Mikromekaniska Karakterisering av lungvävnad Använda atomkraftsmikroskopi

Summary

Styvheten i den extracellulära matrisen påverkar i hög grad flera beteenden från tillhörande celler. Matrix styvhet varierar rumsligt under en vävnad, och genomgår förändring i olika sjukdomstillstånd. Här utvecklar vi metoder för att karakterisera rumsliga variationer i stelhet i normal och fibrotiska mus lungvävnad med hjälp av atom mikrointryckt kraft mikroskopi.

Abstract

Matrix styvhet påverkar starkt tillväxt, differentiering och funktion av vidhäftande celler ^1-3. På makroskala styvheten i vävnader och organ i kroppen spänner över flera storleksordningar ^4. Mycket mindre är känt om hur styvheten varierar rumsligt i vävnader, och vad omfattningen och rumslig skala av stelhet förändringar i sjukdomens processer som resulterar i vävnaden ombyggnad. För att bättre förstå hur förändringar i matrisen styvhet bidrar till cellulär fysiologi vid hälsa och sjukdom, är mätningar av vävnad styvhet erhålls vid en rumslig skala relevant bosatt celler behövs. Detta gäller särskilt för den lunga, en mycket kompatibel och elastisk vävnad där matrisen remodeling är ett framträdande inslag i sjukdomar som astma, emfysem, högt blodtryck och fibros. Att karakterisera den lokala mekaniska miljö lungparenkym på en rumslig skala är relevant för bosatta celler, har vi utvecklat metoder att direkt mäta den lokala elastiska egenskaper av färska murina lungvävnad med hjälp av atomkraftsmikroskopi (AFM) mikrointryckt. Med lämpligt val av AFM indentor, grenställ och indrag djup, dessa metoder möjliggör mätningar av lokala modul vävnad skjuvning parallellt med fas kontrast och fluorescens avbildning av regionen av intresse. Systematisk provtagning av vävnad remsor innehåller kartor över vävnad mekaniska egenskaper som avslöjar lokala rumsliga variationer i skjuvstyrka. Samband mellan mekaniska egenskaper och bakomliggande anatomiska och patologiska funktioner illustrerar hur styvheten varierar med matris deponering i fibros. Dessa metoder kan utsträckas till andra mjuka vävnader och processer sjukdom att avslöja hur de lokala vävnaden mekaniska egenskaperna varierar mellan utrymme och sjukdomsutveckling.

Protocol

1. Lungvävnad Strip Förberedelser

1. Lungvävnad är mycket kompatibel och svårare att skära i remsor för AFM karakterisering. För att tillfälligt stabilisera lungstrukturen för kapning, blåsa isolerade mus lungorna intratracheally med 50 ml / kg kroppsvikt med 2% låg gel punkt agaros (beredd enligt PBS) värmts till 37 ° C. Knyt av luftstrupen och kyla uppblåsta lungor i ett bad av PBS vid 4 ° C i 60 minuter. Den agarosen kommer gel och stelna i luftrummen att försiktigt stabilisera lungstrukturen under denna period ^5. Högre agaros koncentrationer, dvs 3-4%, kan användas för att ytterligare förbättra vävnad stabilisering för kapning.
2. Skär agarosen stabiliserad vävnad mus lunga med ett rakblad eller skalpell blad i remsor av 5 x 5 mm i längd och bredd och 400 mikrometer i tjocklek, sedan tvätta remsorna i ett PBS bad förvärmas till 37 ° C med hjälp av en 100 ml glasbägare på en bänkbaserade uppvärmda rör plattan i 5 minuter för att avlägsna rester av agaros. För att utesluta stora luftvägarna och fartyg, skära remsor från subpleural regioner långt från huvudstam bronker. Om luftvägarna och stora fartyg som ska avbildas, skära remsor från lungvävnad mer proximalt huvudstam bronker.

