Summary
ووصف طريقة لتطوير ركائز الثقافة زنزانة مع القدرة على تغيير الطوبوغرافيا خلال الثقافة. الأسلوب يجعل من استخدام المواد الذكية المعروفة باسم الذاكرة شكل البوليمرات التي لديها القدرة على حفظ شكل دائم. هذا المفهوم غير قابلة للتكيف مع طائفة واسعة من المواد وتطبيقاتها.
Abstract
البوليمرات ذاكرة الشكل (SMPS) هي فئة من المواد "الذكية" التي لديها القدرة على تغيير من شكل ثابت ، مؤقت لشكل محدد مسبقا الدائمة بناء على طلب من الحوافز مثل الحرارة 1-5. دورة في شكل نموذجي الذاكرة ، هو أول من شوه SMP في درجة حرارة مرتفعة أعلى من درجة حرارة تحولها ، تي العابرة [إما درجة حرارة انصهار (T م) أو درجة حرارة التحول الزجاجي (T ز)]. تشوه في الطبيعة غير المرنة ، ويؤدي ذلك أساسا إلى انخفاض في الكون متعلق بتكوين شبكة من السلاسل التأسيسية (بعد نظرية مرونة المطاط). ثم يتم تبريده SMP مشوهة لدرجة حرارة أقل من T العابرة لها ، مع المحافظة على سلالة الخارجية أو الضغط المستمر. خلال التبريد ، والتحولات المادية للدولة أكثر جمودا (شبه البلورية أو زجاجي) ، والتي الفخاخ kinetically أو "تجميد" هذه المواد في هذا الكون دولة منخفضة تؤدي إلى تحديد شكل العيانية. يتم تشغيل استرداد شكل مستمر عن طريق تسخين المواد عن طريق العابر T تحت شرط (غير المقيدة) خالية من الإجهاد. من خلال السماح للسلاسل شبكة (مع الحركة استعادت) على الاسترخاء المفضلة لديها لدولة الديناميكا الحرارية القصوى ، الكون ، وتغييرات مادية من الشكل مؤقت لشكل دائم.
الخلايا قادرة على مسح الخصائص الميكانيكية للبيئة المحيطة بهم 6. الآليات التي من خلالها التفاعل بين الخلايا والميكانيكية في مجال مراقبة البيئة المادية سلوك الخلية هي مجالات البحث النشطة. وقد برزت من ركائز تضاريس محددة كأدوات قوية في التحقيق في هذه الآليات. وقد ثبت ذات النطاق المتوسط ، الميكروسكيل ، وأنماط من البنى التحتية لتوجيه الطبوغرافيا محاذاة الخلية ، والتصاق الخلايا والخلايا قوات الجر 7-14. وقد أكدت هذه النتائج المحتملة لطبوغرافية الركيزة لمراقبة وفحص التفاعلات الميكانيكية بين الخلايا وبيئتها المادية خلال زراعة الخلايا ، ولكن ركائز المستخدمة حتى الآن كانت سلبية وعموما لا يمكن برمجتها لتغير بشكل ملحوظ خلال الثقافة. وقد تقتصر هذه ركود المادية المحتملة من ركائز الطبوغرافية للسيطرة على الخلايا في الثقافة.
هنا ، يتم عرض الخلية النشطة الثقافة (ACC) ركائز SMP التي توظف سطح الذاكرة شكل لتوفير التحكم المبرمج للتضاريس الركيزة وتشوه. هذه ركائز إثبات القدرة على الانتقال من تضاريس a مخدد مؤقتة لتضاريس second مسطح تقريبا ، وحافظا. ويمكن استخدام هذا التغيير في تضاريس للتحكم في سلوك الخلية تحت ظروف معيشية سيئة ثقافة الخلية.
Protocol
1. متساوي المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية من NOA63
- وأعدت غرفة علاج مخصص باستخدام شريحة زجاجية (75 ملم × 25 ملم × 1 مم) ، (أ) 1 هل مم تفلون سميكة ، وصفيحة الألمنيوم (75 ملم × 25 ملم × 3 مم) كما هو مبين في الشكل 1. الغرفة يعقد معا باستخدام مقاطع الموثق صغيرة.
