Summary
Hücre kültürü substratlar kültür sırasında topografya değiştirme yeteneği geliştirmek için bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, kalıcı bir şekil ezberlemek yeteneğine sahip şekil hafızalı polimerler olarak bilinen akıllı malzemelerin kullanımını sağlar. Bu konsept, malzeme ve uygulamaları geniş bir yelpazede uyarlanabilir.
Abstract
Şekil hafızalı polimerler (TPF) sabit, geçici bir şekil ısı 1-5 gibi bir uyarıcı başvurusu üzerine önceden belirlenmiş bir kalıcı şekil değiştirme yeteneği var "akıllı" malzemelerin bir sınıf . Tipik bir şekil hafızalı döngüsü, SMP, geçiş sıcaklığı, T trans [ya da erime sıcaklığı (T m) veya cam geçiş sıcaklığı (T g)] daha yüksek bir yüksek sıcaklıkta deforme olur . Deformasyonu, elastik ve ağırlıklı olarak oluşturan ağ zincirleri (kauçuk elastisite teorisi aşağıdaki) konformasyonel entropi azalmaya yol açar. Dış gerginlik ya da stres sabit korurken, deforme SMP sonra trans, T altındaki bir sıcaklıkta soğutulur. Soğutma sırasında, daha katı bir devlet (yarı-kristal veya camsı), kinetik tuzakları ya da "donar" makroskopik şekli tespit önde gelen bu düşük-entropi devlet malzeme için malzeme geçişler. Şekil kurtarma stressiz (kısıtlamasız) koşulu altında sürekli T trans yoluyla malzeme ısıtma ile tetiklenir. Ağ zincirleri (kazanmış hareketlilik), termodinamik olarak tercih edilen, maksimum entropi durumu, kalıcı şekil geçici şekil maddi değişiklikler için dinlenmek için izin vererek.
Hücreler, kendi çevresini saran havadan 6 mekanik özellikleri ölçme yeteneğine sahiptir . Mekanizmaları yoluyla mekanik hücreler ve fiziksel çevre kontrol hücre davranış arasındaki etkileşimleri aktif araştırma alanları. Tanımlanan topografya Substratlar bu mekanizmaların soruşturma güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Mesoscale, microscale ve substrat topografya nano ölçekli desen hücre hizalama, hücre tutunması ve hücre çekiş güçleri 7-14 doğrudan gösterilmiştir. Bu bulgular, kontrolü ve testi, hücre kültürü sırasında hücreler ve onların fiziksel çevre arasındaki mekanik etkileşimleri taban topografyası için bir potansiyel altını var, ama bugüne kadar kullanılan substratlar genelde pasif olmuş ve kültürü içinde önemli bir değişiklik programlanmış olamazdı. Bu fiziksel staz kültür hücreleri kontrol etmek için topografik yüzeylerin potansiyeli sınırlıdır.
Burada, aktif hücre kültürü (ACC) SMP substratlar, substrat topografya ve deformasyon programlanmış kontrolü sağlamak için yüzey şekil hafızalı istihdam tanıtıldı. Bu yüzeyler, geçici bir yivli topografya ikinci, neredeyse düz bir hafızaya topografya geçiş yeteneği göstermektedir. Topografya Bu değişiklik, standart hücre kültürü koşullar altında hücre davranışını kontrol etmek için kullanılabilir.
Protocol
1. NOA63, İzotermal UV-Kürleme
- Özel bir kür odasında bir cam slayt (75 mm x 25 mm x 1 mm), 1 mm kalınlığında Teflon ayırıcı, ve bir alüminyum levha (75 mm x 25 mm x 3 mm) Şekil 1'de gösterildiği gibi kullanılarak geliştirilmiştir. Odasına küçük bağlayıcı klipleri ile birlikte yapılır.
- 18 gauge iğne kullanılarak Teflon ayırıcı bir delikten odasına NOA63 enjekte edilir. NOA63 enjeksiyonu kolaylaştırmak için hafifçe ısıtılır olabilir.
- Oda, 125 ° C ve 5 dakika boyunca üniform bir sıcaklığa ısıtmak için izin sıcak bir tabak koyun.
- Lamba cam yüzeyinden 6.5 cm ile 20 dakika; UV lamba odası (Tablo λ max = 365 nm) NOA63 Ön-kür.
- Sıcak bir jilet kullanarak NOA63 odasına çıkarın.