2. AFM mikrointryckt och fluorescens avbildning

1. Att isolera områden av intresse för AFM mikrointryckt, kan vävnad visualiseras genom faskontrast mikroskopi, eller immunostained och visualiseras genom fluorescensmikroskopi. För immunfärgning, blockera vävnad strips med 5% serum från källan önskad sekundär antikropp (i PBS) i 2 timmar utan fixering eller permeabilization vid rumstemperatur.
2. Inkubera vävnaden band med lämpliga primära antikroppen (t.ex. kanin anti-kollagen jag att visualisera interstitiell kollagen (1:250 utspädning), kanin anti-laminin (1:250 utspädning) för att visualisera basalmembranet) i en brunn på en 12-brunnar på en rocker med försiktig skakning för 1 timme, tvätta prov 3 gånger i 5 minuter med PBS, åtföljt av lämpliga sekundär antikropp konjugerad med fluorescerande tagg (t.ex. Alexa Fluor 546 get-anti-kanin sekundär antikropp (1:250 utspädning)) för en timme i rumstemperatur.
3. Tvätta vävnad strips mycket med PBS och förvara i PBS vid 4 ° C
4. Omedelbart före AFM karakterisering, fästa vävnad band till en poly-L-lysin-belagda 15-mm täckglas genom att lyfta täckglaset underifrån den flytande vävnad, se till att vävnaden band sprider jämnt på täckglas ytan, om nödvändigt, smörgås remsan med en andra ren, obestruket täckglas och tillämpa milda påtryckningar för att hjälpa till med vävnad bilaga till poly-L-lysin-belagda täckglas.
5. Kalibrera AFM-systemet efter tillverkningen instruktion omedelbart före varje omgång av mikrointryckt experiment. Bestäm två kritiska parametrar: 1) fribärande fjäderkonstanten med hjälp av den termiska fluktuationer metoden i luften ^6, och, 2) fribärande nedböjningen känsligheten, vilket är en parameter som används för att skala signalen fotodiod utgång till den verkliga fribärande nedböjningen avstånd, Δd. Kalibrera omläggning känsligheten genom att erhålla en standard kraft-förskjutning kurva i PBS på en ren glasskiva då beräkna lutningen på kraft-förskjutningen kurva (Fig.1B). I kraft-förskjutning kurva mätning är AFM spets utsträckt mot och tillbaka från provet ytan på en enda plats (utan rastrering i XY riktningar), med riktningen på de fribärande, Δd, övervakas som en funktion av spets förskjutning Δz .

Vi rekommenderar att använda en kisel fribärande nitrid triangel med en 5-ìm diameter borosilikat sfärisk spets (Novascan). Använda AFM sonder med en fjäder konstant 0,06 N / m, vi har präglat mekaniskt mjuka material med skjuvmodulerna spänner 100 till 50.000 Pa.

6. Torka av bottenytan av provet täckglas med silkespapper, fäst den till en vanlig glasskiva med vakuum fett, montera glaset glida på AFM prov scenen och täcka vävnaden med 500 l PBS (rumstemperatur).
7. Ställ mikroskop för okular ser att anpassa AFM spets i centrum av synfältet genom att justera scenen mikroskop provet. Välj ett område av intresse på vävnaden genom att flytta AFM prov scenen, byt sedan till CCD-kamera visar att spela in bild faskontrast och / eller fluorescens bilder av vävnad, som önskat.
8. Utför vanliga AFM engagemang drift genom att flytta AFM spets sakta nedåt tills den är i kontakt med provet.
9. Exakt AFM mikrointryckt karakterisering av mjuka prover kräver små indrag djup för att undvika stora lokala stammar som ogiltigt Hertz modell som används för elasticitetsmodul beräkning. För att undvika stora påfrestningar, utför fördjupning i utlösa läge genom att ställa omläggning fribärande högsta (brytpunkt) till 500 nm. Denna omläggning gräns håller fast denmaximal indrag kraft till mindre än 30 NN (F = fribärande fjäderkonstant * förskjutning, eller F _max = 0,06 nN / nm * 500 nm = 30 NN).

Indraget hastigheten skall väljas vara tillräckligt långsam för att utforska elastiska snarare viskoelastiska egenskaper mjuka prov ^7. En hastighet rad 2-20 ìm per sekund är lämplig för lungvävnad.