- حقن NOA63 في الغرفة من خلال ثقب في تفلون هل باستخدام إبرة قياس 18. يمكن أن تكون ساخنة NOA63 بلطف لتخفيف الحقن.
- مكان الغرفة على طبق ساخن وضعت في 125 درجة مئوية ، وتسمح للحرارة لدرجة حرارة موحدة لمدة 5 دقائق.
- قبل علاج NOA63 في غرفة مصباح الأشعة فوق البنفسجية (λ أقصى = 365 نانومتر ، وانظر الجدول) لمدة 20 دقيقة مع الطول 6.5 مصباح من على سطح الزجاج.
- إزالة NOA63 من الغرفة الدافئة بينما باستخدام شفرة حلاقة.
- بعد علاج NOA63 تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 3 40 م ح على طبق ساخن عند 125 درجة مئوية.
- تخزين NOA63 المجفف في -20 درجة مئوية.
2. شكل توصيف ذاكرة NOA63
- إعداد العينات التي الدمبل الساخنة الضغط على الشفاء NOA63 فيلم مع لكمة مخصصة (انظر الجدول) ، وأبعادها هو مبين في الشكل 2.
- تحميل العينة في تحليل ميكانيكي الحيوي (DMA ، انظر الجدول) لاعبا اساسيا مع الشد. تعيين أداة ل"قوة مراقبة" واسطة ، ثم إجراء اختبار البرنامج على النحو التالي :
- يوازن في 95.00 درجة مئوية
- متساوي الحرارة 10،00 دقيقة
- المنحدر القوة 0،300 N / دقيقة الى 2.500 N
- متساوي ل5.00 دقيقة
- المنحدر 2.00 درجة مئوية / دقيقة إلى 20.00 درجة مئوية
- متساوي الحرارة 10،00 دقيقة
- المنحدر القوة 0،300 N / دقيقة الى 0.015 N
- متساوي ل5.00 دقيقة
- المنحدر 2.00 درجة مئوية / دقيقة إلى 95.00 درجة مئوية
- كرر الخطوات من 2-9 مرتين أكثر
3. إعداد أحدث ركائز الثقافة الخليوي
- يمكن إعداد نماذج فردية من الفيلم SMP isothermally الشفاء. قطع الفيلم SMP بشفرة الحلاقة لحجم العينة المطلوبة. ضع SMP على طبق ساخن وضعت في درجة حرارة أعلى من جي تي للحد من المعامل وسهولة القطع.
- يمكن ان تكون ثابتة على شكل مؤقت في عدد من الطرق المختلفة. هنا نستخدم الضغط الهيدروليكي مقعد العلوي مع تسخين / تبريد platens لينقش تضاريس مؤقتة. ضبط درجة حرارة platens عند درجة حرارة أعلى من T ز.
- وكان قدم من قبل المزخرف الايبوكسي علاج على سجل الفينيل. وسوف ينتج هذا شكل مؤقت من الأخاديد الموازية. هنا ، كان المزخرف القمم الثلاثية 35-40 ميكرومتر مرتفعة ، ومتباعدة 60 ميكرومتر واسعة 80 ميكرومتر إربا. يمكن جعل المزخرف من المواد الأخرى وطوبوغرافيات مختلفة ، ولكن يجب أن يكون أكثر صلابة NOA63 النقش في درجة الحرارة. وضع عينات SMP على وجهه على المزخرف ووضع العينات والمزخرف في الصحافة.
- تطبيق ~ 100 كيلو التحميل المسبق لاجراء اتصالات بين platens التدفئة والعينات وعقد لمدة 5 دقائق للسماح لل~ عينات للوصول إلى درجة حرارة موحدة.
