Summary
שיטה לפיתוח תרבות מצעים תא עם היכולת לשנות את הטופוגרפיה במהלך התרבות מתואר. השיטה עושה שימוש חומרים חכמים המכונה זיכרון פולימרים צורה יש את היכולת לשנן צורה קבועה. תפיסה זו ניתנת להתאמה למגוון רחב של חומרים ויישומים.
Abstract
זיכרון צורה פולימרים (SMPs) הם קבוצה של חומרים "חכמים", כי יש את היכולת לשנות מן צורה קבועה זמני לעצב מראש קבוע על פי בקשה של גירוי כגון חום 1-5. ב מחזור צורה טיפוסית זיכרון, SMP הוא מעוות הראשון טמפרטורה מוגבה כי הוא גבוה יותר מאשר טמפרטורת המעבר שלה, T טרנס [או את טמפרטורת ההתכה (T מ '), או את המעבר זכוכית הטמפרטורה (ט ז)]. העיוות הוא אלסטי בטבע בעיקר מוביל לירידה אנטרופיה קונפורמציה של הרשתות רשת המרכיבים (בעקבות התיאוריה גומי אלסטיות). SMP מעוות הוא מקורר אז לטמפרטורה מתחת T שלו טראנס, תוך שמירה על מתח מתח חיצוני או קבוע. במהלך הקירור, המעברים חומר למצב נוקשה יותר (למחצה גבישי או זכוכית), אשר kinetically מלכודות או "מקפיאה" את החומר במצב נמוך אנטרופיה זה מוביל לתיקון צורה מקרוסקופית. התאוששות צורה מופעלת על ידי ברציפות חימום החומר באמצעות T טראנס תחת תנאי (מאולצת) ללא מתח. בכך שהוא מאפשר את השרשראות רשת (עם ניידות חזרה) כדי להירגע המועדף thermodynamically מדינתם מקסימלי, אנטרופיה, שינויים מהותיים מהצורה זמני בצורת קבע.
תאים המסוגלים מדידות תכונות מכניות של הסביבה המקיפה שלהם 6. המנגנונים שבאמצעותם אינטראקציות בין תאים מכני ושליטה הסביבה הפיזית שלהם התנהגות התא הם תחומי מחקר פעילים. מצעים של הטופוגרפיה מוגדר התפתחו כמו כלים רבי עוצמה בחקירה של מנגנונים אלה. Mesoscale, microscale, ודפוסי ננומטרי של הטופוגרפיה המצע הוכחו ישיר יישור התא, הידבקות התא המתיחה תא כוחות 7-14. ממצאים אלה יש הדגיש את הפוטנציאל הטופוגרפיה המצע לשלוט assay את האינטראקציות מכני בין תאים הסביבה הפיזית שלהם במהלך תרבית תאים, אך מצעים השתמשו עד כה היו בדרך כלל פסיבי ולא יכול להיות מתוכנת כדי לשנות באופן משמעותי במהלך התרבות. זה קיפאון גופני הגבילה את הפוטנציאל של מצעים הטופוגרפי לשלוט התאים בתרבית.
כאן, פעיל תרבית תאים (ACC) מצעים SMP מוצגים המעסיקות צורה משטח זיכרון לספק שליטה מתוכנת הטופוגרפיה המצע ואת העיוות. מצעים אלה מדגימים את היכולת המעבר טופוגרפיה מחורצת זמני הטופוגרפיה שנייה פה כמעט שטוח. שינוי זה ב הטופוגרפיה יכול לשמש כדי לשלוט בהתנהגות התא בתנאים סטנדרטיים התרבות התא.
Protocol
1. מקורר באופן איזוטרמי UV-אשפרה של NOA63
- תא ריפוי מותאמים אישית פותחה באמצעות שקופיות זכוכית (75 מ"מ x 25 מ"מ x 1 מ"מ), בעובי 1 מ"מ spacer טפלון, וכן צלחת אלומיניום (75 מ"מ x 25 מ"מ x 3 מ"מ) כפי שמוצג באיור 1. קאמרית הוא החזיק יחד באמצעות קליפים קלסר קטן.
- להזריק את NOA63 החדרה דרך חור spacer טפלון באמצעות מחט מד 18. NOA63 ניתן מחומם בעדינות כדי להקל על ההזרקה.
- מניחים את החדר על פלטה חשמלית נקבע על 125 ° C ולאפשר כדי לחמם לטמפרטורה אחידה עבור 5 דקות.
