Summary
Метод для разработки субстраты клеточных культур с возможностью изменения рельефа в культуре описывается. Метод позволяет использовать смарт-материалов, известных как полимеры с памятью формы, которые имеют способность запоминать постоянных форму. Эта концепция может адаптироваться к широкому спектру материалов и приложений.
Abstract
С памятью формы полимеров (SMP) представляют собой класс «умных» материалов, которые имеют возможность перейти от фиксированной, временную форму заранее определенных постоянных форме о применении стимулов, таких как тепло 1-5. В Типичный цикл памяти формы, SMP сначала деформируется при повышенной температуре, которая выше его температура перехода, Т транс [либо температуры плавления (Т м) или температуры стеклования (Т г)]. Упругой деформации в природе и в основном приводит к сокращению конформационной энтропии цепи учредительных сети (по теории упругости резины). Деформированного SMP затем охлаждают до температуры ниже Т транс при сохранении внешнего напряжения или стресса постоянно. При охлаждении материал переходит в более жесткое состояние (частично кристаллический или стеклянный), которые кинетически ловушки или "зависает" материала в этой низкой энтропией, ведущих к фиксации макроскопические формы. Форма восстановления запускается путем постоянного нагрева материала через Т транс под свободной от стрессов (неограниченный) состоянии. Позволяя сети цепей (с восстановил подвижность), чтобы расслабить их термодинамически, максимальная-энтропии, существенные изменения из временной формы в постоянную форму.
Клетки способны съемки механические свойства окружающей их среды 6. Механизмы, посредством которых механических взаимодействий между клетками и окружающей их физической средой контроля поведение клеток являются областями активного исследования. Подложки определенных топографии появились как мощный инструмент для исследования этих механизмов. Мезомасштабные, микромасштабной и наноразмерные структуры субстрата топографии, как было показано прямое выравнивание ячеек, адгезии клеток и клеточных тяговых усилий 7-14. Эти данные подчеркивают потенциал подложки топографии для контроля и анализа механических взаимодействий между клетками и окружающей их физической средой в культуре клеток, но подложек на сегодняшний день, как правило, пассивны и не могут быть запрограммированы ли существенно изменится в культуре. Этот физический застой имеет ограниченный потенциал топографических субстратов для контрольных клеток в культуре.
Здесь активную ячейку культуры (АКК) SMP субстратов вводятся, которые используют формы поверхности память, чтобы обеспечить программным управлением рельефа подложки и деформации. Эти субстраты продемонстрировать способность перехода от временного к рифленый рельеф во-вторых, почти плоский рельеф запомнил. Это изменение рельефа местности могут быть использованы для контроля поведения клеток при стандартных условиях культуры клеток.
Protocol
1. Изотермические УФ-отверждения из NOA63
- Пользовательские камеры лечения был разработан с использованием стекло (75 мм х 25 мм х 1 мм), толщина 1 мм Spacer тефлон, и алюминиевая пластина (75 мм х 25 мм х 3 мм), как показано на рисунке 1. Камере скрепляется с помощью небольших клипов связующего.
- Inject NOA63 в камеру через отверстие в распорку тефлоновым использованием 18 иглы. NOA63 может быть слегка нагревают, чтобы облегчить инъекции.
- Место камеру на горячей плите установлена на уровне 125 ° С и дать тепло к равномерной температуре в течение 5 мин.
- Предварительное лечение NOA63 в УФ-камеры лампы (λ макс = 365 нм, см. таблицу) в течение 20 мин с лампой 6,5 см от поверхности стекла.
- Удалить NOA63 из камеры в то время как теплый использованием лезвия бритвы.
- После лечения NOA63 под ультрафиолетовым светом в течение 3 ч 40 м на плитке при 125 ° C.
- Магазин NOA63 высушенный при температуре -20 ° C.
2. С памятью формы Характеристика NOA63
- Подготовка образца гантели горячим прессованием вылечить NOA63 пленку с индивидуальных удар (см. таблицу), размеры которого показаны на рисунке 2.
- Нагрузка образца в динамический механический анализатор (DMA; см. таблицу) с пределом прибора. Установите прибор на «силу контролируемой" режиме, то программа тестирования процедуру следующим образом:
- Уравновешивания при 95,00 ° С
- Изотермический на 10.00 мин
- Рампа сила 0,300 N / мин до 2,500 N
- Изотермические для 5,00 мин
- Рампа 2,00 ° C / мин до 20,00 ° C
- Изотермический на 10.00 мин
- Рампа сила 0,300 N / мин до 0,015 N
- Изотермические для 5,00 мин
- Рампа 2,00 ° C / мин до 95,00 ° C
- Повторите шаги 2-9 еще два раза
3. Подготовка активных субстратов культуры клеток
- Отдельные образцы могут быть получены из изотермически Высохшая пленка SMP. Cut фильм SMP с бритвой, чтобы желаемый размер выборки. Место SMP на горячей плите на температуру, которая выше, чем Т г сократить модуля и легкость резки.
