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Bioengineering

形状记忆聚合物主动细胞培养

doi: 10.3791/2903 Published: July 4, 2011

Summary

一个能力地形变化,在文化发展与细胞培养基质的方法是描述。该方法使被称为形状记忆聚合物,有能力记住一个永久的形状的智能材料的使用。这个概念是适应的材料和应​​用的广泛。

Abstract

形状记忆聚合物(SMPS)是一类的“智能”材料,有能力从一个固定的,临时的形状改变预先确定的形状后应用的刺激, 热1-5永久的。 SMP是一个典型的形状记忆周期,首先在比其转变温度T [熔融温度(T )或玻璃化转变温度(Tg)]更高的高温变形。变形是弹性的性质和主要信息的构成的网络链(以下橡胶弹性理论)的构象熵的减少。变形的SMP,然后冷却到低于其T反温度,同时保持外部的应变或应力常数。在冷却过程中,材料过渡到更严格的状态(半结晶或玻璃状),其中动力学陷阱或“冻结”在这种低熵状态,导致宏观形状固定的材料。触发形状恢复是通过不断加热材料通过T 下一个无压力的条件(无约束)。使连锁网络(收复流动)放宽到其热力学的青睐,最大熵的状态,从临时形状的重大变化的永久的形状。

细胞是能够测量的力学性能及其周边环境6。机械细胞之间的相互作用和他们的物理环境控制细胞的行为的机制,通过活跃的研究领域。定义地形基板已成为功能强大的工具,在这些机制的调查。尺度,微观和纳米基板地形模式,已被证明直接单元格对齐方式,细胞粘附和细胞牵引力7-14。这些发现强调基板地形控制和检测机械在细胞培养细胞和它们的物理环境之间的相互作用的潜力,但日期基板一般都被动,不能编程的显着变化,在文化。这个物理瘀有限地形基板,以控制细胞培养的潜力。

在这里,活跃的细胞培养(ACC),SMP的基板介绍,聘请的表面形状记忆提供编程控制基板地形和变形。这些基板展示从一个临时的沟槽地形过渡到第二个,近持平记忆地形的能力。这种地形的变化,可以用来控制细胞标准的细胞培养条件下的行为。

Protocol

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1。温紫外光固化的NOA63

  1. 开发一个自定义的固化室商会使用载玻片(75毫米x 25毫米x 1毫米),1毫米厚的聚四氟乙烯垫片,及铝合金板(75毫米× 25毫米× 3毫米),如图1所示。使用小型长尾夹一起举行。
  2. 通过在聚四氟乙烯垫片孔使用18号针头注入到腔NOA63。 NOA63可以轻轻加热,以减轻注射。
  3. 广场上设置在125 ° C,并允许以一个统一的温度加热5分钟热板腔。
  4. 预固化NOA63紫外灯室(λ 最大 = 365 nm处;见表)灯泡的玻璃表面从6.5厘米为20分钟。
  5. 从室中取出NOA63温暖而使用刀片。
  6. 后固化,紫外光下为3小时40在125米上的热点板块° C。NOA63
  7. 储存在-20 ° C干燥的NOA63

2。形状记忆表征NOA63

  1. 准备一个哑铃试样由热压固化NOA63电影与一个定制的冲压(见表),其尺寸如图2所示。
  2. 装入一个动态机械分析仪(DMA;见表)试样的拉伸夹具。仪器设置“武力控制”的模式,那么程序的测试程序如下:
    1. 平衡在95.00 ° C
    2. 温为10.00分
    3. 斜坡力量0.300 N /分钟2.500 ñ
    4. 温为5.00分
    5. 斜坡2.00 ° C /分钟到20.00 ° C
    6. 温为10.00分
    7. 斜坡力量0.300 N /分钟0.015 ñ
    8. 温为5.00分
    9. 斜坡2.00 ° C /分钟至95.00 ° C
    10. 重复步骤2-9两个更次