10. För en enskild mätning från ett område av intresse, flytta AFM sond till platsen av intresse och utföra en inbuktning för att samla en standard kraft-förskjutning kurva (sonden rör sig endast i Z-riktning utan XY skanning).
11. För automatisk kartläggning av ett område av intresse, byta till Force-Map-läget, välj skanningsstorlek och pekar provet inom det markerade området. I Force-Karta läge samlar AFM spets raster över provets yta mellan indrag rörelser och enskilda kraft-förskjutningen kurvorna vid varje punkt inom ett definierat urval rutnät. Mer provtagningspunkter ger högre spatial upplösning men förlänga den tid som krävs för mappning. Vi fann det praktiskt att använda en 16 x 16 prov rutnät för att kartlägga ett 80 x 80-ìm område vid en inbuktning hastighet av 20 m per sekund, som kan fyllas i ~ 10 minuter.

3. AFM Dataextrahera

1. För att beräkna Youngs modul, passa kraft-förskjutning kurva till Hertz sfäriska indraget modell med minstakvadratmetoden icke-linjär böjda montering ⁸ (figur 1 A, C):
   
   där F = k _c * Δ d, är den kraft att böja fribärande, k _C cantilever fjäderkonstanten, R sfär nosradie, δ = Δ z - Δ d är indraget och υ är provets Poissons tal (υ = 0,4 för lungvävnad ^9).
2. För att bedöma kvaliteten på passformen, beräkna SSR värde eller att summan av kvadraterna av skillnaden mellan data och passar värden, under den icke-linjära kurvan montering. Eliminera otillförlitlig eller UN-tolkningsbara mätningar genom att kasta data från "dåliga"-kurvor med stora SSR värden.
3. Om så önskas, konvertera elasticitetsmodul (E) till skjuvmodul (G), med hjälp av förhållandet E = 2 x (1 + υ) x G. För att visualisera rumsliga mönster av styvhet som samlats in i Force-Map-läge, tomt modul data i konturkartor (t.ex. 16 x 16 prov rutnät som täcker ett 80 x 80-ìm område).
4. Att behandla en stor mängd data kraftkurva får en egen algoritm för att skrivas för att automatiskt passa kraft-förskjutning kurvor, extrakt böjmotståndet, och / eller elastographs tomt med samma procedurer och parametrar som beskrivs i 3.2 och 3.3 (t.ex. Matlab).

Figur 1 (A) Schematisk av AFM mikrointryckt en mjuk prov på ett styvt underlag med hjälp av en sfärisk sond (återges med tillstånd från Dimitriadis E., et al. 2002 Biophys J ^8). (B) representativ kraft-förskjutning kurva samlas in från en ren glasskiva i PBS för att bestämma känsligheten fribärande deformationen. (C) representativ kraft-förskjutning kurvor samlas in från mjuk (blå) och styv (röd) prover visar motsvarande parametrar från (A).

4. Representativa resultat:

Figur 2a visar en remsa lungparenkym fäst på poly-L-lysin belagda täckglas i PBS med ett AFM sonden på plats direkt ovanför regionen av intresse och redo för mikrointryckt kartläggning. Figur 2B visar att väl klippa och färgade vävnad, är det alveolära mikroarkitektur av lungparenkym välbevarade, som observerats av immunofluorescerande färgning av basalmembranet komponent laminin utan fixering eller permeabilization. Figur 2 CD visa immunofluorescerande färgning av kollagen jag i färskt ofixerade lungorna skördas från möss som tidigare behandlats med PBS (Fig. 2C), eller behandlas med bleomycin (Fig. 2D) för att inducera fibros ^10.

Figur 3A visar prov kraft-förskjutning tomter från AFM mikrointryckt. Med samma gäller kraft, genererar AFM spets en stor inbuktning på en mjuk region (blå linje), vilket resulterar i en relativt "platt" force-förskjutning kurvan kontra en liten inbuktning och en "brant" force förskjutning kurvan för en styvare region ( röda linjen). För att få ren kraft kurvor efter varje indrag AFM spets måste dras tillbaka helt från provets yta och fri från kontakt innan nästa indraget. Denna kontakt fri form motsvarar den plana delen av kurvan i figur 3A, där spetsen översätter utan fribärande nedböjning. Figur 3B visar en typisk falsk kurva utan en platt region som uppstår när spetsen inte är helt tillbaka från provet yta (t.ex. mjuk prov enttaches till spets) gör det omöjligt att avgöra kontaktpunkt. Om spetsen är helt instängd i mjuka prov, kan kurvan se ut som visas i figur 3C, utan tydlig omläggning men litet brus.