- טרום לרפא את NOA63 בתא מנורת UV (λ = max 365 ננומטר, ראו טבלה) במשך 20 דקות עם 6.5 ס"מ מנורה מפני השטח של הזכוכית.
- הסר את NOA63 מהאולם בזמן חמים באמצעות סכין גילוח.
- פוסט לרפא את NOA63 תחת אור UV עבור 3 מ 40 שעות על הפלטה החשמלית ב 125 ° C.
- חנות NOA63 מיובש ב -20 ° C.
2. זיכרון צורה אפיון NOA63
- הכן הדגימה המשקולת על ידי לחיצה על חם נרפא NOA63 הסרט עם אגרוף אישית (ראו טבלה), שמימדיה שמוצג באיור 2.
- טען את הדגימה לתוך מנתח מכני דינמי (DMA, ראו טבלה) עם מתקן מתיחה. הגדר את מכשיר "כוח מבוקר" מצב, אז התוכנית הליך בדיקה כדלקמן:
- לאזן בשעה 95.00 ° C
- מקורר באופן איזוטרמי דקות 10.00
- כבש כוח 0.300 N / min עד 2.500 N
- מקורר באופן איזוטרמי דקות 5.00
- הרמפה 2.00 ° C / min עד 20.00 ° C
- מקורר באופן איזוטרמי דקות 10.00
- כבש כוח 0.300 N / min עד 0.015 N
- מקורר באופן איזוטרמי דקות 5.00
- הרמפה 2.00 ° C / min עד 95.00 ° C
- חזור על שלבים 2-9 עוד פעמיים
3. הכנת מצעים תרבות פעילים Cell
- דגימות בודדת יכולה להיות מוכנים מהסרט SMP נרפא isothermally. חותכים את הסרט SMP עם סכין על גודל המדגם הרצוי. מניחים את SMP על פלטה חשמלית נקבע על טמפרטורה גבוהה יותר מאשר g T כדי להפחית את מודול וקלות לחיתוך.
- הצורה זמני יכול להיות קבוע במספר דרכים שונות. כאן אנו משתמשים עיתונאים גבי ספסל הידראולי עם מחומם / מקורר platens כדי הבלטה הטופוגרפיה זמניים. הגדר את הטמפרטורה של platens בטמפרטורה מעל T g.
- ההבלטה נעשה על ידי ריפוי אפוקסי על תקליט ויניל. זה יהיה לייצר צורה זמני של חריצים מקבילים. כאן, בכלי ההבלטה היו פסגות משולש 35-40 מיקרומטר גבוה 60 מיקרומטר רחב, במרווחים 80 מיקרומטר לגזרים. ההבלטה ניתן מחומרים אחרים עם topographies שונים, אך חייבת להיות נוקשה יותר NOA63 בטמפרטורה הבלטות. מניחים את דגימות SMP הפנים כלפי מטה על ההבלטה ואת המקום דגימות בכלי ההבלטה בעיתונות.
- החלת ~ 100 kPa preload ליצור קשר בין platens חימום הדגימות והחזק עבור ~ 5 דקות כדי לאפשר הדגימות להגיע טמפרטורה אחידה.
- החל 1-6 מגפ"ס את דגימות והחזק למשך דקה 1. הלחץ של 4.7 מגפ"ס מוביל שכפול שלם של הטופוגרפיה בכלי ההבלטה. הטופוגרפיה זמני המיוצר יש מעוגלות פסגות 25-35 מיקרומטר גבוהה 150 מיקרומטר רחב. SMP יהיה שבר אם הלחץ גדול יותר מוחל. החל מדגיש קטן להציג topographies עם אמפליטודות קטנות יותר.
- מנמיכים את הטמפרטורה מתחת g טי. כאן אנו משתמשים קירור מים היכולת של platens העיתונות.
- כאשר הטמפרטורה היא מתחת g T, להסיר את הכוח המופעל.
- דוגמאות ניתן לאחסן מיובש ב -20 ° C. כאשר מאוחסנים בתנאים אלה, ראינו פחות ירידה 1 מיקרומטר התאוששות משרעת לאחר חודשיים עבור דוגמאות בולטות עם הטבעה את השיא ויניל.
4. התא הפעיל תרבות ניסוי
- האור UV של ארון בטיחות ביולוגית (BSC) משמש כדי לעקר את הדגימות. סדר הדגימות עם הפנים כלפי מטה במנות סטרילי ללא מכסים להדליק את האור UV BSC עבור 6 ח
- דגימות Flip למנות סטרילית חדשה עם הפנים כלפי מעלה. כבה את האור UV BSC עבור 6 ח
- דגימות כרגע צריך להיות equilibrated למצב יציב יחסית לפני ציפוי עם תאים. מניחים את צלחת 96 דגימות היטב ולהוסיף 150 μl של מדיום הגידול להשלים.
