Summary
蛍光寿命イメージング（FLIM）はイメージに重要な手法として、生きた細胞内の特定のタンパク質と色素の環境との相互作用を浮上している。蛍光分子ローターのFLIMは、生体細胞内の粘度のマッピングを可能にします。
Abstract
拡散は、多くの場合、化学反応または生物学的プロセスにおいて重要な律速段階である細胞内のイベントの広い範囲で役割を果たしています。粘度は、分子やタンパク質の拡散に影響を与える重要なパラメータの一つであり、粘度の変化が細胞レベルで病気や機能不全にリンクされている1-3バルク粘度を測定する方法がよく発達している間に、イメージング微小粘度が課題である。最近取得しにくかったまでは、単一細胞のような微細な物体の粘度マップは、持っています。他の光学技術と同様に、それが非破壊、低侵襲であり、生きた細胞や組織に適用することができます、ので、蛍光技術を使用して、マッピングの粘度が有利である。
蛍光分子ローターは蛍光寿命とその微小環境の粘度の関数である量子収率を示す。4,5分子内ねじれまたは回転は励起状態のバックから基底状態への非放射性崩壊につながります。粘性のある環境では、この非放射減衰経路へのアクセスを制限し、この回転やねじれが遅くなります。これは、蛍光量子収率と蛍光寿命の増加につながる。蛍光分子ローターがこれらのプローブの蛍光寿命は、その環境の微小粘度の関数であることを示すように行動する変更された疎水性のBODIPY色素の蛍光寿命イメージング（FLIM）6-8溶媒粘度の収量に対する蛍光寿命の対数プロットフェルスターホフマン式に従う直線。9このプロットは、また粘度に蛍光寿命を変換するための検量線として機能します。
変更されたBODIPY蛍光分子ロータと生きている細胞のインキュベーションに続いて、点状の色素分布を蛍光画像で観察される。目で得られた粘度値生細胞の電子涙点は、水および細胞質のそれより約100倍である。6,7時間分解蛍光異方性の測定は、これらの大きな微小粘度の値と一致した回転相関時間を得ることができます。蛍光寿命をマッピングすると蛍光強度とは独立であり、従って、プローブ濃度と粘度の影響を分離することができます。
要約では、蛍光分子ローターのFLIMに基づいて、細胞内の微小粘度をマッピングするための実用的かつ多彩なアプローチを開発しました。
Protocol
FLIMのサンプル調製のためのプロトコルは、共焦点またはワイドフィールド強度ベースの蛍光顕微鏡とは異なりません。データ収集は、すなわち生データから蛍光寿命を抽出し、データ解析の主なタスクは続いています。一度これらが得られた、データの解釈は仮説を検証したり改ざんするのに役立ちます。
1。分子ローター染色細胞
- 正確なバランスとピペットを用いて6,7の適切な溶媒（BODIPY-C 12例えばメタノール）中の染料の約1 mg / mlを溶解させたストック溶液（10 ml）を準備します。
- 染色された細胞は、（我々の場合のモデル癌細胞株、HeLa細胞）〜80％コンフルエントになるまで、5％CO 2雰囲気下で37℃インキュベーターでは、顕微鏡用coverslide下面にマルチウェルプレートに上に栽培されています。
- 10を追加 - マルチWELで成長し、生きた細胞にストック溶液20μlを6ウェルプレートのウェルあたりのOpti-MEM培地（GIBCO）を4 mlのLプレート（50 SmartSlideマイクロインキュベーションシステムWafergen）。これはよくマイクロモルの色素濃度が得られます。
- 染色のための10から45分間、5％CO 2雰囲気下で37℃インキュベーターにマルチウェルプレートを返します。
- インキュベーターからマルチウェルプレートを取り外し、過剰な色素を除去するために4ミリリットル光学的に透明な細胞培養培地（例えばのOpti-MEM）で細胞を3〜4回洗浄する。
- 顕微鏡のステージにマルチウェルプレートを転送し、必要に応じて画像の準備のために、温度コントローラ/ 5％CO 2ガス入口に接続します。
2。細胞内の蛍光分子ローターのFLIM
- 顕微鏡ステージ上にサンプルを配置し、伝送および蛍光細胞を識別するための蛍光画像を取得します。実験のセットアップの模式図を図に示されています。 1.Verifyその場所EXPEから蛍光が放出さCTED（例えば、細胞膜、細胞質）。蛍光発光スペクトルを取得し、それがこのケースでは、染料やタンパク質の期待している分子ローターのスペクトルであることを確認します。陰性対照として、画像の非染色したサンプルを、それが蛍光を発するないことを確認してください。このステップはFLIMのために特別に必須ではありませんが、それは一般的に良い習慣であり、サンプルでは、それは考えるものであることを確認するのに役立ちます。
