जीवित कोशिकाओं में आणविक रोटार के प्रतिदीप्ति आजीवन इमेजिंग
Summary
प्रतिदीप्ति आजीवन इमेजिंग (flim) एक प्रमुख पर्यावरण और छवि विशिष्ट प्रोटीन और जीवित कोशिकाओं में रंगों की बातचीत करने के लिए तकनीक के रूप में उभरा है. फ्लोरोसेंट आणविक रोटार के flim जीवित कोशिकाओं में चिपचिपापन की मैपिंग की अनुमति देता है.
Abstract
Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular events. Viscosity is one of the key parameters affecting the diffusion of molecules and proteins, and changes in viscosity have been linked to disease and malfunction at the cellular level.1-3 While methods to measure the bulk viscosity are well developed, imaging microviscosity remains a challenge. Viscosity maps of microscopic objects, such as single cells, have until recently been hard to obtain. Mapping viscosity with fluorescence techniques is advantageous because, similar to other optical techniques, it is minimally invasive, non-destructive and can be applied to living cells and tissues.
Fluorescent molecular rotors exhibit fluorescence lifetimes and quantum yields which are a function of the viscosity of their microenvironment.4,5 Intramolecular twisting or rotation leads to non-radiative decay from the excited state back to the ground state. A viscous environment slows this rotation or twisting, restricting access to this non-radiative decay pathway. This leads to an increase in the fluorescence quantum yield and the fluorescence lifetime. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of modified hydrophobic BODIPY dyes that act as fluorescent molecular rotors show that the fluorescence lifetime of these probes is a function of the microviscosity of their environment.6-8 A logarithmic plot of the fluorescence lifetime versus the solvent viscosity yields a straight line that obeys the Förster Hoffman equation.9 This plot also serves as a calibration graph to convert fluorescence lifetime into viscosity.
Following incubation of living cells with the modified BODIPY fluorescent molecular rotor, a punctate dye distribution is observed in the fluorescence images. The viscosity value obtained in the puncta in live cells is around 100 times higher than that of water and of cellular cytoplasm.6,7 Time-resolved fluorescence anisotropy measurements yield rotational correlation times in agreement with these large microviscosity values. Mapping the fluorescence lifetime is independent of the fluorescence intensity, and thus allows the separation of probe concentration and viscosity effects.
In summary, we have developed a practical and versatile approach to map the microviscosity in cells based on FLIM of fluorescent molecular rotors.
Protocol
Discussion
Flim तीव्रता आधारित प्रतिदीप्ति इमेजिंग पर कुछ महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है. यह photophysical घटनाओं है कि मुश्किल या असंभव प्रतिदीप्ति तीव्रता इमेजिंग के द्वारा निरीक्षण कर रहे हैं पर रिपोर्ट है, क्योंकि यह उन्हें fluorophore एकाग्रता प्रभाव से अलग नहीं कर सकता कर सकते हैं. यह इमेजिंग फ्लोरोसेंट आणविक रोटार द्वारा intracellular चिपचिपापन मानचित्रण के लिए विशेष रूप से उपयोगी है. प्रतिदीप्ति जीवनकाल चिपचिपाहट का उपयोग कर एक अंशांकन ग्राफ में आसानी से परिवर्तित किया जा सकता है, के रूप में चित्र में दिखाया. 3, फ्लोरोसेंट आणविक रोटार की एकाग्रता के स्वतंत्र है.
Flim में कलाकृतियों कि डेटा व्याख्या जटिल हो सकता है 10 वी कलाकृतियों. बिखरे हुए प्रकाश प्रतिदीप्ति क्षय की शुरुआत के शीर्ष पर एक चोटी के रूप में दिखाने के लिए और एक कम क्षय समय के साथ भ्रमित किया जा सकता है, या के बाद एक छोटी सी चोटी शामिल IRF जो माइक्रोस्कोप के अंदर प्रतिबिंब के कारण हो सकता है. ये बिखरे हुए प्रकाश कलाकृतियों इस तरह के रूप में पहचाना जा सकता हैक्योंकि वे वर्णक्रमीय भेदभाव के साथ प्रतिष्ठित किया जा सकता है – वे रोमांचक प्रकाश के रूप में एक ही तरंग दैर्ध्य में हमेशा से रहे हैं. याद है कि हवा में प्रकाश 1 nanosecond में 30 सेमी की यात्रा करने के लिए प्रतिबिंब का मूल पहचानने में मदद करता है.