- 125 sıcak plaka 3 saat 40 m ° C UV ışık altında NOA63 Post-tedavi
- -20 ° C'de kurutulmuş NOA63 Mağaza
2. NOA63 şekli Bellek Karakterizasyonu
- Bir dambıl örnek hazırlayın boyutları Şekil 2'de gösterildiği gibi özelleştirilmiş bir yumruk (Tablo), sıcak presleme bir tedavi NOA63 filmi.
- Çekme fikstür; dinamik bir mekanik analizörü (DMA) Tablo örnek yükleyin. Program daha sonra aşağıdaki gibi, test prosedürü modu "kontrollü kuvvet" alet ayarlayın:
- 95.00 az dengeye ° C
- 10.00 dakika için İzotermal
- Rampa kuvvet 0.300 N / dak - 2.500 K
- 5.00 dakika için İzotermal
- Rampa 2.00 ° C / dk - 20,00 ° C
- 10.00 dakika için İzotermal
- Rampa kuvvet 0.300 N / dak 0,015 N
- 5.00 dakika için İzotermal
- Rampa 2.00 ° C / dk - 95,00 ° C
- Tekrar 2-9 iki kez daha adım
3. Aktif Hücre Kültürü Substratlar hazırlanması
- Bireysel örnekleri isothermally tedavi SMP film hazırlanabilir. SMP filmi istenilen örneklem büyüklüğü için bir jilet ile kesin. SMP T g daha yüksek bir sıcaklık modülü azaltmak ve kesme kolaylaştırmak için sıcak bir tabak koyun.
- Geçici şekli farklı şekillerde bir dizi sabit olabilir. Burada geçici bir topografya kabartma ısıtılmış / soğutulmuş plakaları ile bir masa üstü hidrolik pres kullanabilirsiniz. T g üstünde bir sıcaklık plakaları sıcaklığı ayarlayın.
- Bir kabartıcıda kür epoksi vinil kayıt yapıldı. Bu geçici bir şekil paralel oluk üretecektir. Burada kabartıcıda, 35-40 mikron yüksekliğinde üçgen doruklarına ve birbirinden 60 mm geniş aralıklı 80 mikron. Kabartıcıda diğer malzemeler ve farklı topografyalarının ile yapılabilir, ancak kabartma sıcaklığında NOA63 daha sert olmalıdır. SMP örnekleri kabartıcıda aşağı yüz ve basın örnekleri ve kabartıcıda yere yerleştirin.
- Isıtma plakaları ve örnekleri arasında iletişim kurmak ve örnekleri düzgün bir sıcaklığa ulaşmasına izin ~ 5 dakika tutmak için ~ 100 kPa önyükleme uygulayın.
- 1-6 MPa örnekleri uygulayın ve 1 dakika boyunca tutun. 4.7 MPa stres kabartıcıda topografya eksik çoğaltma açar. Üretilen geçici topoğrafya, 25 ila 35 mm yüksekliğinde ve 150 mm genişliğinde doruklarına yuvarlanır vardır. Daha büyük bir stres uygulandığı takdirde SMP kırık. Küçük genlikleri ile topografyalarının tanıtmak küçük gerilmeler uygulayın.
- T g altındaki sıcaklığı azaltın. Burada basın plakaları su soğutma yeteneği kullanın.
- Sıcaklığı T g altında olduğunda, uygulanan kuvvet çıkarın.
- Numuneler -20 ° C'de kurutularak saklanır. Bu koşullar altında saklandığında, vinil kayıt kabartıcıda kabartma örnekleri iki ay sonra daha az genlik kurtarma 1 mikron azalma gözlemledik.
4. Aktif Hücre Kültürü Deney
- Biyolojik güvenlik kabini (BSC) UV ışık örnekleri sterilize etmek için kullanılır. Örnekleri steril yemekler kapakları olmadan yüz aşağı ve 6 saat boyunca BSC UV ışığı açmak düzenleyin
- Çevir örnekleri yeni steril yemekleri yüzü yukarı. 6 saat BSC UV ışığı açın
- Örnekleri artık hücreleri ile kaplama önce nispeten istikrarlı bir devlet dengelenmiş olması gerekir. 96 plaka örnekleri yerleştirin ve 150 tam büyüme orta ul ekleyin.
- İstenen kısmi toparlanma ulaşana kadar% 5 CO 2 ile 30 ° C inkübatör tabak koyun. Burada 30 saat hücreleri hizalamak için yeterince büyük genlik örnekleri üretmek için kullanır.
