Summary
Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) wurden als wesentliche Technik, um Bild die Umwelt und die Interaktion bestimmter Proteine und Farbstoffe, die in lebenden Zellen entstanden. FLIM fluoreszierender molekularer Rotoren ermöglicht die Zuordnung der Viskosität in lebenden Zellen.
Abstract
Diffusion ist oft ein wichtiger geschwindigkeitsbestimmende Schritt in chemischen Reaktionen oder biologische Prozesse und spielt eine Rolle in einer Vielzahl von intrazellulären Ereignissen. Die Viskosität ist einer der wichtigsten Parameter, die die Diffusion von Molekülen und Proteinen, und Änderungen in der Viskosität haben, um Krankheit und Störung wurde auf zellulärer Ebene verknüpft. 3.1 Während Methoden, um die Masse zu messen Viskosität gut entwickelt sind, bleibt eine Herausforderung Bildgebung Mikroviskosität . Viskosität Karten von mikroskopisch kleinen Objekten, wie einzelne Zellen, haben bis vor kurzem noch schwer zu bekommen. Mapping Viskosität mit Fluoreszenz-Verfahren ist vorteilhaft, da, ähnlich wie bei anderen optischen Techniken, es minimal-invasiven, nicht-destruktiv ist und kann an lebenden Zellen und Geweben angewandt werden.
Fluoreszierende molekularer Rotoren weisen Fluoreszenzlebensdauern und Quantenausbeuten, die eine Funktion der Viskosität ihrer Mikroumgebung sind. 4,5 Intramolekulare Verdrehen oderDrehung führt zu nicht-strahlenden Zerfall aus dem angeregten Zustand zurück in den Grundzustand. Ein viskoser Umwelt verlangsamt diese Rotation oder Verdrehung, die den Zugang zu dieser nicht-strahlenden Zerfall Weg. Dies führt zu einer Erhöhung der Fluoreszenz-Quantenausbeute und der Fluoreszenzlebensdauer. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) von modifizierten hydrophoben BODIPY Farbstoffe, die als fluoreszierende molekulare Rotoren wirken zeigen, dass die Fluoreszenz-Lebensdauer dieser Sonden eine Funktion der Mikroviskosität ihrer Umgebung ist. 8.6 eine logarithmische Darstellung der Fluoreszenz-Lebensdauer im Vergleich zu den Lösungsmittelviskosität Erträge eine gerade Linie, die die Förster Hoffman Gleichung gehorcht. 9 Dieses Grundstück dient auch als Eichkurve zur Fluoreszenz-Lebensdauer in Viskosität zu konvertieren.
Nach der Inkubation von lebenden Zellen mit dem modifizierten BODIPY fluoreszierende molekulare Rotor wird eine punktförmige Verteilung in den Farbstoff Fluoreszenz-Bildern beobachtet. Die Viskosität Wert in th erhaltene puncta in lebenden Zellen ist etwa 100 mal höher als die von Wasser und Zytoplasma. 6,7 Zeitaufgelöste Fluoreszenzanisotropiemessungen nachgeben Rotationskorrelationszeiten im Einvernehmen mit diesen großen Mikroviskosität Werte. Zuordnen der Fluoreszenz-Lebensdauer ist unabhängig von der Intensität der Fluoreszenz, und ermöglicht somit die Trennung der Sonde Konzentration und Viskosität Effekte.
Zusammenfassend haben wir eine praktische und vielseitige Herangehensweise an die Mikroviskosität in Zellen auf molekularer FLIM von fluoreszierenden Rotoren basierte Landkarten entwickelt.
Protocol
Die Protokolle für FLIM Probenvorbereitung sich nicht von denen für die konfokale oder Wide-Feldstärke-basierte Fluoreszenzmikroskopie unterscheiden. Die Datenerfassung wird durch die Hauptaufgabe der Datenanalyse folgte, also Extrahieren der Fluoreszenz-Lebensdauern aus den Rohdaten. Sobald diese gewonnen wurden, hilft die Interpretation der Daten zu verifizieren oder zu falsifizieren Hypothesen.
