Summary
Fluorescens Lifetime Imaging (FLIM) har vist sig som en vigtig teknik til billedet miljøet og samspillet mellem specifikke proteiner og farvestoffer i levende celler. FLIM af fluorescerende molekylære rotorer tillader kortlægning af viskositet i levende celler.
Abstract
Diffusion er ofte en vigtig hastighedsbestemmende trin i kemiske reaktioner eller biologiske processer og spiller en rolle i en lang række intracellulære hændelser. Viskositet er en af de vigtigste parametre, der påvirker diffusion af molekyler og proteiner, og ændringer i viskositeten har været knyttet til sygdom og funktionsfejl på celleniveau. 1-3 Mens metoder til måling af bulk viskositeten er godt udviklet, billedbehandling mikroviskositet fortsat en udfordring . Viskositet kort over mikroskopiske objekter, såsom enkelte celler, har indtil for nylig været svært at opnå. Kortlægning viskositet fluorescensteknikker er fordelagtig, fordi der ligner andre optiske teknikker, er det minimalt invasive, ikke-destruktiv og kan anvendes til levende celler og væv.
Fluorescerende molekylære rotorer udviser fluorescens levetid og kvantumudbytter som en funktion af viskositeten af deres mikromiljø. 4,5 Intramolekylær vridning ellerrotation fører til ikke-bestrålende henfald fra exciterede tilstand tilbage til grundtilstanden. En tyktflydende miljø bremser denne rotation eller vridning, begrænse adgangen til denne ikke-radiative henfald vej. Dette fører til en stigning i fluorescens kvanteudbytte og fluorescenslevetid. Fluorescenslevetid Imaging (FLIM) af modificerede hydrofobe BODIPY farvestoffer, der virker som fluorescerende molekylære rotorer viser, at fluorescens levetid af disse prober er en funktion af mikroviskositet af deres miljø. 6-8 En logaritmisk plot af fluorescenslevetid versus opløsningsmidlet viskositet udbytter en lige linje, der adlyder Förster Hoffman ligningen. 9 Dette plot fungerer også som en kalibreringskurve til at konvertere fluorescenslevetiden til viskositet.
Efter inkubation af levende celler med ændrede BODIPY fluorescerende molekylær rotor er en punktformet farvestof fordeling observeres i fluorescens billeder. Viskositeten opnåede værdi i the puncta i levende celler er omkring 100 gange højere end af vand og cellulære cytoplasma. 6,7 tidsopløst fluorescensanisotropi målinger giver roterende korrelationstider i overensstemmelse med disse store mikroviskositet værdier. Kortlægning af fluorescenslevetid er uafhængig af fluorescensintensitet, og således tillader separation af proben koncentration og viskositet virkninger.
Sammenfattende har vi udviklet en praktisk og alsidig tilgang til at kortlægge mikroviskositet i celler baseret på FLIM af fluorescerende molekylære rotorer.
Protocol
De protokoller til FLIM prøveforberedelse adskiller sig ikke fra dem, for konfokal eller bred-feltstyrke-baserede fluorescens mikroskopi. Den dataopsamling efterfølges af den primære opgave for dataanalyse, dvs udvinding af fluorescens levetid fra de rå data. Når disse er blevet indhentet, data fortolkning bidrager til at verificere eller forfalske hypoteser.
1. Farvning af celler med molekylære rotorer
- Fremstilling af en stamopløsning (10 ml) ved at opløse omtrent 1 mg / ml af farvestoffet i et passende opløsningsmiddel (f.eks methanol for BODIPY-C12) 6,7 under anvendelse af en nøjagtig balance og en pipette.
- Cellerne (model cancer cellelinie, HeLa i vores tilfælde), der skal farves dyrkes i en flerbrøndsplade med coverslide underside til mikroskopi, i en inkubator ved 37 ° C med en 5% CO2-atmosfære indtil ~ 80% konfluente .