- Örnekleri artık hücreleri ile kaplı olabilir. Yeni bir 96 plaka örnekleri yerleştirin.
- Örnekleri hücre çözümü 150 ul ekleyin. Burada izole hücreler (genellikle diğer hücreler ile temas halinde değil) elde etmek için 20.000 hücre / ml C3H/10T1/2 fare embriyonik fibroblastlar.
- Hücreleri, 9.5 saat boyunca 30 ° C inkübatör, yer takın ve geçici topoğrafya yaymak için izin vermek için
- Tahlil hücre morpholgeçiş öncesi ogy, örnekleri kaldırmak ve boyama ve örnekleri floresan görüntüleme. Bu malzeme, UV ve görünür çoğu yoluyla otofloresans sergiler. Alexa Fluor 647 olarak spektrumun uzak kırmızı sonunda Fluorophores arka plan azaltmak için tavsiye edilir.
- Kurtarmak için numuneler tetiklemek için, 37 ° C inkübatör plakası taşımak ve yeni bir topoğrafya, morfoloji adapte hücreleri kurtarmak ve izin için malzeme sağlamak için 19 saat süreyle kültür devam ediyor.
- Örnekleri çıkarın ve uygun bir leke (ipliksi aktin görüntüleme için Phalloidin) ve görüntüleme yöntemleri uygulayabilirsiniz.
5. Temsilcisi Sonuçlar:
NOA63 Kürlenmiş Şekil 3'te gösterildiği gibi mükemmel bir şekil hafıza özellikleri olan bir saydam camsı katı. Bu durumda malzeme yukarıda Protokolü 1 kür ve 51.1 yeknesak bir T g gösterir ° C (E damla başlangıcından itibaren belirlenen). 20 boşalttıktan sonra gerginlik büyük bir yüzdesini tespit edildi, bu tek yönlü şekil hafızalı döngüleri (ısıtma, deforme, Şekil 3, soğutma, kurtarma) ° C, 89.3 sabitleme oranı 15 (R f) karşılık gelen görülmektedir % (üç kür üzerinden ortalama R r aşağıda aynı). Sabit gerilme ısıtma sırasında görece küçük bir sıcaklık aralığında% 84.4 geri kazanım oranı (R r) iyileşti . Tüm kıvrımlarını birbirleri ile hemen hemen tam olarak takip bakımından Ayrıca, şekil bellek performansı, üç kür bozulma gösterdi.
NOA63 üretici hazır, çünkü bu protokolde kullanılan ve photoinitiator ile kolayca tedavi solvent içermeyen prepolimer olarak temin edilmiştir. Bununla birlikte, bileşimi tedarikçi tarafından açıklanmaz. Bu, yüksek hücre eki ve canlılığı izin bulundu. Son olarak, geçiş sıcaklığı iki hücre uyumlu sıcaklıklar arasında anlamlı bir büyüklük kurtarma izin ayarlanmış olabilir. Geçiş sıcaklığı, hücre kültürü ile uyumlu olup olmadığını ve hücre yapışması ve canlılığı desteklemek durumunda diğer polimer sistemlerin sayısı da bu protokol ile kullanılabilir.
Geçici topoğrafya (oluklar) genliği zamanla azalır 30 ° C 30 ° C'de 30 saat, genlik ~% 50 (Şekil 4, zaman 0) 16 düşürüldü. Sonraki 9.5 saat boyunca başka bir% 10 azaltır Kurtarma sıcaklık 37 artırarak tetiklendiğinde ° C, genlik, 9.5 saat içinde% 0.5 'i ilk genlik azaltır Kabartıcıda ve 4.9 MPa kabartma stres için, bu, neredeyse düz bir yüzeye 13 mikron oluk fonksiyonel bir değişime tekabül etmektedir.
Aktif hücre kültürü yüzeylerin kullanımı ile kontrol edilen bir hücre davranış bir örnek, hücre iskeleti organizasyonunda bir değişikliktir. Kurtarma tetiklenir önce geçici oluklu yüzeylerde, aktin mikrofilamentler oluklara (Şekil 5a) 16 doğrultusu boyunca hizalayın. Mikrofilamentler sıcaklık artışı ile kurtarma sonra, yeniden düzenlenmiş ve rastgele odaklı. Kontrol numuneleri statik oluklar veya düz bir yüzey statik bir sıcaklık artışı (Şekil 5b, c) sonra yeniden yoktur.
