Summary
बाह्य मैट्रिक्स का कठोरता दृढ़ता से पक्षपाती कोशिकाओं के कई व्यवहार को प्रभावित करती है. मैट्रिक्स कठोरता एक ऊतक भर spatially बदलता है, और विभिन्न बीमारी की स्थिति में संशोधन की प्रक्रिया. यहाँ हम परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी microindentation का उपयोग सामान्य और fibrotic माउस फेफड़े के ऊतकों में जकड़न में स्थानिक बदलाव विशेषताएँ तरीकों को विकसित.
Abstract
मैट्रिक्स कठोरता जोरदार वृद्धि, और पक्षपाती 1-3 कोशिकाओं के भेदभाव समारोह को प्रभावित करती है. मैक्रो पैमाने पर मानव शरीर के भीतर ऊतकों और अंगों की कठोरता 4 परिमाण के कई आदेशों अवधि. बहुत कम कैसे कठोरता ऊतकों के भीतर spatially बदलता है के बारे में जाना जाता है, और गुंजाइश है और कठोरता परिवर्तन के स्थानिक पैमाने पर रोग प्रक्रियाओं में क्या नतीजा है कि ऊतक remodeling में हैं. बेहतर ढंग से समझने कैसे मैट्रिक्स कठोरता में परिवर्तन सेलुलर शरीर विज्ञान के लिए स्वास्थ्य और रोग में योगदान करने के लिए, एक स्थानिक निवासी कोशिकाओं के लिए प्रासंगिक पैमाने पर प्राप्त ऊतक कठोरता के माप की जरूरत है. यह विशेष रूप से फेफड़ों, एक बेहद आज्ञाकारी और लोचदार ऊतक जिसमें मैट्रिक्स remodeling अस्थमा, वातस्फीति, उच्च रक्तचाप, और फाइब्रोसिस जैसे रोगों में एक प्रमुख विशेषता है के लिए सच है. एक स्थानिक निवासी कोशिकाओं के लिए प्रासंगिक पैमाने पर स्थानीय यांत्रिक पर्यावरण फेफड़ों parenchyma विशेषताएँ करने के लिए, हम सीधे ताजा murine फेफड़ों ऊतक का उपयोग परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) microindentation के स्थानीय लोचदार संपत्तियों को मापने के तरीके विकसित किया है. AFM मांगकर्ता, ब्रैकट, और इंडेंटेशन गहराई का उपयुक्त विकल्प के साथ, इन तरीकों चरण विपरीत और हित के क्षेत्र के प्रतिदीप्ति इमेजिंग के साथ समानांतर में स्थानीय ऊतक अपरुपण मापांक के माप अनुमति देते हैं. ऊतक स्ट्रिप्स के व्यवस्थित नमूने ऊतक यांत्रिक गुणों कि अपरुपण मापांक में स्थानीय स्थानिक विविधताओं से पता चलता है के नक्शे उपलब्ध कराता है. यांत्रिक गुणों और अंतर्निहित शारीरिक और रोग सुविधाओं के बीच Correlations का वर्णन कैसे कठोरता मैट्रिक्स बयान में तंतुमयता के साथ बदलता रहता है. इन विधियों अन्य मुलायम ऊतकों और रोग प्रक्रियाओं के लिए बढ़ाया जा सकता है प्रकट करने के लिए कैसे स्थानीय ऊतक यांत्रिक गुणों अंतरिक्ष और रोग प्रगति के पार भिन्न है.
Protocol
1. फेफड़े ऊतक पट्टी तैयार
- फेफड़े ऊतक बेहद आज्ञाकारी और AFM के लक्षण वर्णन के लिए स्ट्रिप्स में कटौती करना मुश्किल है. Transiently काटने के लिए फेफड़ों संरचना स्थिर, पृथक माउस फेफड़ों में 2% कम जेल बिंदु agarose (पीबीएस में तैयार) के 50 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन के साथ intratracheally बढ़ 37 सी. सेंटीग्रेड के लिए गर्म ट्रेकिआ बंद टाई और 4 में पीबीएस के एक स्नान में फुलाया फेफड़ों शांत ° C 60 मिनट के लिए. agarose जेल और airspaces में धीरे इस अंतराल के दौरान 5 फेफड़ों संरचना स्थिर ठोस बनाना होगा. उच्च agarose सांद्रता, यानी 3-4%, काटने के लिए ऊतक स्थिरीकरण करने के लिए आगे बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- कट या लंबाई और चौड़ाई में 5 एक्स 5 मिमी और मोटाई में 400 सुक्ष्ममापी के स्ट्रिप्स में स्केलपेल ब्लेड उस्तरा साथ agarose स्थिर माउस फेफड़े के ऊतकों, तो एक पीबीएस 37 के लिए पूर्व गर्म स्नान में स्ट्रिप्स धोने डिग्री सेल्सियस 100 मिलीलीटर का उपयोग एक बेंच टॉप 5 मिनट अवशिष्ट agarose हटाने के लिए गर्म हलचल थाली पर कांच बीकर. बड़े वायुमार्ग और जहाजों को बाहर करने के लिए, subpleural मुख्य स्टेम ब्रांकाई से दूर क्षेत्रों से स्ट्रिप्स में कटौती. यदि वायुमार्ग और बड़े जहाजों imaged किया जा रहे हैं, फेफड़े के ऊतकों से अधिक मुख्य स्टेम ब्रांकाई प्रॉक्सिमल स्ट्रिप्स में कटौती.