- Временная форма может быть зафиксирован в ряде различных способов. Здесь мы используем настольный гидравлический пресс с подогревом / охлаждением валики для тиснения временного топографии. Установите температуру валики при температуре выше T г.
- Эмбоссер было сделано эпоксидной смолы на виниловые пластинки. Это создаст временную форму параллельных канавок. Здесь, эмбоссер был треугольный пики от 35 до 40 мкм, высокая и 60 мкм, шириной, расположенными 80 мкм друг от друга. Эмбоссер может быть сделана из других материалов и с разной топологией, но должны быть жестче, чем на NOA63 тиснения температуры. Место SMP образцы лицом вниз на эмбоссер и месте образцы и тиснения в прессе.
- Применить ~ 100 кПа преднагрузки установить контакт между отопления валики и образцы и удерживать в течение ~ 5 минут, чтобы дать образцы для достижения одинаковой температуры.
- Применять 1-6 МПа до образцов и удерживать в течение 1 минуты. Напряжение 4,7 МПа приводит к неполному репликации рельефа тиснения. Временное топографии производится с закругленными пики от 25 до 35 мкм высотой и 150 мкм в ширину. SMP будет перелом, если больше напряжения. Применение меньших напряжениях ввести топологий с меньшими амплитудами.
- Уменьшить температуру ниже T г. Здесь мы используем возможность водяного охлаждения пресс валики.
- При температуре ниже Т г, удалить приложенной силы.
- Образцы можно хранить сухое при температуре -20 ° C. При хранении в этих условиях мы наблюдали менее 1 мкм, уменьшение амплитуды восстановления после двух месяцев для образцов с тиснением эмбоссер записи винила.
4. Активный эксперимент культуры клеток
- УФ-свете биологических кабинета безопасности (BSC) используется для стерилизации образцов. Упорядочить образцы лицом вниз в стерильные чашки без крышки и включаем свет УФ BSC в течение 6 ч.
- Флип образцы новых стерильные чашки лицевой стороной вверх. Включите свет УФ BSC в течение 6 ч.
- Образцы теперь должны быть доведены до относительно стабильного состояния перед покрытием с ячейками. Место образцов в 96 ячейках и добавить 150 мкл полной среды роста.
- Положите пластинку в 30 ° C инкубаторе с 5% CO 2 до достижения желаемого частичного восстановления. Здесь мы используем 30 часов для получения образцов с достаточно большой амплитудой, чтобы выровнять клеток.
- Образцы теперь могут быть покрыты клетками. Место образцы новых 96-луночный планшет.
- Добавить 150 мкл клеточной решение образцов. Здесь мы используем C3H/10T1/2 мышиных эмбриональных фибробластов на 20 000 клеток / мл для достижения изолированных клеток (как правило, не вступает в контакт с другими клетками).
- Для того чтобы клетки, собираются и распространяются на временные топография, места в 30 ° С инкубатор на 9,5 ч.
- Для анализа морфологии ячейкигии до начала переходного периода, извлеките образцы и проводить окрашивание и флуоресценции образцов. Этот материал экспонатов аутофлюоресценция на протяжении большей части ультрафиолетового и видимого диапазона. Флуорофоров в дальнем красном конце спектра, такие как Alexa Fluor 647 рекомендуется снизить фон.
- Чтобы запустить образцы для восстановления, перемещение пластины 37 ° C инкубатора и продолжать культуры в течение 19 ч, чтобы материал для восстановления и позволяют клеткам адаптироваться к их морфологии новой топографии.
- Удалить образцов и применять соответствующие пятна (фаллоидином для нитчатых актина изображений) и визуализации процедур.
5. Представитель Результаты:
Обработанная NOA63 представляет собой прозрачный, стекловидный твердый продукт, который обладает отличной памятью формы, свойства, как показано на рисунке 3. В этом случае материал был вылечен, как в протоколе 1 выше, и показывает равномерное Т г 51,1 ° С (определяется от начала падения Е '). Это наблюдается с той памятью формы циклов (отопление, деформирующий, охлаждения, восстановления, рисунок 3), что большой процент штамм был зафиксирован после разгрузки при 20 ° С, что соответствует фиксации соотношение 15 (R F) из 89,3 % (в среднем за три цикла, то же ниже R г). Фиксированная деформация восстановленных на восстановление отношение (R г) 84,4% в относительно небольшом диапазоне температур при нагреве. Кроме того, производительность памяти формы, не показали ухудшение до трех циклов, в том, что все кривые следуют почти точно друг с другом.