- שים את צלחת 30 ° C חממה עם CO 2 עד 5% מגיע התאוששות חלקית הרצוי. כאן אנו משתמשים 30 שעות לייצר דגימות עם אמפליטודה גדולה מספיק כדי ליישר תאים.
- דוגמאות ניתן כעת מצופה עם תאים. מניחים את דגימות צלחת 96 חדש היטב.
- הוסף 150 μl של פתרון תא הדגימות. כאן אנו משתמשים C3H/10T1/2 fibroblasts העכבר עובריים ב 20,000 תאים / מ"ל להשיג תאים בודדים (בדרך כלל במגע עם תאים אחרים).
- כדי לאפשר לתאים לצרף ולהתפשט על הטופוגרפיה זמנית, מקום 30 ° C חממה 9.5 ח
- כדי morphol תא assayogy לפני המעבר, להסיר דגימות ולבצע מכתים ו דימות פלואורסצנטי של הדגימות. חומר זה מוצגים autofluorescence דרך ביותר של טווח UV לעין. Fluorophores בסוף אדום רחוק של הספקטרום כגון Alexa פלואוריד 647 מומלץ להפחית את הרקע.
- כדי להפעיל דגימות להתאושש, להזיז את הצלחת כדי 37 מעלות צלזיוס חממה ולהמשיך תרבות עבור 19 שעות כדי לאפשר את החומר כדי להתאושש ולאפשר לתאים להסתגל המורפולוגיה שלהם הטופוגרפיה החדשה.
- הסר דגימות וליישם כתם המתאים (phalloidin עבור פילמנטיות אקטין הדמיה) והדמיה ההליכים.
5. נציג תוצאות:
נרפא NOA63 הוא מוצק שקוף, מזוגגות כי יש זיכרון מצוין צורה המאפיינים כפי שמוצג באיור 3. במקרה זה, החומר היה נרפא כמו בפרוטוקול 1 לעיל מראה אחיד T g של 51.1 ° C (נקבע מתחילת הירידה "E). הוא ציין מן צורה אחת דרך מחזורי זיכרון (חימום, לעוות, קירור, מחלים, איור 3), כי אחוז גדול של זן נקבע לאחר פריקה ב 20 ° C, המתאים יחס תיקון 15 (R f) של 89.3 % (בממוצע לכל שלושת המחזורים; למטה באותו R r). המתח קבוע התאושש ביחס להתאוששות (R r) של 84.4% בטווח טמפרטורה קטנים יחסית במהלך החימום. יתר על כן, ביצועי זיכרון צורה לא הראו הידרדרות עד שלושה מחזורים, שכן כל העיקולים לעקוב כמעט בדיוק אחד עם השני.
NOA63 נעשה שימוש בפרוטוקול זה משום שהיא זמינה מיצרן וסיפקה כמו prepolymer ממס חינם לרפא בקלות עם photoinitiator. עם זאת, ההרכב שלה לא פורסמו על ידי הספק. נמצא לאפשר התקשרות לתא הכדאיות גבוהה. לבסוף, המעבר הטמפרטורה יכולה להיות מכוון לאפשר בסדר גודל משמעותי של התאוששות בין שתי טמפרטורות תא תואם. מספר מערכות אחרות הפולימר יכול לשמש גם עם פרוטוקול זה אם טמפרטורת המעבר תואם תרבית תאים ואם הם לקדם את הידבקות התא הכדאיות.
משרעת של הטופוגרפיה זמני (חריצים) יורד במשך הזמן על 30 ° C. עד 30 שעות ב 30 ° C, משרעת צומצם ב ~ 50% (איור 4, זמן 0) 16. זה מפחית עוד 10% מעל הבאה 9.5 ח כאשר ההתאוששות מופעלת על ידי הגדלת הטמפרטורה ל 37 ° C, משרעת מפחית לרמה של 0.5% של משרעת הראשונית בתוך 9.5 ח עבור ההבלטה משומשים מתח הבלטות של 4.9 מגפ"ס, זה מקביל לשינוי תפקודי של 13 מיקרומטר חריצים על משטח שטוח כמעט.