2. AFM Microindentation और प्रतिदीप्ति इमेजिंग
- ब्याज की AFM microindentation के लिए क्षेत्रों को अलग करने के लिए, ऊतक चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा visualized किया जा सकता है, या immunostained और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा visualized. Immunostaining के लिए, 5% वांछित माध्यमिक एंटीबॉडी के निर्धारण या कमरे के तापमान पर permeabilization के बिना 2 घंटे के लिए (पीबीएस में) के स्रोत से सीरम के साथ ऊतक स्ट्रिप्स ब्लॉक.
- उचित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊतक पट्टी को सेते हैं (जैसे खरगोश विरोधी कोलेजन मैं बीचवाला (1:250 कमजोर पड़ने) कोलेजन, खरगोश विरोधी laminin (1:250 कमजोर पड़ने) कल्पना करने के लिए तहखाने झिल्ली कल्पना) 12 अच्छी तरह से एक थाली के एक कुएं में 1 घंटे के लिए कोमल झटकों के साथ एक घुमाव पर, नमूना पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए 3 बार धो, 1 के लिए उपयुक्त माध्यमिक फ्लोरोसेंट टैग (जैसे Alexa Fluor 546 विरोधी खरगोश बकरी माध्यमिक एंटीबॉडी (1:250 कमजोर पड़ने)) संयुग्मित एंटीबॉडी द्वारा पीछा कमरे के तापमान पर घंटे.
- ऊतक स्ट्रिप्स पीबीएस और PBS में दुकान के साथ बड़े पैमाने पर 4 बजे धो डिग्री सेल्सियस
- यदि आवश्यक हो, सैंडविच, पट्टी, तुरंत पहले AFM के लक्षण वर्णन, एक पाली - एल Lysine लेपित coverslip 15 मिमी से अस्थायी ऊतक नीचे coverslip उठाने, यकीन है कि ऊतक पट्टी coverslip सतह पर समान रूप से फैलता है ऊतक पट्टी अनुलग्न के साथ एक दूसरे स्वच्छ, coverslip uncoated और हल्के दबाव लागू ऊतक अनुलग्नक के साथ पाली एल Lysine लेपित coverslip के लिए सहायता.
- AFM प्रणाली निर्माण अनुदेश microindentation प्रयोगों के प्रत्येक दौर से पहले तुरंत निम्नलिखित जांचना. दो महत्वपूर्ण पैरामीटर, और 2) ब्रैकट विक्षेपन संवेदनशीलता है, जो एक वास्तविक ब्रैकट विक्षेपन दूरी photodiode के उत्पादन में संकेत पैमाने पर इस्तेमाल किया पैरामीटर है Δd 1) ब्रैकट निरंतर वसंत हवा में 6 थर्मल अस्थिरता विधि का उपयोग कर: निर्धारित करते हैं. एक साफ कांच स्लाइड पर बल विस्थापन वक्र पीबीएस में एक मानक प्राप्त करने तब बल विस्थापन वक्र (Fig.1B) की ढलान की गणना के द्वारा विक्षेपन संवेदनशीलता जांचना. बल विस्थापन वक्र माप में, AFM टिप की ओर बढ़ाया है और एक ही स्थान पर नमूना की सतह (XY दिशाओं में rastering बिना) से मुकर ब्रैकट विक्षेपन, Δd टिप विस्थापन, Δz के एक समारोह के रूप में निगरानी के साथ, .
हम एक 5 सुक्ष्ममापी व्यास borosilicate गोलाकार टिप (Novascan) के साथ एक सिलिकॉन नाइट्राइड त्रिकोण ब्रैकट का उपयोग करने की अनुशंसा. AFM जांच का प्रयोग एक 0.06 एन / मीटर के निरंतर वसंत के साथ, हम यंत्रवत् कतरनी moduli 50,000 पा के लिए 100 फैले के साथ नरम सामग्री विशेषता.
- टिशू पेपर के साथ नमूना coverslip के नीचे की सतह पोछो, वैक्यूम तेल के साथ एक मानक गिलास स्लाइड जकड़ना, AFM नमूना मंच पर गिलास स्लाइड माउंट करने के लिए, और 500 μl पीबीएस (कमरे के तापमान) के साथ ऊतक कवर.