- FLIMモードに切り替え - これは容易に蛍光検出光路（ライカTCS SP2取得制御ソフトウェアの "ビーム·パスの設定"パネルの "外部検波器"ボタン）のミラーを移動することによって達成されます。検出器に到達するから励起光を遮断するための適切な蛍光発光フィルタは、蛍光検出beampathでなければなりません。
図1 ACアダプタを使ってタイム·ドメインFLIMのための実験装置onfocalレーザー走査顕微鏡。
- サンプルをスキャンし、検出器の計数率（ベッカー＆Hickl SPC 830ボードの取得制御ソフトウェアにCFDというラベルの付いた黒いバー）はこれ以上のレーザ繰り返し周波数の約1％（以上ではないこと、FLIMの取得を制御するコンピュータ上で、チェックSYNC取得制御ソフトウェアラベル緑のバー）。されている場合は、パイルアップ歪ん蛍光減衰曲線を収集を避けるために、レーザービームのパスに中立的な密度フィルタを置くことによって、例えば、レーザー励起強度を、減らすことができます。
- 通常3〜5分間、FLIMのイメージを取得し、スキャンを停止し、生データ（3次元データ空間座標xとyから成る "キューブ"、時間）を保存します。
- 蛍光強度イメージを表示するには、例のTRI-2 14または商用ソフトウェアでは、蛍光減衰解析ソフトウェア·パッケージ内の生データを開きます。これは単純に統合された蛍光減衰であり、それぞれには、蛍光減衰曲線下の面積、すなわちピクセル。
- それの上にカーソルを置くことによって、典型的なピクセルを選択し、そのピクセルの蛍光減衰を調べてください。ピークカウントが100未満の場合、画素の空間ビニングを使用しています。隣接する画素（例えば、3x3または5x5の）のカウントが高いピークカウントがが得られるように、中央のピクセルに追加されます。これは、次のステップのために高い統計精度を提供します。また、測定は長い捕捉時間（ステップ5）のために繰り返される可能性があります。 30 50分のために、約10倍のピーク数（および合計数）が得られますが、これはためサンプルの動きに起因するアーチファクトを導入する危険性をはるかに多くの生物学的サンプルの収集時間が長すぎる、顕微鏡ドリフトされ、光毒性と退色。
- グローバルピクセルのしきい値を（ピクセルで減衰が装着されている上記）を選択し、画像への単一の指数関数的減衰フィットを適用します。結果はその後でエンコードされているしきい値は、上記の各ピクセルの蛍光寿命が得られます色を指定します。各ピクセルは、フィットの結果で彩られ、FLIMマップが得られます。さまざまなピクセルの縮小カイ二乗値を確認します - 1（および最大1.3）の周りには良いフィット感を示しています。ランダムゼロの周りに分配されるべきである対応する残差を、点検してください。
- 特定の蛍光寿命は蛍光寿命自体に対し、発生する頻度を蛍光寿命のヒストグラムをプロットします。蛍光寿命分布は色の範囲に収まるように色の範囲を調整します。
- monoexponentialフィットが約1のカイ二乗値（および最大1.3）を得ませんし、ゼロからの残差の系統的な偏差がある場合は、より洗練されたモデルが必要となります。たとえば、また一つに色素の相対量の指示を与える前の指数因子や振幅が得られますプローブはフィットインチかもしれない2つの異なる環境を考慮して、蛍光減衰に二重指数関数モデルを当てはめてみてください環境メンターや他の。また、延伸指数関数では、蛍光寿命の分布を説明するために適切であるかもしれません。
- 各ピクセルの蛍光寿命は、事前指数因子、および寿命比と前の指数係数比の結果は、カラーでエンコードすることができます。各ピクセルは、その値に応じて着色し、蛍光寿命、事前指数因子およびそれらの比に起因するコントラストが得られます。優れたフィット感を示しています約1（および最大1.3） - 再び、減少カイ二乗値（また、色でコード化され、画像として表示することができる）をチェックしてください。ランダムゼロの周りに分配されるべきである残差を、点検してください。
- 蛍光寿命のヒストグラムは、平均蛍光寿命の値を簡単に可視化するためのすべての画像、および蛍光寿命分布を伴うべきである。
3。代表的な結果