1. Anfärben der Zellen mit molekularer Rotoren
- Vorbereiten einer Stammlösung (10 ml) durch Auflösen von ungefähr 1 mg / ml des Farbstoffs in einem geeigneten Lösungsmittel (zB Methanol BODIPY-C 12) unter Verwendung eines 6,7 genaue Gleichgewicht und einer Pipette.
- Die Zellen (ein Modell-Zelllinie, HeLa in unserem Fall) zu färbenden auf in einer Multiwell-Platte mit einer Unterseite für die Mikroskopie coverslide geworden, in einem Inkubator bei 37 ° C mit einer 5% CO 2-Atmosphäre, bis ~ 80% konfluent .
- In 10 bis 20 ul der Stammlösung zu den lebenden Zellen wachsen in einer Multi-WELl Platte (SmartSlide 50 Mikro-Inkubation System, WaferGen) in 4 ml Opti-MEM-Medium (GIBCO) pro Well für eine 6-Well-Platte. Dies ergibt eine Mikro-molaren Farbstoffkonzentration in dem Bohrloch.
- Gibt die Multi-Well-Platte in einen Inkubator bei 37 ° C mit einer 5% CO 2-Atmosphäre für 10-45 Minuten für die Färbung.
- Entfernen Sie die Multiwell-Platte aus dem Inkubator und Waschen der Zellen 3-4 mal mit 4 ml optisch klaren Zellkulturmedium (zB Opti-MEM), um überschüssige Farbe zu entfernen.
- Übertragen der Multiwell-Platte auf dem Mikroskoptisch und eine Verbindung zu einem Temperaturregler / 5% CO 2 Gaseinlaß nach Bedarf, in Vorbereitung für die Bildgebung.
2. FLIM fluoreszierender molekularer Rotoren in Zellen
- Legen Sie die Probe auf dem Mikroskoptisch und erhalten eine Sende-und Fluoreszenz-Bild zu fluoreszierenden Zellen zu identifizieren. Ein schematisches Diagramm des experimentellen Aufbaus ist in gezeigt. 1.Verify, dass die Fluoreszenz geht von der Erfahrung StandortenCTED (zB Zellmembran, Zytoplasma). Erhalten ein Fluoreszenzemissionsspektrum und sicherzustellen, dass es, dass der Farbstoff oder Protein erwartet ist, in diesem Fall das Spektrum des molekularen Rotors. Als eine negative Kontrolle, Bild ein nicht-gefärbten Probe und sicherzustellen, dass es nicht fluoresziert. Dieser Schritt ist zwar nicht zwingend speziell für FLIM, ist es gute Praxis im Allgemeinen und nicht helfen zu überprüfen, ob die Probe ist, was Sie denken es ist.
- Wechseln Sie zu FLIM-Modus - dieser wird einfach durch Bewegen eines Spiegels aus dem Fluoreszenz-Detektion Strahlengang ("externe Detektor"-Taste auf "Beam Path Setting"-Panel auf dem Leica TCS SP2 Erwerb Steuer-Software) durchgeführt. Eine entsprechende Fluoreszenzemission Filter auf jedes anregende Licht den Detektor erreicht blockieren müssen in der Fluoreszenz-Detektion Strahlengang sein.
Abbildung 1. Experimentelle Anordnung zur Time-Domain-FLIM mit aconfocal Laser Scanning Mikroskop.
- Scannen Sie die Probe und prüfen, auf dem Computer die Steuerung der FLIM Erwerb, dass der Detektor Zählrate (schwarzer Balken gekennzeichnet CFD auf Erwerb Steuerungs-Software der Becker & Hickl SPC 830 board) nicht mehr als etwa 1% des Laser-Wiederholrate ist ( grünen Balken markiert SYNC Erwerb Steuer-Software). Wenn ja, reduzieren die Laseranregung Intensität, zB indem ein Graufilter im Laserstrahlengang, um zu vermeiden, Massenkarambolage verzerrten Fluoreszenzabklingkurven.
- Eignen Sie sich ein Bild FLIM, in der Regel für 3-5 min, Suche beenden und speichern Sie die Rohdaten (ein 3D-Daten "Würfel", bestehend aus räumlichen Koordinaten x und y, und Zeit).