फ़िल्टर या गिलास प्रतिदीप्ति भी एक artifact का कारण बन सकता है, कम नमूना प्रतिदीप्ति पर विशेष रूप से, लेकिन इस नमूना बिना माप लेने के द्वारा आसानी से पहचाना जा सकता है: अगर एक क्षय इन परिस्थितियों में प्राप्त की है, यह साधन के कारण है और कुछ नहीं करना है नमूने के साथ! दूसरी ओर, ध्यान दें कि नमूना autofluorescence भी एक प्रतिदीप्ति क्षय के लिए योगदान कर सकते हैं.
(TCSPC) के समय सहसंबद्ध एकल फोटॉन गिनती, समय से आयाम कनवर्टर (टीएसी) गैर linearities गरीब फिट बैठता हो, लेकिन हो सकता है उत्तेजना अवरुद्ध और नमूना पर परिवेश, पारेषित प्रकाश स्रोत से प्रकाश जैसे चमक द्वारा पहचाना जा सकता है और समय को मापने. निरंतर पृष्ठभूमि होना चाहिएछवि के प्रत्येक पिक्सेल में प्राप्त है. क्षेत्र जहां एक निरंतर पृष्ठभूमि से विचलन होते हैं, एक अच्छा फिट नहीं उपज और माप के लिए बचा जाना चाहिए अगर वे TCSPC कार्ड के लिए मापदंडों का समायोजन द्वारा समाप्त नहीं किया जा सकता है.
एक TCSPC में कुख्यात विरूपण साक्ष्य फोटॉन ढेर के ऊपर है जो बहुत अधिक एक फोटान का पता लगाने की दर के कारण होता है 11,12 यह केवल पहली फोटॉन समय पर जा रहा होता है, बाद में किसी भी फोटॉनों की अनदेखी क्योंकि इलेक्ट्रॉनिक्स व्यस्त समय कर रहे हैं और पहली फोटॉन प्रसंस्करण के. प्रतिदीप्ति जीवन भर का एक छोटा है, और इस से बचने का सबसे अच्छा तरीका करने के लिए ढेर के ऊपर होता है लेजर पुनरावृत्ति दर का लगभग 1% पर फोटोन गिनती दर बनाए रखना है.
दृष्टिकोण
Flim के विभिन्न implementations कर रहे हैं, और आवेदन के आधार पर, प्रत्येक के अपने फायदे और कमियां है 13 आदर्श प्रतिदीप्ति खुर्दबीन प्राप्त होगा. पूरे बहुआयामी प्रतिदीप्ति घावतीव्रता, स्थिति, जीवन भर, तरंगदैर्ध्य और एक ही माप में ध्रुवीकरण एक फोटान संवेदनशीलता, अधिकतम स्थानिक संकल्प और न्यूनतम अधिग्रहण के समय के साथ, n समोच्च. वर्तमान सुविधाओं के इस अद्वितीय संयोजन के साथ कोई तकनीक है, और एक का निर्माण उपकरण के डेवलपर्स के लिए एक चुनौती बनी हुई है. नई भौतिक तकनीक की कोशिका जीव विज्ञान में महत्वपूर्ण समस्याओं के लिए आवेदन अक्सर अप्रत्याशित खोजों के लिए पथ है, और वहाँ के लिए एक लंबा रास्ता जाने से पहले हम कोशिका जीव विज्ञान के लिए प्रतिदीप्ति इमेजिंग की क्षमताओं saturating के करीब हैं. दरअसल, जीवनकाल, स्पेक्ट्रम और ध्रुवीकरण, साथ ही उच्च स्थानिक संकल्प पर 3 डी में और अधिक तेजी से इमेजिंग जैसे इमेजिंग प्रतिदीप्ति पैरामीटर, कोशिका जीव विज्ञान में नए पहलुओं को उजागर करने के लिए कुछ कर रहे हैं.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MKK ब्रिटेन की इंजीनियरिंग और शारीरिक विज्ञान अनुसंधान परिषद (EPSRC) जीवन विज्ञान एक निजी फैलोशिप के लिए इंटरफ़ेस कार्यक्रम धन्यवाद. हम भी ब्रिटेन के जैव प्रौद्योगिकी और जैव विज्ञान अनुसंधान परिषद (बीबीएसआरसी) से धन स्वीकार करना होगा.
Materials
Sample with fluorescent molecular rotors
Hardware:
inverted Leica TCS SP2 confocal scanning microscope
Coherent Mira 900 Ti:Sapphire femtosecond laser with a Verdi V6 pump laser or Hamamatsu PLP-10 470 picosecond pulsed diode laser excitation sources
Becker & Hickl SPC 830 board in 3GHz, pentium IV, 1GB RAM computer with Windows XP
cooled Becker & Hickl PMC100-01 detector head based on Hamamatsu H5773P-01 photomultipliers, mounted on microscope’s X1 port, or hybrid detectors
DCC 100 detector control module
Software:
TRI-214 or SPCImage 2.8 by Becker & Hickl
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