- Tilsæt 10 til 20 ul af stamopløsning til de levende celler, der vokser i en multi-well plade (SmartSlide 50 mikro-inkubering system Wafergen) i 4 ml Opti-MEM medium (GIBCO) per brønd i en 6-brønds plade. Dette giver en mikro-molær farvestof koncentration i brønden.
- Returnere multi-brønds plade til en inkubator ved 37 ° C med en 5% CO2-atmosfære i 10-45 minutter til farvning.
- Fjerne flerbrøndsplade fra inkubatoren og vask cellerne 3-4 gange med 4 ml optisk klare celledyrkningsmedium (fx Opti-MEM) for at fjerne overskydende farve.
- Overføre flerbrøndsplade med mikroskopbordet og forbindelse til en temperaturregulator / 5% CO 2 gasindløb som krævet, som forberedelse til afbildning.
2. FLIM af fluorescerende molekylære rotorerne i celler
- Anbring prøven på mikroskopbordet og opnå en transmissions-og fluorescens billede til at identificere fluorescerende celler. Et skematisk diagram over den eksperimentelle opstilling er vist i fig. 1.Verify at fluorescens stammer fra de steder erfacted (f.eks cellemembranen cytoplasma). Opnåelse af en fluorescens-emissionsspektrum og verificere, at det er at farvestoffet forventede eller protein, i dette tilfælde spektrum af den molekylære rotoren. Som en negativ kontrol, billede ikke-farvede prøve, og verificere, at det ikke fluorescerer. Selvom dette trin ikke er afgørende specielt for FLIM, er det god praksis i almindelighed og ikke bidrage til at kontrollere, at prøven er, hvad du tror det er.
- Skift til FLIM tilstand - det er nemt opnå ved at flytte et spejl ud af fluorescenspåvisning strålegangen ("ekstern detektor" knappen på "strålegangen indstillingen" panel på Leica TCS SP2 erhvervelse kontrol software). En passende fluorescensemission til at blokere enhver exciterende lys i at nå detektoren skal være i fluorescenspåvisning BeamPath.
Figur 1. Eksperimentel arrangement for tid-domæne FLIM med aconfocal laser-scanning-mikroskop.
- Scanne prøven og kontrollere, om computeren styrer FLIM erhvervelse, at detektoren tællehastighed (sort søjle mærket CFD om erhvervelse styreprogrammel af Becker & Hickl SPC 830 board) ikke er mere end omkring 1% af den laser repetitionshastighed ( grønne bjælke mærket SYNC erhvervelse kontrol software). Hvis det er, at reducere laser excitation intensitet, fx ved at placere en neutral tæthed-filter i laserstrålevejen, for at undgå opsamling luv-up forvrængede fluorescens henfaldskurver.
- Anskaf en FLIM billede, typisk i 3-5 minutter, stopper scanning og gemme de rå data (en 3D-data "cube", der består af rumlige koordinater x og y, og tid).
- Åbn de rå data i fluorescensen forfald analyse software pakke, for eksempel TRI-2-14 eller kommerciel software, for at vise fluorescensintensitet billedet. Dette er simpelthen den integrerede fluorescens henfald, dvs arealet under fluorescens henfaldskurve for hverpixel.
- Vælg en typisk pixel ved at placere markøren på det, og inspicere fluorescens forfald i den pixel. Hvis den maksimale tælling er under 100, anvendes rumlig Binning af pixels. De tællinger af tilstødende pixler (f.eks 3x3 eller 5x5) tilsættes til den centrale pixel, således at en højere spidsværdi tælling opnås der. Dette giver en højere statistiske nøjagtighed til det næste trin. Alternativt kan målingen gentages i længere opsamlingstid (trin 5). For 30-50min, er en cirka 10 gange højere peak tæller (og i alt tæller) opnået, men det er alt for lang en overtagelse tid for de fleste biologiske prøver på grund af faren for at indføre artefakter på grund af prøven bevægelse, mikroskop Drift, fototoksicitet og fotoblegning.
