Fluorescens Lifetime Imaging (FLIM) har vist sig som en vigtig teknik til billedet miljøet og samspillet mellem specifikke proteiner og farvestoffer i levende celler. FLIM af fluorescerende molekylære rotorer tillader kortlægning af viskositet i levende celler.
Diffusion er ofte en vigtig hastighedsbestemmende trin i kemiske reaktioner eller biologiske processer og spiller en rolle i en lang række intracellulære hændelser. Viskositet er en af de vigtigste parametre, der påvirker diffusion af molekyler og proteiner, og ændringer i viskositeten har været knyttet til sygdom og funktionsfejl på celleniveau. 1-3 Mens metoder til måling af bulk viskositeten er godt udviklet, billedbehandling mikroviskositet fortsat en udfordring . Viskositet kort over mikroskopiske objekter, såsom enkelte celler, har indtil for nylig været svært at opnå. Kortlægning viskositet fluorescensteknikker er fordelagtig, fordi der ligner andre optiske teknikker, er det minimalt invasive, ikke-destruktiv og kan anvendes til levende celler og væv.
Fluorescerende molekylære rotorer udviser fluorescens levetid og kvantumudbytter som en funktion af viskositeten af deres mikromiljø. 4,5 Intramolekylær vridning ellerrotation fører til ikke-bestrålende henfald fra exciterede tilstand tilbage til grundtilstanden. En tyktflydende miljø bremser denne rotation eller vridning, begrænse adgangen til denne ikke-radiative henfald vej. Dette fører til en stigning i fluorescens kvanteudbytte og fluorescenslevetid. Fluorescenslevetid Imaging (FLIM) af modificerede hydrofobe BODIPY farvestoffer, der virker som fluorescerende molekylære rotorer viser, at fluorescens levetid af disse prober er en funktion af mikroviskositet af deres miljø. 6-8 En logaritmisk plot af fluorescenslevetid versus opløsningsmidlet viskositet udbytter en lige linje, der adlyder Förster Hoffman ligningen. 9 Dette plot fungerer også som en kalibreringskurve til at konvertere fluorescenslevetiden til viskositet.
Efter inkubation af levende celler med ændrede BODIPY fluorescerende molekylær rotor er en punktformet farvestof fordeling observeres i fluorescens billeder. Viskositeten opnåede værdi i the puncta i levende celler er omkring 100 gange højere end af vand og cellulære cytoplasma. 6,7 tidsopløst fluorescensanisotropi målinger giver roterende korrelationstider i overensstemmelse med disse store mikroviskositet værdier. Kortlægning af fluorescenslevetid er uafhængig af fluorescensintensitet, og således tillader separation af proben koncentration og viskositet virkninger.
Sammenfattende har vi udviklet en praktisk og alsidig tilgang til at kortlægge mikroviskositet i celler baseret på FLIM af fluorescerende molekylære rotorer.
FLIM giver nogle vigtige fordele i forhold til intensiteten-baserede fluorescens billedbehandling. Det kan rapportere om fotofysiske begivenheder, der er vanskelige eller umulige at iagttage ved fluorescensintensitet billedbehandling, fordi det kan adskille dem fra fluorofor koncentration effekter. Dette er især nyttigt til at kortlægge intracellulær viskositet ved billeddannende fluorescerende molekylære rotorer. Fluorescens levetid kan let omdannes til en viskositet under anvendelse af en kalibreringskurve, som vist i fig. 3, uafhængig af koncentrationen af fluorescerende molekylære rotorer.
I FLIM kan der være artefakter, der kan komplicere fortolkningen af data. 10 Instrumental artefakter omfatter spredt lys, som vil vise sig som et højdepunkt på toppen af begyndelsen af fluorescens forfald og kan forveksles med en kort henfaldstid, eller en lille top efter IRF som kan forårsages af refleksioner inde i mikroskop. Disse spredte lys artefakter kan identificeres som sådanfordi de kan skelnes med spektral diskrimination – de er altid på samme bølgelængde som spændende lys. Huske på, at i luft, lys bevæger sig 30 cm i 1 nanosekund hjælper med at lokalisere oprindelsen af refleksioner.
Filter eller glas fluorescens kan også forårsage en artefakt, især ved lav prøve fluorescens, men dette kan let identificeres ved at tage en måling uden prøven: Hvis en henfald er opnået under disse omstændigheder er det på grund af instrumentet og har intet at gøre med prøven! På den anden side skal bemærkes at prøven autofluorescens også kan bidrage til en fluorescens henfald.
I tid-korreleret enkelt foton tælling (TCSPC), tid-til-amplitude konverter (TAC) ulineariteter kan forårsage dårlig anfald, men kan identificeres ved at blokere excitation og skinnende omgivende lys, fx fra det transmitterede lyskilden til prøven og måle timingen. En konstant baggrundsstøj børopnået i hver pixel i billedet. Regioner, hvor afvigelser fra en konstant baggrund forekomme, vil aldrig give en god pasform og bør undgås for måling, hvis de ikke kan elimineres ved at justere parametrene for TCSPC kortet.
En berygtede artefakt i TCSPC er foton luv-up, som er forårsaget af for stor en foton opdagelse. 11,12 Dette fører til kun det første foton er tidsindstillet bort alle efterfølgende fotoner fordi elektronikken er optaget timing og behandle den første foton. Stabelbare fører til en afkortning af fluorescens levetid, og den bedste måde at undgå dette på er at holde foton tællehastighed omkring 1% af laseren repetitionshastighed.
Outlook
Der er forskellige implementeringer af FLIM, og, afhængigt af programmet, som hver har sine fordele og ulemper. 13 Det ideelle fluorescensmikroskop ville erhverve hele multidimensionelle fluorescens emission kontur af intensitet, stilling, levetid, bølgelængde og polarisering i en enkelt måling, med en enkelt foton følsomhed, maksimal rumlig opløsning og minimum erhvervelse tid. Der er i øjeblikket ingen teknologi med denne unikke kombination af funktioner, og at bygge en fortsat en udfordring for instrumentering udviklere. Anvendelsen af nye fysiske teknikker til vigtige problemer i cellebiologi er ofte vejen til uventede opdagelser, og der er en lang vej at gå, før vi er tæt på at mætte de kapaciteter til fluorescensimagografi for cellebiologi. Faktisk, billedbehandling fluorescensparametre såsom levetid, frekvenser og polarisering, samt billeddannelse hurtigere i 3D på højere rumlig opløsning, er sikker på at afsløre nye aspekter i cellebiologi.
The authors have nothing to disclose.
MKK takker den britiske Engineering og fysikeres forskningsråd (EPSRC) Life Sciences interface program for en personlig Fellowship. Vi vil også gerne anerkende finansieringen af den britiske Bioteknologi og biologiske Sciences Research Council (BBSRC).
Sample with fluorescent molecular rotors
Hardware:
inverted Leica TCS SP2 confocal scanning microscope
Coherent Mira 900 Ti:Sapphire femtosecond laser with a Verdi V6 pump laser or Hamamatsu PLP-10 470 picosecond pulsed diode laser excitation sources
Becker & Hickl SPC 830 board in 3GHz, pentium IV, 1GB RAM computer with Windows XP
cooled Becker & Hickl PMC100-01 detector head based on Hamamatsu H5773P-01 photomultipliers, mounted on microscope’s X1 port, or hybrid detectors
DCC 100 detector control module
Software:
TRI-214 or SPCImage 2.8 by Becker & Hickl