3。活跃​​的细胞培养基质的制备

  1. 个别样品可以从等温固化的SMP电影准备。剪切带所需的样本大小的剃刀SMP的电影。放置在SMP的一个热点板块,设置,以减少在温度高于 Tg的高模量和缓解切割。
  2. 临时的形状可以是固定的,在许多不同的方式。在这里,我们使用加热/冷却压板一个台式液压机,压花一个临时的地形。设置在压板的温度高于 Tg的温度。
  3. 是压花固化环氧乙烯基记录。这将产生一个平行沟槽的临时形状。在这里,压花高35至40微米的三角形峰,宽60微米,间距80微米。压花可以从其他材料和不同的地形,但必须在压花温度比NOA63围追堵截。放置在SMP样本正面朝下放在压花和地方在报刊上的样品和压花。
  4. 应用A〜100千帕的预紧力,使加热板及样本之间的联系和按住〜5分钟,使样品达到温度均匀。
  5. 1-6兆帕的样品,并保持1分钟。 4.7兆帕斯卡的压力,导致不完整的复制压花地形。产生的临时地形圆润的山峰,高150微米,宽25至35微米。如果施加更大的压力是在SMP将骨折。应用较小的应力有较小幅度的拓朴。
  6. 降低温度低于Tg的。在这里,我们使用水冷却能力按压板。
  7. 当温度低于Tg的是,除去施加的力。
  8. 可以储存在-20 ° C干燥样品当存储在这些条件下,我们所观察到小于1微米的下降在振幅恢复后两个月样本唱片压花浮雕。

4。主动细胞培养实验

  1. 生物安全柜(BSC)的紫外灯是用来消毒的样品。排列样品面朝下在无菌无盖菜和BSC紫外灯开启6小时
  2. 面对新的无菌菜翻转样品。 BSC紫外灯开启6小时
  3. 样品现在需要一个相对稳定的状态,与细胞的电镀前平衡。放置在一个96孔板的样品,加150μL完全培养基。
  4. 置于5%的CO 2板,直至达到所需的部分恢复,在30℃培养箱。在这里,我们用30小时生产足够大的幅度保持一致细胞样本。
  5. 样品现在可以镀细胞。放置在一个新的96孔板的样本。
  6. 加入150μL细胞溶液样品。在这里,我们使用20,000细胞/ ml C3H/10T1/2小鼠胚胎成纤维细胞,以实现分离的细胞(一般不与其他细胞接触)。
  7. 为了让细胞附着和传播上的临时地形,在30℃孵化器为9.5小时
  8. 检测细胞morpholOGY之前的过渡,取出的样品和执行样品的染色和荧光成像。这种材料具有自体荧光的紫外线和可见光范围内的大部分。的Alexa Fluor 647,如频谱远红端的荧光基团的建议,以减少背景。
  9. 要触发的样本,以恢复,将37 ° C培养箱板,并继续为19 H的文化,使材料恢复,并允许细胞,以适应新的地形形态。
  10. 取出样品,并运用适当的染色(鬼笔环肽对丝状肌动蛋白成像)和成像过程。

5。代表性的成果:

固化NOA63是一种透明的玻璃状固体,具有优异的形状记忆如在图3所示的属性。在这种情况下,材料被治愈,在上述议定书第1显示了一个统一的Tg 51.1 ° C(从E“下降的发病确定)。据观察,从单程形状记忆周期(加热,变形,冷却,恢复, 图3),很大比例的应变是固定的卸货后,在20 ° C,对应一个固定的比例 15 89.3(R F ) %(三个周期的平均值; R R,下同) 。固定应变恢复比例为84.4%(R R)在一个相对较小的温度范围内,在加热过程中恢复。此外,形状记忆性能表明没有恶化到三个周期,在所有的曲线都遵循相互几乎一模一样。

NOA63使用这个协议,因为它很容易从制造商和供应容易治愈的无溶剂型光引发剂,预聚物。然而,其组成是由供应商没有透露。它被发现,让高细胞附着和生存能力。最后,转变温度可以调节,允许两种细胞之间的兼容温度恢复有意义的幅度。也可用于其他聚合物系统转变温度是兼容细胞培养和促进细胞的粘附和活力,如果他们与本议定书​​。

临时地形(槽)的幅度降低随着时间的推移在30 ° C在30℃30 h,幅度已经降低〜50%( 图4,时间为0)16。它可以减少另外10%,在未来的9.5小时当复苏引发的温度提高到37 ° C,幅度降低初始幅度为0.5%,9.5小时内所用的压花和压花压力4.9兆帕,这相当于一个13微米沟槽近平坦的表面功能性的改变。

通过使用活跃的细胞培养基质控制细胞行为的一个例子是在细胞骨架的组织变化。临时沟槽基板前恢复被触发后,肌动蛋白微丝排列沿方向的沟槽( 5a)16。回收温度升高后,微丝有重组和随机取向。对照样品,静态沟槽或静态平坦的表面不重组后的温度上升( 图5B,C)。