- Vælge en global pixel tærskelværdi (over hvilken henfald i en pixel er monteret) og anvende en enkelt eksponentielt henfald egnet til billedet. Resultatet giver en fluorescens levetid for hver pixel over tærskelværdien, som derefter kodet ifarve. Hver pixel er farvet med resultatet af pasform og en FLIM kort opnås. Kontroller reducerede chi-kvadrerede værdier for forskellige pixels - omkring 1 (og op til 1,3) indikerer en god pasform. Undersøg de tilsvarende rester, der skal tilfældigt fordelt omkring nul.
- Fluorescenslevetiden histogram plots, hvor ofte bestemte fluorescens levetid opstå i forhold til fluorescenslevetiden selv. Justere farveområde, således at fluorescenslevetid fordeling passer ind i farveområde.
- Hvis en monoexponential egnet ikke giver en chi-kvadrerede værdi på omkring 1 (og op til 1,3), og der er en systematisk afvigelse af restprodukter fra nul, er en mere sofistikeret model påkrævet. For eksempel prøve monteres en dobbelt eksponentiel model til fluorescens henfalder, for at tage højde for to forskellige miljøer proben kan være i. passer også give de præ-eksponentielle faktorer eller amplituder, der giver en indikation af den relative mængde af farvestof i en miljøling eller den anden. Alternativt kan en strakt eksponentiel funktion være hensigtsmæssigt at tegne sig for en fordeling af fluorescens levetid.
- Resultaterne for de fluorescens levetid, præ-eksponentielle faktorer og levetid forholdet og for-eksponentielle faktor-forholdet for hver pixel kan derefter kodet i farve. Hver pixel er farvet i henhold til dens værdi, og kontrast på grund af fluorescens levetid, præ-eksponentielle faktorer og deres nøgletal er opnået. Igen kontrollere de reducerede chi-kvadrat-værdier (som også kan kodes i farve og vises som et billede) - omkring 1 (og op til 1,3) indikerer en god pasform. Efterse de rester, der skal tilfældigt fordelt omkring nul.
- Fluorescenslevetiden histogrammer bør ledsage alle billeder for nem visualisering af den gennemsnitlige fluorescenslevetiden værdier, og fluorescenslevetiden distribution.
3. Repræsentative resultater
Fluorescens henfald målt forDen fluorescerende molekylære rotoren at øge viskositeten i methanol / glycerol blandinger er vist i fig. 2. De fluorescens henfald er monoexponential og fluorescenslevetid varierer markant som en funktion af viskositeten. Det stiger fra omkring 300 ps i methanol (viskositet 0,6 cP) til 3,4 ns i 95% glycerol (viskositet 950 cP).
Figur 2. Fluorescensmålinger henfald profiler for BODIPY-C 12 i methanol / glycerol blandinger af varierende viskositet 6.
Den logaritmiske kalibreringskurve over fluorescenslevetid τ versus viskositet η for det fluorescerende molekylære rotoren er vist i fig. 3. Det er en lige linie, som krævet af Forster Hoffman ligning 9
hvor k 0 er radiative hastighedskonstant, og Z og X er konstanter, hvor 0 <x <1. At tage logaritmen på begge sider udbytter
hvor x er gradienten af den rette linie.
Figur 3. Et plot af logaritmen fluorescenslevetid mod log viskositet til BODIPY-C12 giver en lige linie i overensstemmelse med Forster-Hoffmann ligning. 6
Efter inkubation af levende celler med det fluorescerende molekylære rotoren en punktformet farvestof fordeling observeres i fluorescens billeder. Flim billeder af HeLa-celler inkuberet med en mesosubstitueret BODIPY farvestof er vist i fig. 4. Fluorescensmålingerne henfalder i hver pixel i billedet kan tilpasses hensigtsmæssigt at anvende en enkelt eksponentielle henfald model.
Figur 4 (a) Fluorescensintensitet og (b) Flim billeder af HeLa-celler farvet med BODIPY-C12. De lyse, punktformet regioner udviser en kortere levetid end andre regioner. Dette kortere liftime svarer til en lavere viskositet i puncta, sandsynligvis lipiddråber ifølge Forster-Hoffmann ligning.
