vor allem in der Gattung Bactrocera worden carambolae in Teilen Südamerikas, B. invadens in Afrika und B. zonata in Afrika und nördlichen Mittelmeerraum. ^3,23,18 Prüfung der Wirksamkeit von biologischen Agenzien wie F. arisanus gegen andere Bactrocera Arten sollten eine hohe Priorität, und es ist unsere Hoffnung, dass die Anwendung der Methoden in diesem Protokoll und begleitenden Video-Artikel beschrieben, wird die Forschung auf F. beschleunigen arisanus in einer größeren Vielfalt von Stellen ^24. Schließlich kann die weitere Forschung mit dieser Methode als Ausgangspunkt auch wichtige Informationen, um die Kolonisierung des Romans Eiparasitoiden ^25,1