- Öffnen Sie die Rohdaten in der Fluoreszenzabklingzeiten Analyse-Software-Paket, zum Beispiel Tri-2 14 oder kommerzielle Software, um die Intensität der Fluoreszenz Bild anzuzeigen. Das ist einfach das integrierte Fluoreszenzabklingzeiten, dh die Fläche unter dem Fluoreszenz-Abklingkurve, in jederPixel.
- Wählen Sie einen typischen Pixel indem Sie den Cursor darauf und überprüfen den Fluoreszenzabklingzeiten in diesem Pixel. Wenn der Peak-Zahl unter 100, verwenden räumliche Binning von Pixeln. Die Zählungen der benachbarten Pixel (zB 3x3 oder 5x5) in das zentrale Pixel addiert, so dass eine höhere Spitzenleistung Zählung erhalten wird. Dies bietet eine höhere statistische Genauigkeit für den nächsten Schritt. Alternativ könnte die Messung für eine längere Erfassungszeit (Schritt 5) wiederholt werden. Für 30-50min, wird ein etwa 10-fach höhere Peak count (und Gesamtaktivität) erhalten, aber das ist viel zu lange Zeit eine Anschaffung für die meisten biologischen Proben wegen der Gefahr der Einführung Artefakte durch Bewegung der Probe, Drift-Mikroskop, Phototoxizität und Ausbleichen.
- Wählen Sie einen globalen Pixel Schwellenwert (über dem der Zerfall in einem Bildpunkt vorhanden ist) und wenden Sie einen einzigen exponentiellen Abfall passen zu dem Bild. Das Ergebnis ergibt sich eine Fluoreszenzlebensdauer für jedes Pixel über dem Schwellenwert, der dann wiederum kodiertFarbe. Jedes Pixel wird mit dem Ergebnis der Anpassung gefärbt, und eine FLIM Karte erhalten wird. Überprüfen Sie die Chi-Quadrat-Werte für verschiedene Pixel - rund 1 (und bis zu 1,3) deutet auf eine gute Passform. Prüfen der entsprechenden Residuen, die zufällig um Null verteilt werden soll.
- Die Fluoreszenz-Lebensdauer-Histogramm, wie oft bestimmte Fluoreszenzlebensdauern gegenüber der Fluoreszenz-Lebensdauer selbst auftreten. Passen Sie den Farbbereich, so dass die Fluoreszenz-Lebensdauer-Verteilung in die Farbpalette passt.
- Wenn ein monoexponentielle Passform nicht nachgibt einen Chi-Quadrat-Wert von etwa 1 (und bis zu 1,3), und es gibt eine systematische Abweichung der Residuen von Null, wird ein komplexeres Modell erforderlich. Zum Beispiel versuchen Anbringen einer doppelt exponentiellen Modell auf die Fluorezenzzerfaelle zur Berücksichtigung für zwei verschiedene Umgebungen die Sonde auf sein kann Passung ergibt ebenfalls die präexponentiellen Faktoren oder Amplituden, die einen Hinweis auf die relative Menge des Farbstoffes in einem Umweltment oder das andere. Alternativ kann eine gestreckte Exponentialfunktion angebracht, eine Verteilung der Fluoreszenz-Lebensdauern ausmachen.
- Die Ergebnisse für die Fluoreszenz-Lebensdauer, präexponentiellen Faktoren, und die Lebensdauer-Verhältnis und dem präexponentiellen Faktor Verhältnis für jedes Pixel können dann farbig kodiert werden. Jedes Pixel ist farbig nach seinen Wert, und der Kontrast durch Fluoreszenz-Lebensdauern, präexponentiellen Faktoren und deren Verhältnisse erreicht wird. Wieder finden Sie die Chi-Quadrat-Werte (die auch in Farbe kodiert werden und angezeigt als Bild) - rund 1 (und bis zu 1,3) deutet auf eine gute Passform. Untersuchen Sie die Residuen, die zufällig um Null verteilt werden sollten.
- Fluoreszenz-Lebensdauer-Histogramme sollten alle Bilder zur einfachen Visualisierung von mittleren Fluoreszenzlebensdauer Werte, und die Fluoreszenz-Lebensdauer-Verteilung begleiten.