NOA63 была использована в данном протоколе, поскольку он легко доступен от производителя и поставляется в виде легко вылечить без растворителя форполимера с фотоинициатора. Тем не менее, ее состав не разглашается поставщика. Оказалось, чтобы высокие вложения клеток и жизнеспособности. Наконец, температура перехода может быть настроен, чтобы значимые величины восстановления между двумя ячейка совместима температурах. Ряд других полимерных систем также могут быть использованы с этим протоколом, если температура перехода совместим с культурой клеток и, если они способствуют адгезии клеток и жизнеспособность.
Амплитуда временного топографии (канавки) со временем уменьшается при температуре 30 ° C. К 30 ч при 30 ° С, амплитуда была уменьшена на ~ 50% (рис. 4, время 0) 16. Это снижает еще на 10% в течение ближайших 9,5 ч. При восстановлении срабатывает при повышении температуры до 37 ° С, амплитуда уменьшается до 0,5% от начальной амплитуды в течение 9,5 ч. Для тиснения используются и тиснения напряжение 4,9 МПа, что соответствует функциональные изменения от 13 мкм пазы для почти плоской поверхности.
Пример поведения клеток контролируется с помощью использования активных субстратов клеточной культуры является изменение цитоскелета организации. О временном рифленой поверхности перед восстановления срабатывает, актина микрофиламентов выровнять в направлении канавками (рис. 5а) 16. После восстановления, повышение температуры, микрофиламентов реорганизовали и ориентированы случайным образом. Контрольные образцы, которые имеют статические борозды или статической плоской поверхности не реорганизовать после повышения температуры (рис. 5, б, в).
Рисунок 1: Схема для лечения NOA63 камеры. Кросс-разрез (слева) и сверху вниз без стеклянной крышкой (справа).
Рисунок 2: геометрия гантели использовались для массового характеристика памяти формы W:. Ширина узком участке, L: длина узком участке, G: датчик длины, WO: ширина общая, Л. О.: длина наибольшая, D: Расстояние между захватами, R: Радиус филе, и РО: внешний радиус.
Рисунок 3: масса односторонним эффектом памяти формы одного NOA63 лечения, повторяется 3 раза (звездочка означает экспериментальных начала заболевания). В точке обозначены звездочкой, полимер был нагрет и затем деформированы, применяя стресс определить его временные формы. Этот штамм является постоянным, а при понижении температуры исправить временную форму ниже T г полимера. Затем температура увеличивается, и материал возвращается в постоянной формы, как временное напряжение снижается.
Рисунок 4: SMP восстановление может быть вызвано в клеточной культуры совместимы температурах. Амплитуда 25,6 ± 0,8 мкм представить следующие тиснения RECovered до 12,6 ± 1,5 мкм после 30 ч равновесия при 30 ° С (время 0, черные кружки). После образцы были перенесены на 37 ° С инкубатор (9,5 ч), амплитуда восстановилась до 1,1 ± 0,2 мкм в течение 3,5 ч. Амплитуда восстановился до ~ 0,3 ± 0,1 мкм в течение 9,5 ч и не обнаружено снижение по сравнению с окончательным 9,5 ч наблюдалось (красные треугольники). Планки погрешностей представляют одно стандартное отклонение (п = 4-6). Следы являются контактными профилометрии сканирует репрезентативных выборок.
Рисунок 5: цитоскелета сотовый актина перестраивает следующие топографические переход, конфокальной изображения клеток, окрашенных фаллоидином на тисненой субстратов показать микрофиламентов в соответствие с паз направлении (белая стрелка) до перехода и повышение температуры.. После перехода, микрофиламенты перегруппировались ориентированы случайным образом. Б, клетки на плоских подложках контроля показывают, случайно ориентированных микрофиламентов до и после повышения температуры. С, Ячейки рифленые подложки контроль показать микрофиламентов в соответствие с паз направлении до и после повышения температуры. Шкала бар составляет 100 мкм. Следы являются как показано на рисунке 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Т г NOA63 можно легко управлять через температура отверждения. Мы использовали его для создания SMP субстраты, которые могут быть вызваны в ячейке совместимых устройств. NOA63 пластифицируется водой, которая снижает сухой Т г, поэтому мы увеличили сухую Т г в отверждения при 125 ° C для перемещения мокрой Tg диапазоне от 30 до 37 ° C.