- आँख टुकड़ा देखने के लिए माइक्रोस्कोप सेट खुर्दबीन नमूना मंच समायोजन द्वारा AFM टिप देखने के क्षेत्र के केंद्र में संरेखित करने के लिए. AFM नमूना मंच चलती द्वारा ऊतकों पर ब्याज की एक क्षेत्र चुनें, और फिर चरण विपरीत छवि और / या ऊतक के प्रतिदीप्ति छवियों रिकॉर्ड, के रूप में वांछित देखने सीसीडी कैमरा स्विच.
- AFM टिप धीरे नीचे की ओर जब तक यह नमूने के साथ संपर्क में है के द्वारा मानक AFM सगाई आपरेशन प्रदर्शन.
- शीतल नमूनों की सटीक AFM microindentation लक्षण वर्णन छोटे खरोज गहराई से बचने के लिए बड़े स्थानीय उपभेदों जो हर्ट्ज लोचदार मापांक गणना के लिए इस्तेमाल किया मॉडल अमान्य की आवश्यकता है. बड़े उपभेदों से बचने के लिए, 500 एनएम ब्रैकट अधिकतम विक्षेपन (ट्रिगर बिंदु) की स्थापना के द्वारा ट्रिगर मोड में इंडेंटेशन प्रदर्शन. यह विक्षेपन सीमा को नियंत्रित करेगाअधिकतम इंडेंटेशन बल के कम से कम 30 NN (एफ = ब्रैकट वसंत निरंतर * विस्थापन, या F अधिकतम = 0.06 / NN एनएम * 500 एनएम = 30 NN) .
इंडेंटेशन वेग पर्याप्त लोचदार बल्कि नरम 7 नमूना के viscoelastic गुण का पता लगाने के लिए धीमी गति से किया जा करने के लिए चुना जाना चाहिए. प्रति सेकंड 2-20 सुक्ष्ममापी के वेग रेंज फेफड़े के ऊतकों के लिए उपयुक्त है.
- ब्याज की एक क्षेत्र से एक ही माप के लिए, AFM जांच हित के स्थान पर स्थानांतरित करने के लिए और एक एकल इंडेंटेशन प्रदर्शन करने के लिए एक मानक वक्र बल विस्थापन (XY स्कैनिंग के बिना जांच Z दिशा में ही चलता है) जमा.
- ब्याज की एक क्षेत्र के स्वचालित मानचित्रण के लिए सेना का नक्शा - मोड के लिए स्विच करने के लिए, चयनित क्षेत्र के भीतर स्कैन आकार और नमूना अंक का चयन करें. सेना का नक्शा - मोड में, इंडेंटेशन आंदोलनों के बीच सतह नमूना भर में AFM टिप rasters, और प्रत्येक बिंदु पर एक परिभाषित नमूना ग्रिड के भीतर व्यक्तिगत बल विस्थापन घटता एकत्र. और नमूने अंक उच्च स्थानिक संकल्प उपलब्ध कराने पर मानचित्रण के लिए आवश्यक समय लंबा होगा. हम यह व्यावहारिक एक 16 x 16 नमूना ग्रिड का उपयोग करने के लिए प्रति सेकंड 20 सुक्ष्ममापी, जो ~ 10 मिनट में पूरा किया जा सकता है की एक खरोज वेग में एक 80 x 80-सुक्ष्ममापी क्षेत्र का नक्शा मिला.
3. AFM डेटा निष्कर्षण
- यंग मापांक की गणना करने के लिए, हर्ट्ज गोलाकार इंडेंटेशन मॉडल कम से कम गैर रेखीय curving 8 फिटिंग (Fig.1 एक, सी) वर्गों का उपयोग करने के लिए बल - विस्थापन वक्र फिट:
जहां एफ कश्मीर ग = ग * Δ घ कश्मीर, ब्रैकट मोड़ बल ब्रैकट निरंतर वसंत का मौसम है, अनुसंधान क्षेत्र टिप त्रिज्या है, δ = z Δ Δ घ इंडेंटेशन है और υ नमूना पॉसों (अनुपात है υ = फेफड़ों ऊतक 9 के लिए) 0.4. - फिट की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए गैर रेखीय वक्र ढाले के दौरान SSR मूल्य, या डेटा और फिट मूल्यों के बीच अंतर के वर्गों का योग की गणना. बड़े SSR मूल्यों के साथ "बुरा" घटता से डेटा discarding द्वारा अविश्वसनीय या संयुक्त राष्ट्र व्याख्या माप हटा दें.