3. Repräsentative Ergebnisse
Fluorezenzzerfaelle für gemessendas fluoreszierende molekulare Rotor bei steigender Viskosität in Methanol / Glycerin-Mischungen sind in Abb. 2. Die Fluoreszenz-Zerfälle sind monoexponentielle, und die Fluoreszenz-Lebensdauer variiert stark in Abhängigkeit von der Viskosität. Sie steigt von rund 300 PS in Methanol (Viskosität 0,6 cP) bis 3,4 ns in 95% Glyzerin (Viskosität 950 cP).
Abbildung 2. Fluoreszenz-Abklingverhalten für BODIPY-C 12 in Methanol / Glycerin mit unterschiedlicher Viskosität. 6
Die logarithmische Eichkurve Fluoreszenzlebensdauer τ gegen die Viskosität η für die fluoreszierende molekulare Rotor ist in Abb. 3. Es ist eine gerade Linie durch den Förster Hoffman Gleichung 9 gefordert
wobei k 0 ist die radiative Geschwindigkeitskonstante, und z und x Konstanten sind, und mit 0 <x <1 ist. Logarithmieren auf beiden Seiten ergibt
wobei x die Steigung der geraden Linie.
Abbildung 3. Eine Auftragung von log Fluoreszenz-Lebensdauer vs log Viskosität für BODIPY-C 12 ergibt sich eine gerade Linie in Übereinstimmung mit dem Förster-Hoffmann-Gleichung. 6
Nach der Inkubation von lebenden Zellen mit dem fluoreszierenden molekularen Rotor eine punktförmige Verteilung Farbstoff wird in den Fluoreszenz-Bildern beobachtet. FLIM Bilder von HeLa-Zellen mit einem meso-substituierten BODIPY Farbstoff inkubiert sind in Abb. 4. Die Fluoreszenz-Zerfälle in jedem Pixel des Bildes adäquat ausgestattet werden mit einer einzigen exponentiellen Modell.
4. (A) Fluoreszenzintensität und (b) FLIM Bilder von HeLa-Zellen mit BODIPY-C 12-gefärbt. Die hellen, punktförmigen Regionen weisen eine kürzere Lebensdauer als andere Regionen. Diese kürzere liftime entspricht einer niedrigeren Viskosität im Puncta, wahrscheinlich Fetttröpfchen, gemäß der Förster-Hoffmann Gleichung.
Durch Auftragen der Lebensdauern von jedem Pixel extrahiert, erhalten wir eine Fluoreszenz-Lebensdauer-Histogramm des gesamten Bildes, wie in Abb. 5.
Abbildung 5. Histogramme der Fluoreszenz-Lebensdauern von FLIM Bilder von HeLa-Zellen mit meso-substituierten BODIPY molekularer Rotoren gefärbt.
Discussion
FLIM bietet einige entscheidende Vorteile gegenüber Intensität-basierte Fluoreszenz-Imaging. Es kann auf photophysikalische Ereignisse, die schwierig oder unmöglich zu Fluoreszenzintensität Bildgebung beobachten sind zu berichten, da es sie von Fluorophorkonzentration Effekte zu trennen kann. Dies ist besonders nützlich für die Zuordnung intrazellulären Viskosität durch Abbilden fluoreszierenden molekularen Rotoren. Die Fluoreszenz-Lebensdauer kann leicht zu einer Viskosität unter Verwendung einer Eichkurve umgewandelt werden, wie in gezeigt. 3, unabhängig von der Konzentration der fluoreszierenden molekularen Rotoren.
In FLIM kann es zu Artefakten, die die Interpretation der Daten erschweren kann. Instrumental 10 Ausstellungsstücken zählen Streulicht, die Show wird als Peak auf der Oberseite des Anfang des Fluoreszenzabklingzeiten und kann mit einer kurzen Abklingzeit verwechselt werden, oder eine kleine Spitze, nachdem der IRF welche sich durch Reflexionen im Innern des Mikroskops verursacht werden. Diese Streulicht Artefakte können als solche identifiziert werdenweil sie mit spektralen Diskriminierung unterschieden werden können - sie sind immer auf der gleichen Wellenlänge wie das anregende Licht. Daran erinnernd, dass in Luft, Licht 30 cm bewegt sich in 1 Nanosekunde hilft, den Ursprung von Reflexionen zu lokalisieren.