- 1-6 تطبيق ميغاباسكال الى العينات وعقد لمدة 1 دقيقة. ونؤكد من 4،7 ميغاباسكال يؤدي إلى تكرار غير مكتملة من التضاريس المزخرف. وقد تقريب الطبوغرافيا مؤقتة المنتجة قمم 25-35 ميكرون واسعة وعالية 150 ميكرون. فإن كسر SMP إذا تم تطبيق أكبر الإجهاد. تطبيق أصغر تؤكد أن أعرض طوبوغرافيات مع سعة أصغر.
- خفض درجة حرارة أقل من ز تي. هنا نستخدم قدرة تبريد مياه platens الصحافة.
- عندما تكون درجة الحرارة أقل من جي تي ، وإزالة القوة المطبقة.
- ويمكن تخزين العينات المجفف في -20 درجة مئوية. عند تخزينها في ظل هذه الظروف ، لاحظنا انخفاضا أقل من 1 ميكرون في السعة الانتعاش بعد شهرين لعينات تنقش مع الفينيل المزخرف قياسية.
4. خلية نشطة تجربة الثقافة
- يستخدم الأشعة ما فوق البنفسجية من مجلس الوزراء السلامة البيولوجية (BSC) لتعقيم العينات. ترتيب العينات وجهه لأسفل في أطباق عقيمة دون أغطية وبدوره على ضوء الأشعة فوق البنفسجية لش ح 6
- عينات الوجه لأطباق جديدة مواجهة عقيمة. بدوره على ضوء الأشعة فوق البنفسجية لش ح 6
- عينات الآن بحاجة إلى أن معايرتها إلى حالة مستقرة نسبيا قبل الطلاء مع الخلايا. وضع العينات في 96 لوحة جيدا وإضافة 150 ميكرولتر من متوسطة النمو الكامل.
- وضع لوحة في الحاضنة 30 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO 2 حتى الوصول الى الانتعاش المطلوب جزئية. هنا نستخدم 30 ساعة لإنتاج العينات مع سعة كبيرة بما يكفي لمحاذاة الخلايا.
- ويمكن الآن أن العينات مطلي مع الخلايا. وضع العينات في 96 لوحة جديدة أيضا.
- إضافة 150 ميكرولتر من حل الخلية إلى العينات. هنا نستخدم الخلايا الليفية الماوس C3H/10T1/2 الجنينية في خلايا 20000 / مل لتحقيق الخلايا المعزولة (عموما ليست على اتصال مع الخلايا الأخرى).
- للسماح للخلايا لإرفاق وانتشارها على تضاريس مؤقتة ، تتم في الحاضنة 30 درجة مئوية مقابل 9.5 ساعة.
- لmorphol الخلية مقايسةogy قبل الانتقال ، وإزالة عينات وإجراء التلوين والتصوير مضان من العينات. يسلك هذه المواد تألق ذاتي من خلال أكثر من نطاق الأشعة فوق البنفسجية والمرئية. ينصح Fluorophores في النهاية الحمراء من الطيف بعيدة مثل اليكسا فلور 647 للحد من الخلفية.
- لتشغيل عينات لاسترداد ، نقل لوحة لحاضنة 37 درجة مئوية وتستمر لمدة 19 ساعة الثقافة للسماح لاسترداد المواد والسماح للخلايا للتكيف مع التشكل على تضاريس جديدة.
- إزالة البقع وتطبيق العينات المناسبة (phalloidin للتصوير أكتين الخيطية) والتصوير الإجراءات.
5. ممثل النتائج :
شفي NOA63 هو شفافة ، صلبة زجاجي يحتوي على ذاكرة ممتازة خصائص الشكل كما هو مبين في الشكل 3. في هذه الحالة المادية شفي كما في البروتوكول 1 أعلاه ، ويبين زي تي غرام من 51.1 درجة مئوية (تحديد من بداية انخفاض E '). لوحظ واحدة من دورات الطريقة ذاكرة الشكل (التدفئة ، والتشويه ، والتبريد ، شفاء ، والشكل 3) أنه تم إصلاح نسبة كبيرة من سلالة بعد تفريغ عند 20 درجة مئوية ، والمقابلة لتحديد نسبة 15 (R) و من 89.3 ٪ (في المتوسط على مدى ثلاث دورات ، وأدناه لنفسه ص ص). استعادت سلالة ثابتة على نسبة الاسترداد (R ص) من 84.4 ٪ في مجموعة صغيرة في درجة الحرارة نسبيا أثناء التسخين. وعلاوة على ذلك ، أظهرت أداء الذاكرة شكل تدهور لا تصل إلى ثلاث دورات ، في أن كل المنحنيات اتبع بالضبط تقريبا مع بعضها البعض.