Figur 4 visar skjuvmodulen uppgifter som hämtas från kraft-förskjutning kurvor visas rumsligt som stelhet kartor (elastographs), där färgskalor med skjuvstyrka. Elastographs visar slående skillnader i utbud och distribution av modul vävnad skjuvning i normala (Fig. 4A) och fibrotiska (Fig. 4B) lungparenkym och stora rumsliga variationer i skjuvmodulen, särskilt inom fibrotiska lungan provet.

Figur 2. (A) faskontrast mikroskop visar en AFM sond över en mus lungparenkym band. Skala Bar, 50 ìm. (B) immunfärgning av laminin i vanlig mus lungvävnad visar alveolära mikroarkitektur av normala lungparenkym. Vita rutan visar typiska 80-by-80μm område elasticitet kartläggning. Skala bar: 20 mikrometer. (C och D) immunfärgning av kollagen jag i saltlösning (C) och bleomycin (D) behandlas musen lungparenkym. Skala barer, 100 ìm.

Figur 3. (A) representant tolkningsbara kraft-förskjutning kurvor samlas in från koksaltlösning (blå) och bleomycin-behandlade (röd) mus lungparenkym, respektive. Svarta linjer är de bäst passar till följd av den sfäriska Hertz-modellen och är märkta med deras beräknade motsvarande Youngs böjmotståndet. (B, C) representant un-tolkningsbara force-förskjutning kurvor.

Figur 4. Representant elastographs in från koksaltlösning (A) och bleomycin-behandlade (B) mus lungparenkym. Färgen Staplarna anger skjuvmodulen i kilopascal. Axeletiketterna indikerar rumslig skala i mikrometer. Skala bar: 20 m

Discussion

Mekanisk karakterisering av lungvävnad med hjälp av AFM mikrointryckt erbjuder oöverträffad rumslig upplösning (bild 4), vilket ger ett unikt perspektiv på mikroskala variationer i vävnaden styvhet. Som ett exempel på dess användbarhet uppgav tidigare makronivå mätningar i normal och fibrotiska band lungvävnad en ungefärlig 2-3-faldig ökning av elastance med fibros ^11,12. Däremot avslöjar AFM mikrointryckt att vävnaden hårdnande är mycket lokal, med vissa regioner uppvisar upp till ~ 30-faldig ökning av skjuvmodulen över medianvärdet sågs hos normala lungvävnad ^10. Eftersom matrisen styvhet är nu känt att kritiskt påverka cellens funktion, dessa lokala mätningar ge ovärderlig parametrar för att öka biofidelity av cellkulturens studie av lungceller.

Flera praktiska frågor uppstår med hjälp av tunna remsor av lungvävnad. Ytorna av remsorna inte är helt slät, eftersom vävnaden profilen följer arkitekturen i den underliggande alveolerna. AFM-systemet justerar automatiskt spets position i Z-riktning under indrag när provet ytan höjd variation är mindre än 15-ìm att hjälpa till att övervinna denna utmaning. Mätningarna görs vid rumstemperatur, inte 37 ° C, så avvikelser i mekaniska egenskaperna orsakas av denna variation i temperaturen kan inte utvärderas, men de kan förväntas vara liten. Inverkan av den underliggande alveolära väggen arkitektur på observerade mekaniska egenskaper är svårt att avgöra med den nuvarande ljusmikroskop setup. Till exempel skulle det vara önskvärt att avgöra om alveolära väggar uppvisa anisotropi och olika mekaniska egenskaper när indragen i en riktning i linje med eller vinkelrätt mot plan vägg. Men den aktuella proverna är tjocka och bildsystem inte har 3D-funktioner, därför är det inte möjligt att avgöra den lokala alveolära väggen inriktning på varje kontaktpunkt. Slutligen är påverkan av cellulära beståndsdelar på uppmätta mekaniska egenskaper inte helt klarlagd. I de metoder som beskrivs här, finns inga ansträngningar för att specifikt ta bort cellulära beståndsdelar i vävnaden. Men, de celler som finns på ytan tillgänglig för indrag är förmodligen inte lönsamt med tanke på den tid som förflutit sedan vävnad skörd och nödvändigheten av att skära av vävnad för att få tillgång till alveolerna. Särskilda experiment för att ta bort celler, eller återbefolka matriser med livskraftiga celler och utvärdera den resulterande förändringar i vävnaden styvhet verkar befogad.