דוגמה של התנהגות התא מבוקר באמצעות מצעים תרבות פעיל תא שינוי בארגון cytoskeleton. על מצעים מחורץ זמני לפני התאוששות מופעלת, microfilaments אקטין ליישר יחד לכיוון החריצים (ציור 5a) 16. לאחר התאוששות על ידי העלאת הטמפרטורה, microfilaments יש ארגון מחדש ו מכוונים באופן אקראי. דגימות בקרה כי יש חריצים סטטיות או משטח שטוח סטטי לא מחדש לאחר העלייה בטמפרטורה (איור 5 ב, ג).
איור 1: סכמטי של תא NOA63 ריפוי. חתך נוף (משמאל), מלמעלה למטה לצפות ללא כיסוי זכוכית (מימין).
איור 2: גיאומטריה המשקולת המשמש אפיון צורה נפח זיכרון W:. הרוחב של סעיף L צר: אורכו של קטע צר, G: אורך גייג', WO: רוחב הכוללת, LO: אורכו הכולל, D: המרחק בין אוחז, R: רדיוס של פילה, ו RO: הרדיוס החיצוני.
איור 3: חד סטרי נפח זיכרון צורה של ריפוי NOA63 אחת, חזר 3 פעמים (כוכבית מציינת תחילת הניסוי). בנקודה מסומן בכוכבית, פולימר כבר מחוממת הוא מעוות אז על ידי הפעלת מתח להגדיר צורה הזמני. זן זה הוא קבוע, והטמפרטורה יורדת לתקן את הצורה זמני מתחת g T של הפולימר. הטמפרטורה עולה אז, החומר משחזרת לעצב הקבע שלה כמו זן זמני מצטמצם.
איור 4: התאוששות SMP יכול להיות מופעלות תחת תרבית תאים תואם בטמפרטורות. משרעת של 25.6 ± 0.8 מיקרומטר הנוכחית rec הבלטות הבאהovered על 12.6 ± 1.5 מיקרומטר לאחר איזון 30 שעות ב 30 ° C (0 זמן, עיגולים שחורים). לאחר הדגימות הועברו 37 ° C חממה (9.5 שעות), משרעת התאושש עד 1.1 ± 0.2 מיקרומטר בתוך 3.5 ח משרעת התאושש ל ~ 0.3 ± 0.1 מיקרומטר בתוך 9.5 שעות ולא על ירידה לזיהוי הסופי 9.5 שעות נצפתה (משולשים אדומים). ברים שגיאה מייצגים סטיית תקן אחת (n = 4-6). עקבות הם קשר סריקות profilometry של מדגמים מייצגים.
איור 5: אקטין cytoskeleton Cell מארגן מחדש בעקבות המעבר הטופוגרפי, תמונות Confocal של תאים מוכתם phalloidin על מצעים בולטות להראות microfilaments מיושר עם כיוון חריץ (חץ לבן) לפני המעבר ולהגדיל הטמפרטורה.. לאחר המעבר, יש microfilaments מחדש מכוונים באופן אקראי. B, תאים על מצעים לשלוט שטוח להראות microfilaments אוריינטציה באקראי לפני ואחרי עלייה בטמפרטורה. ג, תאים על מצעים לשלוט מחורץ להראות microfilaments מיושר עם כיוון חריץ לפני ואחרי עלייה בטמפרטורה. בר סולם הוא 100 מיקרומטר. עקבות הן באיור 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
G T של NOA63 ניתן לשלוט בקלות באמצעות הטמפרטורה ריפוי. השתמשנו הזה כדי לייצר מצעים SMP כי יכול להיות מופעלות במגוון תואם התא. NOA63 הוא פלסטיק במים אשר מפחית את היובש T g, ולכן הגדלנו היבש T g על ידי ריפוי ב 125 ° C כדי להזיז את טווח Tg רטוב בין 30 ל 37 ° C.
תרבות פעיל תא מצעים הפגינו מסוגלים לשלוט על התנהגות התא. התוצאות של ארגון מחדש microfilament להדגיש את הפוטנציאל הן שליטה assaying התנהגויות התא על מצעים דינמי. הכנת המצע topographies ACC הוא פשוט להרחבה על בסיס התבנית ריפוי צורה בכלי ההבלטה. Topographies ב mesoscale ננומטרי, microscale, והוא יכול להירפא כצורה הקבע או הבלטה עבור הצורה זמניים. בנוסף, התאים לשמור על כדאיות גבוהה לדבוק ולהתפשט על NOA63 16.