وقد استخدم NOA63 في هذا البروتوكول لأنها متاحة بسهولة من الشركة المصنعة والموردة باعتبارها prepolymer الخالية من المذيبات علاجه بسهولة مع photoinitiator. ومع ذلك ، لم يتم الكشف عن تكوينها من قبل المورد. تم العثور على السماح عالية مرفق الخلية وقدرتها على البقاء. أخيرا ، يمكن ضبطها على درجة الحرارة التي تمر بمرحلة انتقالية للسماح للانتعاش حجم مجدية بين درجات الحرارة خلية two متوافق. ويمكن أيضا عدد من الأنظمة الأخرى البوليمر يمكن استخدامه مع هذا البروتوكول إذا كانت درجة الحرارة التي تمر بمرحلة انتقالية متوافق مع خلية ثقافة وإذا أنها تعزز التصاق الخلايا وقدرتها على البقاء.
اتساع تضاريس مؤقتة (أخاديد) بمرور الوقت حتى 30 درجة مئوية. قبل 30 ساعة عند 30 درجة مئوية ، فقد تم تخفيض السعة بنسبة 16 50 ٪ (الشكل رقم 4 ، والوقت 0) ~. أنه يقلل بنسبة 10 ٪ أخرى على مدى ساعة القادمة 9.5 عندما يتم تشغيل الانتعاش عن طريق زيادة درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية ، ويقلل من السعة إلى 0.5 ٪ من السعة الأولية في غضون 9.5 ساعة. لاستخدام المزخرف والإجهاد النقش 4.9 ميغاباسكال ، وهذا يتوافق مع تغيير وظيفي من 13 ميكرومتر الأخاديد على سطح مسطح تقريبا.
مثال على سلوك الخلية للرقابة من خلال استخدام الخلايا النشطة ركائز الثقافة هو تغيير في تنظيم الهيكل الخلوي. على ركائز مخدد مؤقت قبل أن يتم تشغيل الاسترداد ، محاذاة microfilaments أكتين على طول اتجاه الأخاديد (الشكل 5A) 16. بعد الانتعاش من خلال زيادة درجة الحرارة ، وتنظيم microfilaments وموجهة بشكل عشوائي. عينات المكافحة التي الأخاديد ثابت أو على سطح مستو ثابت لا تنظيم بعد الزيادة في درجات الحرارة (الشكل 5B ، ج).
الشكل 1 : رسم تخطيطي للغرفة علاج NOA63. عرض المقطع العرضي (يسار) وعرض من أعلى إلى أسفل من دون غطاء من الزجاج (يمين).
الرقم 2 : هندسة الدمبل استخدامها لتوصيف شكل الجزء الأكبر الذاكرة W : عرض المقطع الضيقة ، L : طول الجزء الضيق ، G : طول غيج ، WO : العرض الكلي ، LO : الطول الكلي ، D : المسافة بين السيطرة ، R : نصف قطرها فيليه ، وريال عماني : دائرة نصف قطرها الخارجي
وكرر الذاكرة شكل الجزء الأكبر في اتجاه واحد لعلاج NOA63 واحد ، و 3 مرات (العلامة النجمية يشير ظهور التجريبية) : الشكل 3. في نقطة الرمز مع علامة النجمة ، وقد تم تسخين البوليمر ومشوهة ثم عن طريق تطبيق الضغط لتحديد شكله المؤقت. ويقام هذا الضغط المستمر ، وانخفضت درجة الحرارة إلى إصلاح شكل مؤقت دون ز T من البوليمر. ثم يتم زيادة درجة الحرارة ، والمواد يتعافى لشكله دائمة كما هو انخفاض الضغط مؤقتة.
