Fluorescens Lifetime Imaging (FLIM) har dukket opp som en nøkkel teknikk til bilde miljøet og samspillet av spesifikke proteiner og fargestoffer i levende celler. FLIM av fluorescerende molekylære rotorer tillater kartlegging av viskositet i levende celler.
Diffusjon er ofte en viktig sats-bestemme trinn i kjemiske reaksjoner eller biologiske prosesser, og spiller en rolle i et bredt spekter av intracellulære hendelser. Viskositet er en av de viktigste parametrene som påvirker spredningen av molekyler og proteiner, og endringer i viskositet har vært knyttet til sykdom og funksjonssvikt på cellenivå. 1-3 Mens metoder for å måle bulk viskositet er godt utviklet, fortsatt bildebehandling microviscosity en utfordring . Viskositet kart av mikroskopiske objekter, for eksempel enkeltceller, har inntil nylig vært vanskelig å skaffe. Kartlegging viskositet med fluorescens teknikker er en fordel fordi, i likhet med andre optiske teknikker, er det minimalt invasiv, ikke-destruktiv og kan brukes på levende celler og vev.
Fluorescent molekylære rotorer viser fluorescens levetid og kvante avkastning som er en funksjon av viskositet mikromiljøet deres. 4,5 intramolekulære vridning ellerrotasjon fører til ikke-strålingen forfall fra opphisset tilstand tilbake til grunntilstanden. En tyktflytende miljø bremser dette rotasjon eller vridning, begrense tilgang til denne ikke-strålingen forfall veien. Dette fører til en økning i fluorescens kvanteutbytte og fluorescens levetid. Fluorescens Lifetime Imaging (FLIM) av modifiserte hydrofobe BODIPY fargestoffer som fungerer som fluorescerende molekylære rotorer viser at fluorescens levetid disse sonder er en funksjon av microviscosity av sine omgivelser. 6-8 En logaritmisk plott av fluorescens levetid versus løsningsmiddelet viskositet gir en rett linje som lystrer Förster Hoffman ligningen. 9 Denne tomten fungerer også som en kalibrering graf å konvertere fluorescens levetid til viskositet.
Etter inkubasjon av levende celler med modifisert BODIPY fluorescerende molekyl rotoren, er en punktformet fargestoff fordeling observert i fluorescens bildene. Viskositet Verdien innhentet i the puncta i levende celler er rundt 100 ganger høyere enn for vann og mobilnettet cytoplasma. 6,7 Tid-løst fluorescens anisotropi målinger gi rotasjons korrelasjon ganger i avtale med disse store microviscosity verdiene. Kartlegging av fluorescens levetid er uavhengig av fluorescens intensitet, og dermed tillater separasjon av sonden konsentrasjon og viskositet effekter.
I sammendraget har vi utviklet en praktisk og allsidig tilnærming til å kartlegge microviscosity i celler basert på FLIM av fluorescerende molekylære rotorer.
FLIM har noen viktige fordeler fremfor intensitet-baserte fluorescens bildebehandling. Det kan rapportere om photophysical hendelser som er vanskelig eller umulig å observere ved fluorescensintensiteten bildebehandling, fordi det kan skille dem fra fluoroforen konsentrasjon effekter. Dette er spesielt nyttig for å kartlegge intracellulær viskositet ved bildediagnostikk fluorescerende molekylære rotorer. Fluorescens levetid kan lett omgjøres til en viskositet ved hjelp av en kalibrering graf, som vist i fig. 3, uavhengig av konsentrasjonen av fluorescerende molekylære rotorer.
I FLIM det kan være gjenstander som kan komplisere tolking. 10 Instrumentelle artefakter inkluderer spredt lys som vil vise seg som en topp på toppen av begynnelsen av fluorescens forfall og kan forveksles med en kort forfall tid, eller en liten topp etter IRF som kan være forårsaket av refleksjoner inne i mikroskop. Disse spredte lyset gjenstander kan identifiseres som sådanfordi de kan skilles med spektral diskriminering – de er alltid på samme bølgelengde som den spennende lys. Huske at i luft, reiser lys 30 cm i 1 nanosekund bidrar til å finne opprinnelsen refleksjoner.
Filter eller glass fluorescens kan også føre til en gjenstand, særlig ved lav fluorescens, men dette kan lett identifiseres ved å ta en måling uten prøven: hvis et forfall oppnås under slike omstendigheter, er det grunn til instrumentet og har ingenting å gjøre med prøven! På den annen side, merk at prøven autofluorescens kan også bidra til en fluorescens forfall.
I time-korrelerte enkelt foton telling (TCSPC), tid-til-amplitude omformer (TAC) ikke-linearities kan føre til dårlige rier, men kan identifiseres ved å blokkere eksitasjon og skinnende lys fra omgivelsene, for eksempel fra den overførte lyskilden på prøven og måle timing. En konstant bakgrunn bør væreinnhentes i hvert piksel i bildet. Regioner hvor avvik fra en konstant bakgrunn oppstå, vil aldri gi en god passform og bør unngås for måling hvis de ikke kan elimineres ved å justere parametere for TCSPC kortet.
En beryktet gjenstand i TCSPC er foton hoper opp som er forårsaket av for høyt et foton oppklaringsprosenten. 11,12 Dette fører til bare den første fotonet blir tidsbestemt, ignorerer eventuelle senere fotoner fordi elektronikken er opptatt timing og behandle den første fotonet. Pile-up fører til en forkortelse av fluorescens levetid, og den beste måten å unngå dette på er å holde foton telle rate på rundt 1% av laser repetisjon rate.
Outlook
Det finnes ulike implementeringer av FLIM, og, avhengig av programmet, har hver sine fordeler og ulemper. 13. ideelle fluorescens mikroskop ville kjøpe hele flerdimensjonale fluorescens emission konturene av intensitet, stilling, levetid, bølgelengde og polarisering i en enkelt måling, med enkelt foton følsomhet, maksimal romlig oppløsning og minimum oppkjøp tid. Det er i dag ingen teknologi med denne unike kombinasjonen av funksjoner, og å bygge en fortsatt en utfordring for instrumentering utviklere. Anvendelsen av nye fysiske teknikker til viktige problemstillinger i cellebiologi er ofte veien til uventede funn, og det er en lang vei å gå før vi er nær å mette evnene av fluorescens bildebehandling for cellebiologi. Faktisk, bildebehandling fluorescens parametre som levetid, spektrum og polarisering, samt bildebehandling raskere i 3D ved høyere romlig oppløsning, er sikker på å avdekke nye sider i cellebiologi.
The authors have nothing to disclose.
MKK takker Storbritannias Engineering og naturvitenskap Research Council (EPSRC) Life Sciences Interface program for en personlig Fellowship. Vi ønsker også å erkjenne finansiering av Storbritannias Bioteknologi og Biological Sciences Research Council (BBSRC).
Sample with fluorescent molecular rotors
Hardware:
inverted Leica TCS SP2 confocal scanning microscope
Coherent Mira 900 Ti:Sapphire femtosecond laser with a Verdi V6 pump laser or Hamamatsu PLP-10 470 picosecond pulsed diode laser excitation sources
Becker & Hickl SPC 830 board in 3GHz, pentium IV, 1GB RAM computer with Windows XP
cooled Becker & Hickl PMC100-01 detector head based on Hamamatsu H5773P-01 photomultipliers, mounted on microscope’s X1 port, or hybrid detectors
DCC 100 detector control module
Software:
TRI-214 or SPCImage 2.8 by Becker & Hickl