Filter-oder Glas-Fluoreszenz könnten auch dazu führen, ein Artefakt, insbesondere bei niedrigen Probenfluoreszenz, aber dies kann leicht durch eine Messung ohne Probe identifiziert werden: wenn ein Zerfall unter diesen Umständen gewonnen wird, ist es aufgrund des Instruments und hat nichts zu tun mit der Probe! Auf der anderen Seite, dass Probe Autofluoreszenz kann auch mit einem Fluoreszenzabklingzeit wirken.
In zeitkorrelierten Einzelphotonenzählung (TCSPC), Time-to-Amplituden-Wandler (TAC) Nichtlinearitäten können zu einer schlechten passt, kann aber durch die Blockierung der Anregung und glänzenden Umgebungslicht, zB aus dem übertragenen Lichtquelle auf die Probe identifiziert werden und Messen der Timing. Eine konstante Hintergrund sollteerhalten in jedem Pixel des Bildes. Regionen, in denen Abweichungen von einer konstanten Hintergrund ablaufen, wird niemals zu ergeben eine gute Passform und sollte für die Messung vermieden werden, wenn sie nicht durch Einstellen der Parameter für die TCSPC Karte eliminiert werden.
Ein berühmt-berüchtigten Artefakt in TCSPC Photon ist Pile-Up, das durch zu hohe Erkennungsrate eines Photons verursacht. 11,12 Dies führt zu einer nur des ersten Photons wird zeitlich und ignoriert alle nachfolgenden Photonen, weil die Elektronik beschäftigt sind Timing und der Verarbeitung des ersten Photons. Pile-up führt zu einer Verkürzung der Fluoreszenz-Lebensdauer, und der beste Weg, um dies zu vermeiden ist es, die Photonen-Zählrate bei rund 1% des Laser-Repetitionsrate zu halten.
Ausblick
Es gibt verschiedene Implementierungen von FLIM und, je nach Anwendung, jeder hat seine Vorteile und Nachteile. 13 Die ideale Fluoreszenzmikroskop erwerben würde die gesamte multidimensionale Fluoreszenz emission Kontur der Intensität, Position, Lebensdauer, Wellenlänge und Polarisation in einer einzigen Messung, mit Single-Photon-Empfindlichkeit, räumliche Auflösung maximale und minimale Messzeit. Es gibt gegenwärtig keine Technologie, mit dieser einzigartigen Kombination von Merkmalen, einen zu bauen und bleibt eine Herausforderung für die Messtechnik-Entwickler. Die Anwendung des neuen physikalischen Techniken, um wichtige Probleme in der Zellbiologie ist oft der Weg zu unerwarteten Entdeckungen, und es gibt einen langen Weg vor uns, bevor wir nah an sättigenden die Fähigkeiten von Fluoreszenz-Imaging für Zellbiologie sind. In der Tat sind Abbildung von Fluoreszenz-Parameter wie Lebensdauer, Spektrum und Polarisation, sowie bildgebende schneller in 3D bei hoher räumlicher Auflösung, bestimmte neue Aspekte in der Zellbiologie zu offenbaren.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
MKK dankt dem britischen Engineering and Physical Science Research Council (EPSRC) Life Sciences Interface-Programm für eine persönliche Gemeinschaft. Wir möchten auch die Finanzierung von der britischen Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) anerkennen.
Materials
Sample with fluorescent molecular rotors Hardware: inverted Leica TCS SP2 confocal scanning microscope Coherent Mira 900 Ti:Sapphire femtosecond laser with a Verdi V6 pump laser or Hamamatsu PLP-10 470 picosecond pulsed diode laser excitation sources Becker & Hickl SPC 830 board in 3GHz, pentium IV, 1GB RAM computer with Windows XP cooled Becker & Hickl PMC100-01 detector head based on Hamamatsu H5773P-01 photomultipliers, mounted on microscope’s X1 port, or hybrid detectors DCC 100 detector control module Software: TRI-214 or SPCImage 2.8 by Becker & Hickl |
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