الشكل 4 : يمكن أن تسبب SMP الانتعاش تحت خلية ثقافة المتوافقة مع درجات الحرارة. سعة 25.6 ± 0.8 ميكرومتر الحاضر التالية تفصيل النقشovered إلى 12.6 ± 1.5 ميكرومتر موازنة بعد ساعة و 30 حتى 30 درجة مئوية (0 مرة ، والدوائر السوداء). بعد أن تم نقل عينات الى حاضنة 37 درجة مئوية (9.5 ساعة) ، استعاد السعة إلى 1.1 ± 0.2 ميكرومتر في غضون 3.5 ساعة. استعاد السعة إلى ~ 0.3 لوحظ ± 0.1 ميكرومتر داخل 9،5 ساعة واكتشاف أي انخفاض على مدى ح 9،5 النهائي (المثلثات الحمراء). أشرطة الخطأ تمثل واحدة في قيمة الانحراف المعياري (ن = 4-6). آثار والاتصال profilometry بفحص عينات تمثيلية.
الشكل 5 : الخلية الهيكل الخلوي الأكتين يعيد ترتيب التالي الانتقال الطبوغرافية من الصور ، متحد البؤر الخلايا ملطخة phalloidin تنقش على ركائز تظهر microfilaments يتماشى مع الاتجاه الأخدود (أبيض السهم) قبل الانتقال وارتفاع درجة الحرارة. بعد الانتقال ، وترتيبها microfilaments موجهة بشكل عشوائي. ب ، خلايا السيطرة على ركائز ثابتة تظهر microfilaments موجهة بشكل عشوائي قبل وبعد ارتفاع درجة الحرارة. (ج) ، خلايا السيطرة على ركائز مخدد تظهر microfilaments يتماشى مع الاتجاه الأخدود قبل وبعد ارتفاع درجة الحرارة. شريط الحجم هو 100 ميكرون. كما اثار في الشكل 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن أن يكون جي تي من السيطرة عليها بسهولة عن طريق NOA63 درجة حرارة المعالجة. استخدمنا هذا لتوليد ركائز SMP التي يمكن تشغيلها في نطاق متوافق الخلية. غير الملدن NOA63 بواسطة الماء الذي يقلل من جفاف تي ز ، وزيادة لذلك نحن الجافة تي ز بواسطة علاج عند 125 درجة مئوية لنقل مجموعة تيراغرام الرطب ما بين 30 و 37 درجة مئوية.
ثقافة الخلية النشطة ركائز تظاهر قادرون على السيطرة على سلوك الخلية. نتائج اعادة التنظيم microfilament تسليط الضوء على إمكانات كلا مراقبة ومعايرة سلوك الخلية على ركائز الحيوية. إعداد طوبوغرافيات الركيزة ACC بسيطة وقابلة للتوسيع تستند إلى القالب والشكل علاج المزخرف. ويمكن الشفاء من طوبوغرافيات في ذات النطاق المتوسط النانو ، الميكروسكيل ، وكما شكل دائم أو منقوش على شكل مؤقت. بالإضافة إلى ذلك ، الحفاظ على بقاء الخلايا العالية والتمسك بها وتنتشر على NOA63 16.