Eftersom färska ofixerade vävnad som krävs för dessa mätningar, bör den tid som förflutit från vävnad skörd till mätning minimeras och prover ska förvaras vid 4 ° C för att undvika ändringar i mekaniska egenskaper. Särskild uppmärksamhet bör ägnas när vävnad remsor överförs mellan behållare under tvättprogrammet eller färgning så att minimal distorsion eller skada uppstår. För AFM ansökan i flytande form, är ett viktigt steg för att skära i vävnaden så platt som möjligt och immobilisera provet på den stödjande täckglas. Om möjligt kan en automatisk sektionering maskin som en vibratome eller vävnad slicer användas för att skära skivor av mycket jämn tjocklek. Det är viktigt att fästa vävnad remsor omedelbart före AFM mätningar och minimera den tid som förflutit för AFM mätningar som provet kommer så småningom lossnar från täckglas. En användbar iakttagelse är att större band verkar fästa mer stabilt för att täcka glider och förblir på plats för längre löptider i PBS än mindre remsor.

AFM mikrointryckt kan karakterisera prover som spänner över ett brett spektrum från 100 Pa till 50 kPa (skjuvmodulen) när du använder en vanlig 0,06 N / m fribärande med en 5 ìm diameter sfärisk spets. Detta intervall kan utökas med hjälp av prober med olika fjäder konstanter, AFM sonder med sfäriska glas tips som sträcker sig från 0,6 till 12 mikrometer i diameter och våren konstanter som sträcker sig från 0,01 till 0,58 N / m finns kommersiellt tillgängliga (t.ex. Novascan) och vanliga ^3. Med en 5 ìm sfärisk spets, är den teoretiska kontaktytan mellan spetsen och vävnad ca 5-9 ìm ² för 400-700 nm indrag (Fig. 1A). Mindre eller större tips kan användas för att ge mindre eller större skala av rumsliga upplösning. Pyramidal tips har också använts i AFM mikrointryckt ^13-16, vilket ger mindre kontakt med områden och därmed öka rumsliga upplösningen i kartläggningen, även om uppgifterna montering är mer komplex för detta tips geometri.

Flera begränsningar med denna metod bör noteras. Lungan har traditionellt varit mekaniskt präglats icke-invasivt, till exempel med hjälp av tryck-volym analys ¹⁷ eller punch-indrag av hela lungorna ^19,20. Invasiva metoder såsom den som beskrivs här förändrar lungan arkitekturen i viktiga sätt genom förlusten av luft-vätske interface som normalt finns i luftfyllda lungor och förlusten av pre-stress som håller lungan delvis inflation på avslappning av andningsmuskulaturen. Dessa begränsningar är gemensamma för alla mätningar som gjorts i remsor lungvävnad ^18. Noterbart är dock medianen styvhet som mäts i parenkymet av normal lungvävnad (skjuvmodulen ~ 0.5kPa) inte skiljer sig väsentligt från beräkningar baserade på punch-indrag av intakta lungorna vid vila volymer ^19,20. Medan lungvävnad är känd för att uppvisa icke-linjära hårdare med ökande deformation, är det inte möjligt att testa på ett rigoröst sätt om denna fastighet kvarstår ner till mikro-skala med de metoder som används här. Hertz Modellen förutsätter homogenitet provet. Men de flesta biologiska material, inklusive lungparenkym, alltmer heterogena till minskande rumsliga skalor. Heterogenitet av provet kan resultera i artefakter som variant av Youngs modul beroende på indrag djup, dvs beroende på lagret eller komponent som är deformeras. Olikheter i XY-planet kan begränsas genom att noggrant välja lämplig sfärisk spets storlek beroende på mikrostruktur biomaterial som föreslagits av Dimitriadis EK et al. ⁸ Det är mycket svårare att förutsäga eller korrigera Hertz modell felet beror på materialet heterogenitet i z-riktningen. Azeloglu et al. föreslog nyligen en hybrid beräkningsmodell att karakterisera de elastiska egenskaperna hos heterogena substrat med diskret inbyggda inneslutningar ^21. Deras nya teknik ger en möjlighet att beräkna integrationen egenskaper hos heterogena material övervinna begränsningarna i Hertz'skt analys.