Активных клеточных культур продемонстрировали субстратов в состоянии контролировать поведение клеток. Результаты реорганизации микрофиламентов выделить потенциал как для контроля и опробования ячейки поведения на динамических поверхностей. Подготовка АКК топографии субстрата является простым и расширяемой основе лечения плесени и тиснения формы. Топологий на наноуровне, микромасштабной и мезомасштабных можно вылечить, как постоянное форму или тиснением по временной форме. Кроме того, клетки поддерживать высокую жизнеспособность и придерживаться и выкладывают на NOA63 16.
Использование NOA63 как SMP действительно предполагает несколько направлений для совершенствования. Аутофлюоресценция через широкий спектр видимый спектр ограничивает количество зондов, которые могут быть использованы с высокой контрастностью. Кроме того, материал показывает, частичное восстановление при температуре 30 ° С, поэтому тисненым рельефом будет изменен до клетки высевают. Это функция Т г материала, динамику поглощения воды, и фиксированной стресса. Таким образом, количество функциональное восстановление будет меняться в зависимости от фиксированной топографии. Тем не менее, для данного рельефа, изменения количества объемных деформаций позволит за контроль над скоростью топографических восстановления.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить А. Келли Берк для оказания технической помощи с АКК подготовки субстрата. На основании статьи, опубликованной в биоматериалов, Дэвис К., и др., Динамическое поведение ячейку памяти формы полимерных подложках, биоматериалов, DOI:. 10.1016/j.biomaterials.2010.12.006, Copyright Elsevier (2011). Этот материал основан на работе, поддерживается NSF под грант № DMR-0907578.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NOA63 | Norland Products, Inc. | NOA63 | Lot number 111 |
| Dogbone Punch | TestResource, Inc. Shakopee, MN | Scaled-down Type IV dogbone (ASTM D638-03) | |
| Benchtop Hydraulic Press | Carver | 3851 | |
| C3H10T1/2 Mouse Embryonic Fibroblasts | ATCC | CCL-226 | |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 1357 | |
| UV Lamp | Spectroline | SB-100PC | |
| Dynamic Mechanical Analyzer (DMA) | TA Instruments | Q800 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Leica Microsystems | Leica DMI 4000B | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 710 | 20x/0.8 NA air or a 40x/1.30 NA oil objective |
References
- Liu, C., Qin, H., Mather, P. T.
- Mather, P. T., Luo, X. F., Rousseau, I. A.
- Lendlein, A., Kelch, S.
- Ratna, D., Karger-Kocsis, J. Recent advances in shape memory polymers and composites: a review. J. Mater. Sci. 43, 254-254 (2008).
- Rousseau, I. A. Challenges of shape memory polymers: A review of the progress toward overcoming SMP's limitations. Polym. Eng. Sci. 48, 2075-2075 (2008).
- Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 13661-13661 (1997).
- Addae-Mensah, K. A., Kassebaum, N. J., Bowers, M. J., Reiserer, R. S., Rosenthal, S. J., Moore, P. E., Wikswo, J. P. A flexible, quantum dot-labeled cantilever post array for studying cellular microforces. Sensor Actuat. a-Phys. 136, 385-385 (2007).
- du Roure, O., Saez, A., Buguin, A., Austin, R. H., Chavrier, P., Siberzan, P., Ladoux, B. Force mapping in epithelial cell migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 2390-2390 (2005).
- Lam, T., Clem, W. C., Takayama, S. Reversible on-demand cell alignment using reconfigurable microtopography. Biomaterials. 29, 1705-1705 (2008).
- Stevens, M. M., George, J. H. Exploring and engineering the cell surface interface. Science. 310, 1135-1135 (2005).
- Tan, L., Tien, J., Pirone, D. M., Gray, D. S., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cells lying on a bed of microneedles: an approach to isolate mechanical. 100, 1484-1484 (2003).
- Teixeira, A. I., Nealey, P. F., Murphy, C. J. Responses of human keratocytes to micro- and nanostructured substrates. J. Biomed. Mater. Res. A. 71A, 369-369 (2004).
- Yang, M., Sniadecki, N., Chen, C. Geometric Considerations of Micro- to Nanoscale Elastomeric Post Arrays to Study Cellular Traction Forces. Adv. Mater. 19, 3119-3119 (2007).
- Zhao, Y., Zhang, X. Cellular Mechanics Study in Cardiac Myocytes Using PDMS Pillars Array. Sensor Actuat. a-Phys. 125, 398-398 (2006).
- DiOrio, A. M., Luo, X., Lee, K. M., Mather, P. T. A Functionally Graded Shape Memory Polymer. Soft Matter. 7, 68-68 (2011).
- Davis, K. A., Burke, K. A., Mather, P. T., Henderson, J. H. Dynamic cell behavior on shape memory polymer substrates. Biomaterials. 32, 2285-2285 (2011).