Ved at plotte levetid ekstraheret fra hver pixel, opnår vi en fluorescenslevetid histogram af det samlede billede, som vist i fig. 5.
Figur 5. Histogrammer af fluorescens levetid fra Flim billeder af HeLa-celler farvet med mesosubstitueret BODIPY molekylære rotorer.
Discussion
FLIM giver nogle vigtige fordele i forhold til intensiteten-baserede fluorescens billedbehandling. Det kan rapportere om fotofysiske begivenheder, der er vanskelige eller umulige at iagttage ved fluorescensintensitet billedbehandling, fordi det kan adskille dem fra fluorofor koncentration effekter. Dette er især nyttigt til at kortlægge intracellulær viskositet ved billeddannende fluorescerende molekylære rotorer. Fluorescens levetid kan let omdannes til en viskositet under anvendelse af en kalibreringskurve, som vist i fig. 3, uafhængig af koncentrationen af fluorescerende molekylære rotorer.
I FLIM kan der være artefakter, der kan komplicere fortolkningen af data. 10 Instrumental artefakter omfatter spredt lys, som vil vise sig som et højdepunkt på toppen af begyndelsen af fluorescens forfald og kan forveksles med en kort henfaldstid, eller en lille top efter IRF som kan forårsages af refleksioner inde i mikroskop. Disse spredte lys artefakter kan identificeres som sådanfordi de kan skelnes med spektral diskrimination - de er altid på samme bølgelængde som spændende lys. Huske på, at i luft, lys bevæger sig 30 cm i 1 nanosekund hjælper med at lokalisere oprindelsen af refleksioner.
Filter eller glas fluorescens kan også forårsage en artefakt, især ved lav prøve fluorescens, men dette kan let identificeres ved at tage en måling uden prøven: Hvis en henfald er opnået under disse omstændigheder er det på grund af instrumentet og har intet at gøre med prøven! På den anden side skal bemærkes at prøven autofluorescens også kan bidrage til en fluorescens henfald.
I tid-korreleret enkelt foton tælling (TCSPC), tid-til-amplitude konverter (TAC) ulineariteter kan forårsage dårlig anfald, men kan identificeres ved at blokere excitation og skinnende omgivende lys, fx fra det transmitterede lyskilden til prøven og måle timingen. En konstant baggrundsstøj børopnået i hver pixel i billedet. Regioner, hvor afvigelser fra en konstant baggrund forekomme, vil aldrig give en god pasform og bør undgås for måling, hvis de ikke kan elimineres ved at justere parametrene for TCSPC kortet.
En berygtede artefakt i TCSPC er foton luv-up, som er forårsaget af for stor en foton opdagelse. 11,12 Dette fører til kun det første foton er tidsindstillet bort alle efterfølgende fotoner fordi elektronikken er optaget timing og behandle den første foton. Stabelbare fører til en afkortning af fluorescens levetid, og den bedste måde at undgå dette på er at holde foton tællehastighed omkring 1% af laseren repetitionshastighed.
Outlook
Der er forskellige implementeringer af FLIM, og, afhængigt af programmet, som hver har sine fordele og ulemper. 13 Det ideelle fluorescensmikroskop ville erhverve hele multidimensionelle fluorescens emission kontur af intensitet, stilling, levetid, bølgelængde og polarisering i en enkelt måling, med en enkelt foton følsomhed, maksimal rumlig opløsning og minimum erhvervelse tid. Der er i øjeblikket ingen teknologi med denne unikke kombination af funktioner, og at bygge en fortsat en udfordring for instrumentering udviklere. Anvendelsen af nye fysiske teknikker til vigtige problemer i cellebiologi er ofte vejen til uventede opdagelser, og der er en lang vej at gå, før vi er tæt på at mætte de kapaciteter til fluorescensimagografi for cellebiologi. Faktisk, billedbehandling fluorescensparametre såsom levetid, frekvenser og polarisering, samt billeddannelse hurtigere i 3D på højere rumlig opløsning, er sikker på at afsløre nye aspekter i cellebiologi.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
MKK takker den britiske Engineering og fysikeres forskningsråd (EPSRC) Life Sciences interface program for en personlig Fellowship. Vi vil også gerne anerkende finansieringen af den britiske Bioteknologi og biologiske Sciences Research Council (BBSRC).