Şekil 1: Şematik NOA63 için kür odasına. Kesit görünümü (solda) ve cam kapak (sağ) olmadan yukarıdan aşağı bir görünüm.
Şekil 2: Toplu şekil hafızalı karakterizasyonu için kullanılan dambıl geometri W: genişliği dar bölümünün uzunluğu, G: ölçü boyu, WO: genişlik genel, ÖÇ: toplam uzunluk, D: çeneler, R arasındaki mesafe dar kesitli, L: fileto yarıçapı ve RO: dış yarıçap.
Şekil 3: tek bir kür NOA63 toplu tek yönlü şekil hafızalı, 3 kez (yıldız deneysel başlangıçlı gösterir) tekrarladı. Polimer, bir yıldız işareti ile gösterilir noktada geçici bir şekli tanımlamak için bir stres uygulanarak ısıtılır ve daha sonra deforme olur. Bu gerginlik sabit tutulur ve sıcaklık, polimer T g aşağıdaki geçici şeklini düzeltmek için azalmıştır . Sıcaklık sonra artmış, ve geçici bir gerginlik azalır malzemenin kalıcı şekil kurtarır.
Şekil 4: SMP kurtarma, hücre kültürü ile uyumlu sıcaklıklarda tetiklenebilir . Genliği 25.6 ± 0.8 mikron aşağıdaki kabartma rec mevcut± 1.5 mm, 30 - 30 saat dengeleme sonra 12,6 'overed ° C (0, siyah daireler). Numuneleri 37 ° C inkübatör (9,5 saat) taşındı sonra, genlik, 3.5 saat içinde 1.1 ± 0.2 mikron iyileşti Genlik ~ 0.3 ± 9.5 saat içinde 0.1 mikron ve son 9,5 saat boyunca saptanabilir azalma gözlenmiştir (kırmızı üçgen) iyileşti. Hata çubukları, bir standart sapma (n = 4-6) temsil eder. İzler temsili numuneler profilometrisi taramaları temas halindedir.
Şekil 5: Hücre aktin hücre iskeletinin topografik geçiş yeniden düzenler kabartmalı yüzeylerde Phalloidin ile boyanmış hücreler, Konfokal görüntüleri önce oluk yönde geçiş ve sıcaklık artışı (beyaz ok) ile uyumlu mikrofilamentler göstermektedir. Mikrofilamentler geçişten sonra, rastgele odaklı yeniden düzenlemiş bulunmaktayım b, düz kontrolü yüzeylerde Hücreler'i sıcaklık artışı öncesi ve sonrasında rastgele odaklı mikrofilamentler c, yivli kontrol yüzeylerde Hücreler, sıcaklık artışı öncesi ve sonrasında oluk yönde hizalanır mikrofilamentler göstermektedir . Ölçek çubuğu 100 mikron. İzler Şekil 4'te gibi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NOA63 T g kolayca kür sıcaklığı ile kontrol edilebilir. Biz, uyumlu bir hücre aralığında tetiklenebilir SMP substratlar oluşturmak için bu kullanılır. NOA63 kuru T g düşürür su plastikle, bu nedenle 125 ° C, 30 ve 37 ° C arasında ıslak Tg aralığı taşımak için kür tarafından kuru T g arttı
Göstermiştir aktif hücre kültürü substratlar hücre davranışını kontrol edebiliyoruz. Microfilament yeniden yapılanma sonuçları kontrol ve dinamik yüzeylerde hücre davranışlarını assaying için potansiyel vurgulayın. ACC substrat topografyalarının hazırlık kür kalıp ve kabartıcıda şekil dayanan basit ve genişletilebilir. , Nano ölçekli microscale ve mesoscale Topografyaları geçici şekli için kalıcı şekil veya kabartmalı olarak tedavi edilebilir. Ayrıca, hücreler canlılığını korumak ve uymak ve NOA63 16 yayılır.