图1
图1:NOA63固化室示意图。截面视图(左)和自上而下,没有玻璃盖(右)。

图2
图2:用于散装形状记忆特性的哑铃几何地下狭窄段的长度:长度量具禾:宽度整体而言劳:总长度,D:交手,R之间的距离狭窄段,L宽度:半径的圆角,和RO:外径。

图3
图3:散装单向单一NOA63治愈的形状记忆,重复3次(星号表示实验发病) 。在标有星号的点,聚合物被加热和变形,然后通过施加压力界定其临时形状。这株是保持不变,温度下降到修复下面的聚合物 Tg临时形状。温度上升,作为临时应变降低材料恢复其永久的形状。

图4
图4:SMP的恢复可以触发细胞培养兼容的温度下。幅度为25.6 ± 0.8微米目前以下压花RECovered ± 1.5微米后30小时平衡在30至12.6℃(时间为0,黑色圆圈)。后的样品被转移到37℃培养箱(9.5小时),振幅3.5小时内恢复到1.1 ± 0.2微米振幅恢复到〜0.3 ± 9.5 h和0.1微米范围内检测到没有超过最后的9.5小时减少(红色三角形)。误差棒代表一个标准差(N = 4-6)。痕迹接触有代表性的样品进行轮廓扫描。

图5
图5:细胞肌动蛋白细胞骨架重新排列下面的地形过渡鬼笔环肽染色细胞上压印基板共聚焦显微镜图像显示与沟槽的方向过渡和温度升高之前(白色箭头)一致的微丝。过渡期后,微丝重新排列是随机取向,B,平面控制基板上的单元格显示随机取向的微丝前后温度升高,C,沟槽控制基板上的单元格显示微丝沟方向一致,前后温度升高。比例尺为100μm。痕迹, 如图4。

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Discussion

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的NOA63 Tg可以很容易地通过固化温度控制。我们用这个生成SMP基板,可以在单元格中的兼容范围引发。 NOA63是由水,降低干燥 Tg塑化,所以我们增加了固化在125 ° C至30日和37 ° C之间移动的Tg范围湿干 Tg

激活的细胞培养基质表明,能够控制细胞的行为。微丝重组的结果,强调控制和化验动态基板上的细胞行为的潜力。硫化模具和压花形状的基础上编制的ACC基板的地形是简单和可扩展。纳米,微型和中尺度地形,作为永久的形状或临时形状的浮雕是可以治愈的。此外,细胞保持高的可行性,并坚持和传播 NOA63 16。

为SMP的NOA63使用并建议改进的几个方面。通过大范围的可见光谱的自体荧光限制探头,可用于高对比度。此外,该材料显示部分恢复,在30 ° C,因此浮雕的地形会有改变细胞镀前。这是一个功能材料 Tg,水的吸收动力学,和固定压力。因此,功能恢复的量会根据固定的地形。然而,对于一个给定的地形,不同体积应变量将允许地形恢复的速度控制。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

作者要感谢提供技术援助与ACC基材的准备凯利A.伯克。的文章发表生物材料,戴维斯KA, ,动态细胞行为的形状记忆聚合物衬底材料 ,DOI:10.1016/j.biomaterials.2010.12.006,版权爱思唯尔(2011年)的基础上。基于这种材料是由美国国家科学基金会的支持下批准号DMR - 0907578工作。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NOA63 Norland Products, Inc. NOA63 Lot number 111
Dogbone Punch TestResource, Inc. Shakopee, MN Scaled-down Type IV dogbone (ASTM D638-03)
Benchtop Hydraulic Press Carver 3851
C3H10T1/2 Mouse Embryonic Fibroblasts ATCC CCL-226
Biological Safety Cabinet Thermo Fisher Scientific, Inc. 1357
UV Lamp Spectroline SB-100PC
Dynamic Mechanical Analyzer (DMA) TA Instruments Q800
Inverted Fluorescence Microscope Leica Microsystems Leica DMI 4000B
Confocal Laser Scanning Microscope Carl Zeiss, Inc. LSM 710 20x/0.8 NA air or a 40x/1.30 NA oil objective

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References

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Davis, K. A., Luo, X., Mather, P. T., Henderson, J. H. Shape Memory Polymers for Active Cell Culture. J. Vis. Exp. (53), e2903, doi:10.3791/2903 (2011).More

Davis, K. A., Luo, X., Mather, P. T., Henderson, J. H. Shape Memory Polymers for Active Cell Culture. J. Vis. Exp. (53), e2903, doi:10.3791/2903 (2011).

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