- अगर वांछित, लोचदार मापांक (ई) से अपरुपण मापांक (जी) के लिए कन्वर्ट, रिश्ते का उपयोग कर ई = 2 x 1 (+ υ x) जी फोर्स का नक्शा - मोड में एकत्र कठोरता के स्थानिक पैटर्न कल्पना करने के लिए, साजिश समोच्च नक्शे में डेटा मापांक (16 x 16 नमूना ग्रिड में जैसे एक 80 x 80-सुक्ष्ममापी क्षेत्र को कवर).
- बल वक्र डेटा की एक बड़ी राशि की प्रक्रिया करने के लिए, एक कस्टम एल्गोरिथ्म के लिए स्वचालित रूप से विस्थापन के बल घटता, निकालने moduli, और / या साजिश elastographs एक ही प्रक्रियाओं और मानकों का उपयोग कर के रूप में 3.2 और 3.3 (जैसे Matlab) में उल्लिखित फिट करने के लिए लिखा जा सकता है.
चित्रा 1 (एक) एक कठोर सब्सट्रेट पर एक गोलाकार जांच (Dimitriadis ई., एट अल 2002 Biophys 8 जम्मू से अनुमति के साथ Reproduced) का उपयोग कर एक नरम नमूना AFM microindentation के योजनाबद्ध. (बी) के प्रतिनिधि बल विस्थापन वक्र पीबीएस में एक साफ कांच स्लाइड ब्रैकट विक्षेपन संवेदनशीलता निर्धारित से एकत्र. (सी) प्रतिनिधि बल विस्थापन घटता (नीला) नरम और कठोर (लाल) (ए) से तदनुरूप पैरामीटर दिखा नमूने से एकत्र.
4. प्रतिनिधि परिणाम:
चित्रा 2A एक फेफड़ों parenchyma पीबीएस में पाली एल Lysine लेपित coverslip पर एक AFM जांच के साथ सीधे हित के क्षेत्र के ऊपर जगह में संलग्न है और microindentation मानचित्रण के लिए तैयार पट्टी से पता चलता है. चित्रा 2B से पता चलता है कि ठीक कटौती और दाग ऊतकों में, फेफड़ों parenchyma के वायुकोशीय microarchitecture अच्छी तरह से संरक्षित है के रूप में निर्धारण या permeabilization बिना तहखाने झिल्ली घटक laminin के लिए immunofluorescent धुंधला द्वारा मनाया. चित्रा 2 मैं ताजा unfixed पहले पीबीएस (छवि 2C) के साथ इलाज चूहों से काटा, या bleomycin (छवि 2 डी) के साथ इलाज के लिए 10 तंतुमयता प्रेरित फेफड़ों में कोलेजन के लिए सीडी शो immunofluorescent धुंधला हो जाना.
चित्रा 3A बल विस्थापन नमूना भूखंडों AFM microindentation से प्राप्त से पता चलता है. एक ही लागू शक्ति के साथ, AFM टिप एक नरम क्षेत्र (नीली रेखा) पर एक बड़े खरोज उत्पन्न करता है, एक अपेक्षाकृत "फ्लैट" एक छोटे और एक stiffer क्षेत्र के लिए एक "खड़ी" वक्र बल विस्थापन इंडेंटेशन बनाम बल विस्थापन वक्र में जिसके परिणामस्वरूप ( लाल रेखा). आदेश में साफ बल घटता प्राप्त करने के लिए, प्रत्येक इंडेंटेशन के बाद AFM टिप नमूना और अगले इंडेंटेशन पहले संपर्क की मुक्त सतह से पूरी तरह मुकर की जरूरत है. यह संपर्क मुक्त राज्य चित्रा 3A, जहां टिप ब्रैकट विक्षेपन के बिना तब्दील में वक्र के फ्लैट क्षेत्र से मेल खाती है है. चित्रा 3B एक फ्लैट क्षेत्र के बिना एक ठेठ झूठी वक्र है जो तब होती है जब टिप नमूना की सतह से पूरी तरह मुकर नहीं है (जैसे नरम एक नमूना दिखाता है) टिप संपर्क बिंदु निर्धारित करने के लिए यह असंभव बना ttaches है. यदि टिप पूरी तरह से नरम नमूने में फंस गया है, वक्र के रूप में चित्र 3C में दिखाया गया है स्पष्ट विक्षेपन लेकिन छोटे शोर के बिना, लग सकता है.
चित्रा 4 अपरुपण मापांक बल विस्थापन कठोरता (elastographs) नक्शे, अपरुपण मापांक के साथ रंग जहाँ तराजू के रूप में प्रदर्शित spatially घटता से निकाले डेटा से पता चलता है. Elastographs ऊतक अपरुपण मापांक के वितरण में सामान्य श्रेणी में हड़ताली मतभेद (4A छवि) और विशेष रूप से fibrotic फेफड़ों नमूना भीतर (4B छवि) fibrotic फेफड़ों parenchyma, और अपरुपण मापांक में बड़े स्थानिक भिन्नरूपों, प्रदर्शित करता है.