השימוש NOA63 כמו SMP אינו מציע מספר תחומים לשיפור. Autofluorescence באמצעות מגוון גדול של הספקטרום הנראה מגביל את מספר בדיקות שניתן להשתמש בהם עם ניגודיות גבוהה. בנוסף, החומר מראה התאוששות חלקית ב 30 ° C, ולכן הטופוגרפיה בולטות ישתנו לפני תאים מצופה. זוהי פונקציה של חומר T g, הדינמיקה של ספיגת מים, מתח קבוע. ככזה, בסכום של התאוששות תפקודית תשתנה בהתאם לטופוגרפיה קבוע. עם זאת, הטופוגרפיה נתון, משתנה כמות המתח בתפזורת יאפשר שליטה על קצב ההתאוששות טופוגרפית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות קלי א 'ברק על סיוע טכני בהכנת המצע ACC. מבוסס על מאמר שפורסם ב Biomaterials, דיוויס KA, et al, התנהגות התא דינמי על זיכרון צורה פולימר מצעים, Biomaterials, doi:. 10.1016/j.biomaterials.2010.12.006, זכויות יוצרים Elsevier (2011). חומר זה מבוסס על עבודה נתמכת על ידי ה-NSF תחת גרנט לא DMR-0907578.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NOA63 | Norland Products, Inc. | NOA63 | Lot number 111 |
| Dogbone Punch | TestResource, Inc. Shakopee, MN | Scaled-down Type IV dogbone (ASTM D638-03) | |
| Benchtop Hydraulic Press | Carver | 3851 | |
| C3H10T1/2 Mouse Embryonic Fibroblasts | ATCC | CCL-226 | |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 1357 | |
| UV Lamp | Spectroline | SB-100PC | |
| Dynamic Mechanical Analyzer (DMA) | TA Instruments | Q800 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Leica Microsystems | Leica DMI 4000B | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 710 | 20x/0.8 NA air or a 40x/1.30 NA oil objective |
References
- Liu, C., Qin, H., Mather, P. T. Review of progress in shape-memory polymers. J. Mater. Chem. 17, 1543-1543 (2007).
- Mather, P. T., Luo, X. F., Rousseau, I. A. Shape Memory Polymer Research. Annu. Rev. Mater. Res. 39, 445-445 (2009).
- Lendlein, A., Kelch, S. Shape Memory Polymers. Angew. Chem. Int. Edit. 41, 2034-2034 (2002).
- Ratna, D., Karger-Kocsis, J. Recent advances in shape memory polymers and composites: a review. J. Mater. Sci. 43, 254-254 (2008).
- Rousseau, I. A. Challenges of shape memory polymers: A review of the progress toward overcoming SMP's limitations. Polym. Eng. Sci. 48, 2075-2075 (2008).
- Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 13661-13661 (1997).
- Addae-Mensah, K. A., Kassebaum, N. J., Bowers, M. J., Reiserer, R. S., Rosenthal, S. J., Moore, P. E., Wikswo, J. P. A flexible, quantum dot-labeled cantilever post array for studying cellular microforces. Sensor Actuat. a-Phys. 136, 385-385 (2007).
- du Roure, O., Saez, A., Buguin, A., Austin, R. H., Chavrier, P., Siberzan, P., Ladoux, B. Force mapping in epithelial cell migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 2390-2390 (2005).
- Lam, T., Clem, W. C., Takayama, S. Reversible on-demand cell alignment using reconfigurable microtopography. Biomaterials. 29, 1705-1705 (2008).
- Stevens, M. M., George, J. H. Exploring and engineering the cell surface interface. Science. 310, 1135-1135 (2005).
- Tan, L., Tien, J., Pirone, D. M., Gray, D. S., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cells lying on a bed of microneedles: an approach to isolate mechanical. 100, 1484-1484 (2003).
- Teixeira, A. I., Nealey, P. F., Murphy, C. J. Responses of human keratocytes to micro- and nanostructured substrates. J. Biomed. Mater. Res. A. 71A, 369-369 (2004).
- Yang, M., Sniadecki, N., Chen, C. Geometric Considerations of Micro- to Nanoscale Elastomeric Post Arrays to Study Cellular Traction Forces. Adv. Mater. 19, 3119-3119 (2007).
- Zhao, Y., Zhang, X. Cellular Mechanics Study in Cardiac Myocytes Using PDMS Pillars Array. Sensor Actuat. a-Phys. 125, 398-398 (2006).
- DiOrio, A. M., Luo, X., Lee, K. M., Mather, P. T. A Functionally Graded Shape Memory Polymer. Soft Matter. 7, 68-68 (2011).
- Davis, K. A., Burke, K. A., Mather, P. T., Henderson, J. H. Dynamic cell behavior on shape memory polymer substrates. Biomaterials. 32, 2285-2285 (2011).