Materials
Sample with fluorescent molecular rotors Hardware: inverted Leica TCS SP2 confocal scanning microscope Coherent Mira 900 Ti:Sapphire femtosecond laser with a Verdi V6 pump laser or Hamamatsu PLP-10 470 picosecond pulsed diode laser excitation sources Becker & Hickl SPC 830 board in 3GHz, pentium IV, 1GB RAM computer with Windows XP cooled Becker & Hickl PMC100-01 detector head based on Hamamatsu H5773P-01 photomultipliers, mounted on microscope’s X1 port, or hybrid detectors DCC 100 detector control module Software: TRI-214 or SPCImage 2.8 by Becker & Hickl |
References
- Luby-Phelps, K. Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: Volume, viscosity. diffusion, intracellular surface area. International Review of Cytology - a Survey of Cell Biology. , 192-1189 (2000).
- Stutts, M. J., Canessa, C. M., Olsen, J. C., Hamrick, M., Cohn, J. A., Rossier, B. C., Boucher, R. C. CFTR as a CAMP-dependent regulator of sodium channels. Science. 269, 847-850 (1995).
- Dondorp, A. M., Angus, B. J., Hardeman, M. R., Chotivanich, K. T., Silamut, K., Ruangveerayuth, R., Kager, P. A., White, N. J., Vreeken, J. Prognostic significance of reduced red blood cell deformability in severe falciparum malaria. Am. J. Trop. Med. Hyg. 57, 507-511 (1997).
- Haidekker, M. A., Nipper, M., Mustafic, A., Lichlyter, D., Dakanali, M., Theodorakis, E. A. Advanced Fluorescence Reporters in Chemistry and Biology I. Fundamentals and Molecular Design. Demchenko, A. P. 8, Springer. Berlin Heidelberg. 267-308 (2010).
- Haidekker, M. A., Theodorakis, E. A. Environment-sensitive behavior of fluorescent molecular rotors. J. Biol. Eng. 4, (2010).
- Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Levitt, J. A., Suhling, K. Molecular Rotor Measures Viscosity of Live Cells via Fluorescence Lifetime Imaging. Journal of the American Chemical Society. 130, 6672-6673 (2008).
- Levitt, J. A., Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Chung, P. H., Suhling, K., Phillips, D. Membrane-Bound Molecular Rotors Measure Viscosity in Live Cells via Fluorescence Lifetime Imaging. Journal of Physical Chemistry C. 113, 11634-11642 (2009).
- Hungerford, G., Allison, A., McLoskey, D., Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Suhling, K. Monitoring Sol-to-Gel Transitions via Fluorescence Lifetime Determination Using Viscosity Sensitive Fluorescent Probes. J. Phys. Chem. B. 113, 12067-12074 (2009).
- Förster, T., Hoffmann, G. Die Viskositätsabhängigkeit der Fluoreszenzquantenausbeuten einiger Farbstoffsysteme. Zeitschrift für Physikalische Chemie Neue Folge. 75, 63-76 (1971).
- vandeVen, M., Ameloot, M., Valeur, B., Boens, N. L. Pitfalls and Their Remedies in Time-Resolved Fluorescence Spectroscopy and Microscopy. J. Fluores. 15, 377-413 (2005).
- Becker, W. Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Techniques. , Springer. (2005).
- O'Connor, D. V., Phillips, D. Time-correlated single-photon counting. , Academic Press. New York. (1984).
- Suhling, K., French, P. M. W., Phillips, D. Time-resolved fluorescence microscopy. Photochem. Photobiol. Sci. 4, 13-22 (2005).
- Barber, P. R., Ameer-Beg, S. M., Gilbey, J., Carlin, L. M., Keppler, M. D., Ng, T. C., Vojnovic, B. Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis. Journal of the Royal Society - Interface. 6, S93-S105 (2009).