चित्रा 2 (ए) चरण विपरीत एक माउस फेफड़ों parenchyma पट्टी पर एक AFM जांच दिखा माइक्रोग्राफ. स्केल बार, 50 सुक्ष्ममापी. (बी) laminin के सामान्य माउस फेफड़े के ऊतकों में Immunostaining सामान्य फेफड़ों parenchyma के वायुकोशीय microarchitecture दिखा. व्हाइट बॉक्स ठेठ लोच 80 द्वारा 80μm मानचित्रण क्षेत्र को इंगित करता है. स्केल पट्टी: 20 सुक्ष्ममापी. मैं खारा (सी) और (डी) bleomycin इलाज माउस फेफड़ों parenchyma में कोलेजन के Immunostaining (सी और डी). स्केल सलाखों, 100 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 3 (ए) प्रतिनिधि व्याख्या बल विस्थापन घटता खारा (नीला) और bleomycin का इलाज (लाल) माउस फेफड़ों parenchyma से एकत्र, क्रमशः. काले लाइनों सबसे अच्छा फिट गोलाकार हर्ट्ज मॉडल से उत्पन्न कर रहे हैं और उनकी इसी गणना युवा moduli के साथ लेबल है. (बी, सी) प्रतिनिधि संयुक्त राष्ट्र व्याख्या बल विस्थापन घटता.
चित्रा 4 प्रतिनिधि खारा (ए) और bleomycin का इलाज (बी) माउस फेफड़ों parenchyma से एकत्र elastographs. रंग सलाखों kilopascals में अपरुपण मापांक से संकेत मिलता है. अक्ष लेबल micrometers में स्थानिक स्तर का संकेत मिलता है. स्केल पट्टी: 20 सुक्ष्ममापी
Discussion
फेफड़ों AFM microindentation का उपयोग ऊतक के यांत्रिक लक्षण वर्णन अभूतपूर्व स्थानिक संकल्प (4 छवि) प्रदान करता है, ऊतक कठोरता में microscale रूपांतरों पर एक अद्वितीय परिप्रेक्ष्य प्रदान करते हैं. इसकी उपयोगिता का एक उदाहरण के रूप में सामान्य और fibrotic फेफड़े के ऊतकों स्ट्रिप्स में पिछले वृहद पैमाने पर मापन 11,12 तंतुमयता के साथ एक अनुमानित 2 - 3 गुना elastance में वृद्धि का संकेत दिया. इसके विपरीत, AFM microindentation से पता चलता है कि ऊतक stiffening अत्यधिक स्थानीयकृत ~ सामान्य फेफड़ों ऊतक 10 में मनाया औसत से ऊपर अपरुपण मापांक में 30 गुना बढ़ जाती है के लिए कुछ क्षेत्रों का प्रदर्शन के साथ है. मैट्रिक्स कठोरता के रूप में अब के लिए गंभीर सेल समारोह को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है, इन स्थानीय माप अमूल्य पैरामीटर प्रदान करने के लिए फेफड़ों की कोशिकाओं के सेल संस्कृति अध्ययन के biofidelity बढ़ाने.
कई व्यावहारिक मुद्दों फेफड़े के ऊतकों की पतली स्ट्रिप्स के उपयोग के साथ उत्पन्न होती हैं. स्ट्रिप्स के सतहों पूरी तरह से फ्लैट नहीं कर रहे हैं के रूप में ऊतक प्रोफ़ाइल अंतर्निहित अलवियोली की वास्तुकला इस प्रकार है. AFM प्रणाली स्वतः खरोज दौरान Z दिशा में टिप की स्थिति समायोजित कर देता है जब नमूना सतह ऊंचाई भिन्नता 15 - सुक्ष्ममापी की तुलना में छोटे के लिए इस चुनौती पर काबू पाने में मदद है. माप कमरे के तापमान ° सी नहीं 37 पर बना रहे हैं, तो तापमान में इस बदलाव की वजह से यांत्रिक गुणों में विचलन, मूल्यांकन नहीं किया जा हालांकि वे मामूली होने की उम्मीद होगी. मनाया यांत्रिक गुणों पर अंतर्निहित वायुकोशीय दीवार वास्तुकला के प्रभाव वर्तमान प्रकाश माइक्रोस्कोपी सेटअप के साथ तय कर पाना मुश्किल है. उदाहरण के लिए, यह वांछनीय हो सकता है निर्धारित करने के लिए अगर वायुकोशीय दीवारों anisotropy और विभिन्न यांत्रिक गुणों का प्रदर्शन जब साथ गठबंधन या दीवार के विमान के लिए अनुप्रस्थ दिशाओं में दांतेदार बना होगा. हालांकि, मौजूदा नमूनों मोटी हैं और इमेजिंग प्रणाली 3D क्षमताओं नहीं है, इसलिए यह संभव संपर्क के प्रत्येक बिंदु पर स्थानीय वायुकोशीय दीवार ओरिएंटेशन निर्धारित नहीं है. अंत में, मापा यांत्रिक गुणों पर सेलुलर घटक के प्रभाव को पूरी तरह से elucidated किया जाना बना रहता है. यहाँ विस्तृत तरीकों में कोई प्रयास के लिए विशेष रूप से ऊतक के सेलुलर घटक को हटाने के लिए बना रहे हैं. हालांकि, कोशिकाओं इंडेंटेशन के लिए उपलब्ध है की सतह पर मौजूद ऊतक फसल और ऊतकों को काटने के लिए अलवियोली के लिए पहुँच प्राप्त करने की आवश्यकता के बाद से elapsed समय दिया व्यवहार्य हो की संभावना नहीं कर रहे हैं. विशिष्ट कोशिकाओं को हटाने के लिए, या व्यवहार्य कोशिकाओं के साथ matrices जनसंख्या फिर से बढ़ा है, और ऊतक कठोरता में जिसके परिणामस्वरूप परिवर्तन का मूल्यांकन प्रयोगों warranted प्रकट होता है.