SMP olarak NOA63 kullanımı iyileştirilmesi için çeşitli alanlarda öneririz. Otofloresans görünür spektrum geniş bir ürün yelpazesi ile yüksek kontrastlı kullanılabilir probları sayısını sınırlar. Buna ek olarak, malzeme, 30 kısmi iyileşme gösterir ° C, hücreleri kaplama önce, bu nedenle kabartmalı topografya değişmiş olacak. Bu malzeme T g, su alımı dinamikleri ve sabit stres bir fonksiyonudur. Gibi fonksiyonel iyileşme miktarı sabit topografya göre değişir. Ancak, belirli bir topografya, toplu zorlanma miktarı değişen topografik iyileşme oranı kontrolü için olanak sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar ACC substrat hazırlanması ile teknik yardım için Kelly A. Burke teşekkür etmek istiyorum. Copyright Elsevier (2011). 10.1016/j.biomaterials.2010.12.006: Biyomalzeme yayınlanan makale, Davis KA, ve ark, şekil hafızalı polimer yüzeylerde, Biyomalzeme, DOI Dinamik hücre davranışı geçerli. Bu malzeme Hibe DMR-0907578 sayılı altında NSF tarafından desteklenen iş dayanmaktadır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NOA63 | Norland Products, Inc. | NOA63 | Lot number 111 |
| Dogbone Punch | TestResource, Inc. Shakopee, MN | Scaled-down Type IV dogbone (ASTM D638-03) | |
| Benchtop Hydraulic Press | Carver | 3851 | |
| C3H10T1/2 Mouse Embryonic Fibroblasts | ATCC | CCL-226 | |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 1357 | |
| UV Lamp | Spectroline | SB-100PC | |
| Dynamic Mechanical Analyzer (DMA) | TA Instruments | Q800 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Leica Microsystems | Leica DMI 4000B | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 710 | 20x/0.8 NA air or a 40x/1.30 NA oil objective |
References
- Liu, C., Qin, H., Mather, P. T. Review of progress in shape-memory polymers. J. Mater. Chem. 17, 1543-1543 (2007).
- Mather, P. T., Luo, X. F., Rousseau, I. A. Shape Memory Polymer Research. Annu. Rev. Mater. Res. 39, 445-445 (2009).
- Lendlein, A., Kelch, S. Shape Memory Polymers. Angew. Chem. Int. Edit. 41, 2034-2034 (2002).
- Ratna, D., Karger-Kocsis, J. Recent advances in shape memory polymers and composites: a review. J. Mater. Sci. 43, 254-254 (2008).
- Rousseau, I. A. Challenges of shape memory polymers: A review of the progress toward overcoming SMP's limitations. Polym. Eng. Sci. 48, 2075-2075 (2008).
- Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 13661-13661 (1997).
- Addae-Mensah, K. A., Kassebaum, N. J., Bowers, M. J., Reiserer, R. S., Rosenthal, S. J., Moore, P. E., Wikswo, J. P. A flexible, quantum dot-labeled cantilever post array for studying cellular microforces. Sensor Actuat. a-Phys. 136, 385-385 (2007).
- du Roure, O., Saez, A., Buguin, A., Austin, R. H., Chavrier, P., Siberzan, P., Ladoux, B. Force mapping in epithelial cell migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 2390-2390 (2005).
- Lam, T., Clem, W. C., Takayama, S. Reversible on-demand cell alignment using reconfigurable microtopography. Biomaterials. 29, 1705-1705 (2008).
- Stevens, M. M., George, J. H. Exploring and engineering the cell surface interface. Science. 310, 1135-1135 (2005).
- Tan, L., Tien, J., Pirone, D. M., Gray, D. S., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cells lying on a bed of microneedles: an approach to isolate mechanical. 100, 1484-1484 (2003).
- Teixeira, A. I., Nealey, P. F., Murphy, C. J. Responses of human keratocytes to micro- and nanostructured substrates. J. Biomed. Mater. Res. A. 71A, 369-369 (2004).
- Yang, M., Sniadecki, N., Chen, C. Geometric Considerations of Micro- to Nanoscale Elastomeric Post Arrays to Study Cellular Traction Forces. Adv. Mater. 19, 3119-3119 (2007).
- Zhao, Y., Zhang, X. Cellular Mechanics Study in Cardiac Myocytes Using PDMS Pillars Array. Sensor Actuat. a-Phys. 125, 398-398 (2006).
- DiOrio, A. M., Luo, X., Lee, K. M., Mather, P. T. A Functionally Graded Shape Memory Polymer. Soft Matter. 7, 68-68 (2011).
- Davis, K. A., Burke, K. A., Mather, P. T., Henderson, J. H. Dynamic cell behavior on shape memory polymer substrates. Biomaterials. 32, 2285-2285 (2011).