استخدام NOA63 SMP كما توحي عدة مجالات للتحسين. تألق ذاتي من خلال مجموعة واسعة من الطيف المرئي يحد من عدد من التحقيقات التي يمكن استخدامها مع التباين العالي. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر المواد الانتعاش الجزئي في 30 درجة مئوية ، وبالتالي فإن تضاريس تنقش أن تتغير قبل أن يتم مطلي الخلايا. هذه هي وظيفة من المادة تي ز ، وديناميات لامتصاص المياه ، والإجهاد الثابتة. على هذا النحو ، سوف تختلف كمية من الانتعاش وظيفية على تضاريس الثابتة. ومع ذلك ، نظرا للتضاريس ، وسوف تتراوح كمية سلالة السائبة تسمح للسيطرة على معدل استرداد الطبوغرافية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر ألف كيلي بيرك للحصول على المساعدة الفنية في إعداد الركيزة ACC. استنادا إلى مقالة نشرت في المواد الحيوية ، ديفيس KA ، وآخرون ، السلوك الديناميكي خلية على شكل بوليمر ركائز الذاكرة ، الحيوية ، دوى : 10.1016/j.biomaterials.2010.12.006 ، إلسفير حقوق التأليف والنشر (2011). وتستند هذه المواد على العمل بدعم من جبهة الخلاص الوطني تحت رقم المنحة DMR - 0907578.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NOA63 | Norland Products, Inc. | NOA63 | Lot number 111 |
| Dogbone Punch | TestResource, Inc. Shakopee, MN | Scaled-down Type IV dogbone (ASTM D638-03) | |
| Benchtop Hydraulic Press | Carver | 3851 | |
| C3H10T1/2 Mouse Embryonic Fibroblasts | ATCC | CCL-226 | |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 1357 | |
| UV Lamp | Spectroline | SB-100PC | |
| Dynamic Mechanical Analyzer (DMA) | TA Instruments | Q800 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Leica Microsystems | Leica DMI 4000B | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 710 | 20x/0.8 NA air or a 40x/1.30 NA oil objective |
References
- Liu, C., Qin, H., Mather, P. T. Review of progress in shape-memory polymers. J. Mater. Chem. 17, 1543-1543 (2007).
- Mather, P. T., Luo, X. F., Rousseau, I. A. Shape Memory Polymer Research. Annu. Rev. Mater. Res. 39, 445-445 (2009).
- Lendlein, A., Kelch, S. Shape Memory Polymers. Angew. Chem. Int. Edit. 41, 2034-2034 (2002).
- Ratna, D., Karger-Kocsis, J. Recent advances in shape memory polymers and composites: a review. J. Mater. Sci. 43, 254-254 (2008).
- Rousseau, I. A. Challenges of shape memory polymers: A review of the progress toward overcoming SMP's limitations. Polym. Eng. Sci. 48, 2075-2075 (2008).
- Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 13661-13661 (1997).
- Addae-Mensah, K. A., Kassebaum, N. J., Bowers, M. J., Reiserer, R. S., Rosenthal, S. J., Moore, P. E., Wikswo, J. P. A flexible, quantum dot-labeled cantilever post array for studying cellular microforces. Sensor Actuat. a-Phys. 136, 385-385 (2007).
- du Roure, O., Saez, A., Buguin, A., Austin, R. H., Chavrier, P., Siberzan, P., Ladoux, B. Force mapping in epithelial cell migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 2390-2390 (2005).
- Lam, T., Clem, W. C., Takayama, S. Reversible on-demand cell alignment using reconfigurable microtopography. Biomaterials. 29, 1705-1705 (2008).
- Stevens, M. M., George, J. H. Exploring and engineering the cell surface interface. Science. 310, 1135-1135 (2005).
- Tan, L., Tien, J., Pirone, D. M., Gray, D. S., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cells lying on a bed of microneedles: an approach to isolate mechanical. 100, 1484-1484 (2003).
- Teixeira, A. I., Nealey, P. F., Murphy, C. J. Responses of human keratocytes to micro- and nanostructured substrates. J. Biomed. Mater. Res. A. 71A, 369-369 (2004).
- Yang, M., Sniadecki, N., Chen, C. Geometric Considerations of Micro- to Nanoscale Elastomeric Post Arrays to Study Cellular Traction Forces. Adv. Mater. 19, 3119-3119 (2007).
- Zhao, Y., Zhang, X. Cellular Mechanics Study in Cardiac Myocytes Using PDMS Pillars Array. Sensor Actuat. a-Phys. 125, 398-398 (2006).
- DiOrio, A. M., Luo, X., Lee, K. M., Mather, P. T. A Functionally Graded Shape Memory Polymer. Soft Matter. 7, 68-68 (2011).
- Davis, K. A., Burke, K. A., Mather, P. T., Henderson, J. H. Dynamic cell behavior on shape memory polymer substrates. Biomaterials. 32, 2285-2285 (2011).