क्योंकि ताजा unfixed ऊतक इन मापों के लिए की जरूरत है, ऊतक फसल से माप elapsed समय और कम से कम किया जाना चाहिए है डिग्री सेल्सियस यांत्रिक गुणों में परिवर्तन से बचने के लिए नमूने 4 में संग्रहित किया जाना चाहिए. जब भी ऊतक स्ट्रिप्स कंटेनरों के बीच धोने या तो धुंधला हो जाना है कि न्यूनतम विरूपण या क्षति उत्पन्न होता है के दौरान स्थानांतरित कर रहे हैं विशेष रूप से ध्यान दिया जाना चाहिए. तरल में AFM के आवेदन के लिए एक महत्वपूर्ण कदम के रूप में संभव के रूप में फ्लैट ऊतक में कटौती और समर्थन coverslip पर नमूना स्थिर है. यदि उपलब्ध है, एक स्वचालित सेक्शनिंग एक vibratome या ऊतक slicer के रूप में ऐसी मशीन अत्यधिक वर्दी मोटाई के स्लाइस में कटौती के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ऊतक स्ट्रिप्स तुरंत पहले AFM माप देते AFM माप के लिए elapsed समय के रूप में नमूना अंततः coverslips से अलग होगा कम से कम यह महत्वपूर्ण है. एक उपयोगी टिप्पणी है कि बड़े स्ट्रिप्स अधिक फिसल जाता है कवर और पीबीएस में छोटे स्ट्रिप्स से अधिक लंबी durations के लिए जगह में रहते हैं stably देते हैं दिखाई देते हैं.
AFM microindentation 100 पा से 50 kPa (अपरुपण मापांक) के लिए एक व्यापक रेंज फैले नमूनों जब एक 5 सुक्ष्ममापी व्यास गोलाकार टिप के साथ एक मानक 0.06 N / मीटर ब्रैकट का उपयोग चिह्नित कर सकते हैं. गोलाकार कांच 0.01 से लेकर 0.58 एन / मीटर व्यास और वसंत स्थिरांक में 0.6 से 12 सुक्ष्ममापी से वाणिज्यिक (जैसे Novascan) उपलब्ध है और आमतौर पर 3 इस्तेमाल किया लेकर सुझावों के साथ AFM जांच, इस रेंज अलग वसंत स्थिरांक के साथ जांच का उपयोग करके विस्तारित किया जा सकता है. एक 5 सुक्ष्ममापी गोलाकार टिप के साथ, टिप और ऊतकों के बीच सैद्धांतिक संपर्क क्षेत्र 400-700 एनएम खरोज (छवि 1A) के लिए 5-9 के बारे में 2 सुक्ष्ममापी है. छोटे या बड़े सुझावों स्थानिक संकल्प के छोटे या बड़े पैमाने प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. पिरामिड सुझावों AFM microindentation 13-16 में भी इस्तेमाल किया गया है, छोटे संपर्क क्षेत्रों प्रदान करने और इस तरह मानचित्रण में स्थानिक संकल्प में वृद्धि, हालांकि डेटा फिटिंग इस टिप ज्यामिति के लिए और अधिक जटिल है.