Hertz Modellen förutsätter också absolut elastiskt beteende, medan biologiska material normalt visa tidsberoende viskoelastiska beteenden. En fullständig viskoelastiska karakterisering av vävnad kan erhållas genom att variera indrag används hastigheter. Viktigt, visar tidigare makronivå mekanisk provning av normal och fibrotiska lungvävnad svaga frekvens beroende av mekaniska lungvävnad egenskaper, och bevarande av skillnaderna mellan normal och fibrotiska vävnaden mekaniska egenskaper i alla frekvenser testade ^11. Dessa fynd tyder starkt på att mätning av mekaniska egenskaper med en enda inbuktning hastighet med AFM fångar en viktig aspekt av den förändrade vävnaden mekaniska egenskaper som följer fibros.

Den Poissons tal på 0,4 för lungvävnad som används i detta arbete är från en makroskopisk mätning ^9. Tyvärr Poissons tal på mikro-skala och eventuella förändringar i sjukdomstillstånd är inte tillgängliga i litteraturen. Som alternativ till E, E / (1-υ ²⁾ eller (1-υ ²⁾ / πE (betecknas den elastiska konstanten k) ²² kan beräknas AFM mikrointryckt och rapporteras när Poissons tal är okänt. För de flesta biomaterial Poissons tal är i intervallet 0,4 till 0,5 på grund av deras höga vattenhalt. Inom intervallet 0,3-0,5 varierar faktorn 1 / (1-υ ²⁾ Endast 1,10 till 1,33, så att rimliga variationer i Poissons tal utövar endast måttliga effekter på de rapporterade modul. Ökningen skjuvmodulen att vi rapport för fibrotiska vävnaden jämfört med normal vävnad är flera gånger i storlek, vilket innebär att fel i samband med variationer i Poissons tal är små i förhållande till förändringar av mekaniska egenskaper observeras.

Själva algoritmen och kod som kan användas för analys av kraft-förskjutning uppgifter är föremål för den specifika applikationen skick och den efterföljande egenskaper olika populationer av kraft-förskjutning kurvor. Om mer sofistikerad analys är av intresse, kan man höra verk av Lin et al. ^23. Författarna sammanställt en rad samverkande strategier till en algoritm som övervinner många av de komplikationer som tidigare har hindrat ansträngningarna för att automatisera montering av Hertz modeller av indrag data.

Flera andra områden är tillgängliga för vidare utveckling och utnyttjande av denna metod. I de fall man är intresserad av att visualisera den alveolära väggar utan antikroppar märkning kan både elastin och kollagen visualiseras från deras autofluorescent signal i det gröna spektrumet. Å andra sidan kan bättre bildbehandling, antingen med tunnare vävnadssnitt, 3D avbildningstekniker, eller båda, öka förmågan att korrelera vävnad arkitektur med underliggande mekaniska egenskaper. Medan de nuvarande metoderna möjliggör färgning och visualisering av extracellulär matrix komponenter såsom kollagen och laminin, skulle ytterligare ansträngningar som syftar till färgning markörer cellytan för att identifiera specifika cellpopulationer och för att karakterisera den mekaniska mikromiljöer i närheten av sådana populationer. Alternatively kan vävnad tas ut från möss som uttrycker fluorescerande-märkta härstamning markörer eller cellen specifika proteiner att sträva efter samma mål. Slutligen, den metod som beskrivs här verkar väl lämpad att karakterisera andra anatomiska drag i lungan, till exempel fartyg som remodel vid hypertoni, och luftvägar vilket remodel vid astma. Utifrån sin nuvarande utveckling och potential för ytterligare förbättringar, verkar AFM mikrointryckt redo att ge värdefulla insikter i de förändringar i vävnaden styvhet som följer med sjukdomsprogression i lungan, och kommer utan tvekan att vara av värde i karakterisera rumsliga och tidsmässiga förändringar i styvhet en mängd andra mjuka vävnader.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM tip	Novascan Technologies, Inc.	PT.GS	5 micron Borosilicate bead, 0.06 N/m
Poly-L-Lysine coverslips	VWR international	354085	BD BioCoat 12 mm round No.1 glass
Agarose, Low Gelling Temperature	Sigma-Aldrich	A0701
Rabbit anti-Collagen I (Rb pAb) antibody	Abcam	ab34710-100
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit antibody	Invitrogen	A11010
Rabbit anti-Laminin	Sigma-Aldrich	L9393