इस विधि के लिए कई सीमाओं ध्यान दिया जाना चाहिए. फेफड़ों यंत्रवत् है परंपरागत गैर invasively दबाव मात्रा 17 विश्लेषण या पूरे फेफड़ों के पंच - इंडेंटेशन 19,20 का उपयोग उदाहरण के लिए, विशेषता . यहाँ हवा तरल int के नुकसान के माध्यम से महत्वपूर्ण मायनों में फेफड़ों वास्तुकला बदल वर्णित एक जैसे आक्रामक तरीकेerface है कि आम तौर पर हवा भरे फेफड़ों और पूर्व तनाव के नुकसान है कि सांस की मांसपेशियों की छूट पर फेफड़ों आंशिक मुद्रास्फीति रखता में मौजूद है. इन सीमाओं को फेफड़े के ऊतकों 18 स्ट्रिप्स में किए गए सभी मापन के लिए आम हैं. विशेष रूप से, तथापि, मंझला कठोरता सामान्य फेफड़े के ऊतकों के parenchyma (अपरुपण मापांक 0.5kPa ~) में मापा आराम 19,20 मात्रा पर बरकरार फेफड़ों के पंच - इंडेंटेशन के आधार पर अनुमान से अलग नहीं है काफी . जबकि फेफड़े के ऊतकों बढ़ती विरूपण के साथ गैर रेखीय stiffening प्रदर्शन के लिए जाना जाता है, यह संभव नहीं है एक कठोर फैशन में परीक्षण है कि इस संपत्ति सूक्ष्म पैमाने के लिए नीचे यहाँ नियोजित तरीके के साथ बनी रहती है. हर्ट्ज मॉडल नमूने की समरूपता हो जाती है. हालांकि, फेफड़ों parenchyma सहित सबसे जैविक सामग्री, तेजी से स्थानिक तराजू घटते पर विषम हैं. नमूना की विविधता यंग मापांक के खरोज की गहराई पर निर्भर करता है, अर्थात् परत या घटक है कि deforming है पर निर्भर करता है भिन्नता की तरह कलाकृतियों में परिणाम कर सकते हैं. xy विमान में विविधता ध्यान से उपयुक्त गोलाकार टिप आकार Dimitriadis ई.के. एट अल द्वारा प्रस्तावित के रूप में biomaterial के microstructure पर निर्भर करता है चुनने के द्वारा सीमित किया जा सकता यह 8 अधिक मुश्किल भविष्यवाणी करने या हर्ट्ज मॉडल सामग्री के लिए कारण त्रुटि सही है. z दिशा में विविधता. Azeloglu एट अल. हाल ही में एक संकर कम्प्यूटेशनल मॉडल के असतत एम्बेडेड 21 inclusions के साथ विषम सब्सट्रेट की लोचदार संपत्तियों विशेषताएँ प्रस्ताव. उनकी नई तकनीक प्रदान करता है एक संभावित विषम Hertzian विश्लेषण की सीमाओं पर काबू पाने सामग्री का समावेश गुण की गणना का मतलब है.
हर्ट्ज मॉडल भी पूर्ण लोचदार व्यवहार मानता है, जबकि जैविक सामग्री आम तौर पर समय पर निर्भर viscoelastic व्यवहार प्रदर्शित. ऊतक के एक पूर्ण viscoelastic लक्षण वर्णन इंडेंटेशन इस्तेमाल किया वेग अलग से प्राप्त किया जा सकता है. महत्वपूर्ण बात है, पिछले वृहद पैमाने पर सामान्य और fibrotic फेफड़े के ऊतकों के यांत्रिक परीक्षण फेफड़े के ऊतकों के यांत्रिक गुणों के कमजोर आवृत्ति निर्भरता, और सभी आवृत्तियों भर में सामान्य और fibrotic ऊतक यांत्रिक गुणों के बीच मतभेद के संरक्षण को दर्शाता है 11 का परीक्षण किया. इन निष्कर्षों को दृढ़ता से सुझाव है कि यांत्रिक AFM के साथ एक एकल इंडेंटेशन वेग का उपयोग गुणों की माप ऊतक यांत्रिक गुणों में परिवर्तन है कि तंतुमयता के साथ का एक अनिवार्य पहलू को दर्शाता है.
पॉसों के अनुपात 0.4 फेफड़ों के इस काम में इस्तेमाल किया ऊतक के लिए के एक macroscopic 9 माप से है . दुर्भाग्य से, सूक्ष्म पैमाने पर पॉसों के अनुपात और रोग की शर्त के तहत किसी भी परिवर्तन साहित्य में उपलब्ध नहीं हैं. ई / ई (1 υ 2) या (1 υ 2) / πE विकल्प (के रूप में लोचदार निरंतर कश्मीर चिह्नित) 22 AFM microindentation से गणना की जा सकता है और रिपोर्ट जब पॉसों के अनुपात अज्ञात है. पॉसों के अनुपात सबसे biomaterials के लिए अपने उच्च पानी सामग्री के कारण 0,4 से 0,5 की रेंज में है. 0.3-0.5 रेंज के भीतर, 1 / (1 υ 2) कारक 1.10-1.33 से ही बदलता है, जैसे कि पॉसों के अनुपात में उचित बदलाव रिपोर्ट मापांक पर केवल मामूली प्रभाव डालती है. अपरुपण मापांक है कि हम सामान्य ऊतकों को fibrotic ऊतक रिश्तेदार के लिए रिपोर्ट में वृद्धि परिमाण में कई गुना है, जिसका अर्थ है कि पॉसों के अनुपात में बदलाव के साथ जुड़े त्रुटियों यांत्रिक गुणों में परिवर्तन मनाया मामूली रिश्तेदार हैं.
वास्तविक एल्गोरिथ्म और कोड है कि बल विस्थापन डेटा के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है विशिष्ट अनुप्रयोग हालत और बल विस्थापन घटता के विविध आबादी के बाद विशेषताओं के अधीन है. यदि और अधिक परिष्कृत विश्लेषण ब्याज की है, एक लिन एट अल के काम से परामर्श 23. सकता है. लेखक एक एल्गोरिथ्म है कि जटिलताओं कि पहले इंडेंटेशन डेटा की हर्ट्ज मॉडल की फिटिंग को स्वचालित करने के प्रयासों अवस्र्द्ध है के कई पर काबू में synergistic रणनीतियों की एक श्रृंखला तैयार की.
कई अन्य क्षेत्रों में आगे और इस पद्धति का विकास शोषण के लिए उपलब्ध हैं. मामलों में जहां एक एंटीबॉडी लेबलिंग के बिना वायुकोशीय दीवारों visualizing में रुचि है, दोनों elastin और कोलैजेन उनके हरे रंग स्पेक्ट्रम में autofluorescent संकेत से visualized किया जा सकता है. दूसरी ओर, बेहतर इमेजिंग, या तो पतली ऊतक वर्गों, 3 डी इमेजिंग तकनीक, या दोनों का उपयोग कर, के यांत्रिक गुणों अंतर्निहित ऊतक वास्तुकला के साथ सहसंबंधी की क्षमता को बढ़ा सकता है. जबकि मौजूदा तरीकों धुंधला हो जाना और कोलेजन और laminin जैसे बाह्य मैट्रिक्स घटकों के दृश्य की अनुमति, अतिरिक्त प्रयास कोशिका की सतह मार्करों धुंधला के लिए विशेष सेल आबादी की पहचान और ऐसी आबादी के आसपास के क्षेत्र में यांत्रिक microenvironments विशेषताएँ करने के उद्देश्य से किया जा सकता है. ऑल्टernatively, ऊतक मार्करों या सेल विशिष्ट प्रोटीन वंश fluorescently टैग व्यक्त करने के लिए एक ही लक्ष्य का पीछा चूहों से काटा जा सकता है है. अंत में, विधि यहाँ विस्तृत अच्छी तरह से करने के लिए फेफड़ों में अन्य संरचनात्मक सुविधाओं जैसे उच्च रक्तचाप में जो फिर से तैयार बर्तन, अस्थमा में जो फिर से तैयार करना और वायुमार्ग, निस्र्पक अनुकूल प्रतीत होता है. और आगे बढ़ाने के लिए क्षमता विकास की वर्तमान स्थिति के आधार पर AFM microindentation ऊतक कठोरता में परिवर्तन है कि फेफड़ों में रोग प्रगति के साथ में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि उपज के लिए तैयार दिखाई देता है, और नहीं में स्थानिक और लौकिक परिवर्तन निस्र्पक में मूल्य का हो शक नहीं होगा अन्य मुलायम ऊतकों की एक किस्म की कठोरता.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम चल रहे उनके सहयोग के लिए ए Tager और बी एक प्रकार का वृक्ष धन्यवाद, और फेफड़ों के प्रदर्शन प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया ऊतक प्रदान करने के लिए यहाँ. यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य HL +०,९२,९६१ अनुदान संस्थान के द्वारा समर्थित किया गया था. इस काम के हिस्से में नेनो पैमाने सिस्टम (सीएनएस), राष्ट्रीय नैनो इंफ्रास्ट्रक्चर नेटवर्क का एक सदस्य है, जो NSF पुरस्कार ईसीएस +०३३५७६५ के अंतर्गत राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित है के लिए केंद्र में प्रदर्शन किया गया था. सीएनएस हार्वर्ड विश्वविद्यालय में कला और विज्ञान के संकाय का हिस्सा है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM tip | Novascan Technologies, Inc. | PT.GS | 5 micron Borosilicate bead, 0.06 N/m |
| Poly-L-Lysine coverslips | VWR international | 354085 | BD BioCoat 12 mm round No.1 glass |
| Agarose, Low Gelling Temperature | Sigma-Aldrich | A0701 | |
| Rabbit anti-Collagen I (Rb pAb) antibody | Abcam | ab34710-100 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit antibody | Invitrogen | A11010 | |
| Rabbit anti-Laminin | Sigma-Aldrich | L9393 |
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