を測定し、蛍光減衰メタノール/グリセロール混合物の粘度を増加させるに蛍光分子ロータは図に示されています。 2。蛍光減衰はmonoexponentialであり、蛍光寿命は、粘度の関数として著しく変化します。これは、メタノール中で約300ピコ秒（粘度0.6 CP）から95％グリセロール（粘度950 cP）の3.4 nsに増加します。
図2粘度を変化させたメタノール/グリセロール混合物のBODIPY-C 12の蛍光減衰のプロファイル6。
蛍光寿命の対数のキャリブレーションプロットはτ対蛍光分子ロータの粘度ηを図に示されています。 3。フェルスターホフマン式（9）で求められるように、それは直線です。
kは0 radiativですeの速度定数、 および zとxは 0 <x <1で、定数である。両側の利回りに対数をとる
ここで、x は直線の勾配です。
BODIPY-C 12収量フェルスター·ホフマン式に従って直線のログ蛍光寿命対ログ粘度の3プロット図 6。
蛍光分子ローターと生きている細胞のインキュベーションに続いて点状の色素の分布が蛍光画像で観察される。メソ置換BODIPY色素と共にインキュベートしたHeLa細胞のFLIMイメージは図に示されています。 4。画像の各ピクセルの蛍光減衰が十分に単一の指数関数的減衰モデルを使用して取り付けることができます。
図4（a）の蛍光強度とBODIPY-C 12で染色したHeLa細胞の（b）のFLIMの画像。明るい、強調する領域は、他の地域よりも短い寿命を示す。この短いliftimeはフェルスター·ホフマン式に従って、涙点の低い粘度は、おそらく脂質滴に対応しています。
図に示すように、すべてのピクセルから抽出された寿命をプロットすることにより、我々は、画像全体の蛍光寿命のヒストグラムを取得します。 5。
図5。メソ置換BODIPY分子ローターで染色したHeLa細胞のFLIM画像からの蛍光寿命のヒストグラム。
Discussion
FLIMは、強度ベースの蛍光イメージング上でいくつかの重要な利点を提供しています。それが蛍光体の濃度の影響からそれらを分離することができるため、蛍光強度イメージングによって観察することが困難または不可能な光物理的イベントに報告することができます。これはイメージング蛍光分子ローターによって細胞内の粘度をマッピングするために特に有用である。図に示すように、蛍光寿命は、容易に、検量線を用いた粘度に変換することができます。 3、蛍光分子ローターの濃度に依存しない。
FLIMでは、データの解釈を複雑にするかもしれないアーティファクトがあるかもしれません10インストゥルメンタルのアーティファクトは、蛍光減衰の始まりの上にピークとして表示されますと短いディケイ·タイムと混同されることがある散乱光、または後に小さなピークが含まれてい顕微鏡内部の反射によって引き起こされるかもしれIRF。これらの散乱光のアーティファクトは、そのように識別することができますので、彼らは、スペクトル差別と区別することができます - 彼らは励起光と同じ波長に常にある。空気中で、光は1ナノ秒は30センチメートルを移動することを思い出しては、反射の原因を突き止めるのに役立ちます。
フィルタやガラスの蛍光は、特に低いサンプルの蛍光で、アーティファクトを引き起こす可能性がありますが、これは簡単にサンプルすることなく測定を行うことにより識別できます。減衰は、これらの状況下で得られた場合、それは楽器によるものであるとは何の関係もありませんサンプルで！一方、サンプルの蛍光も蛍光減衰に寄与する可能性があることに注意してください。
時間相関単一光子計数（TCSPC）では、タイム·ツー·振幅変換器（TAC）の非直線性が悪く発作を引き起こす可能性がありますが、励起をブロックし、周囲の光を照らすことによって識別することができ、サンプル上に送信された光源からの例とタイミングを測定します。一定の背景がなければなりません画像の各画素で得られた。一定の背景からの逸脱が発生した地域は、優れたフィット感を得られないだろうと彼らはTCSPCカードのパラメータを調整することによって排除することができない場合、測定のために避けるべきである。
TCSPCの1つの悪名高いアーティファクトが高すぎる光子検出率によって引き起こされる光子パイルアップです。11,12これはエレクトロニクスが忙しい時期、最初の光子を処理しているため、後続の光子を無視して、タイムアウトしている最初の光子につながる。蛍光寿命の短縮、これを回避する最善の方法にパイルアップリードはレーザーの繰り返し率の1％前後で光子計数率を維持することです。
見通し
そこにFLIMの様々な実装があり、そのため、アプリケーションに応じて、それぞれに長所と短所があります。 図13は、理想的な蛍光顕微鏡は、全体の多次元蛍光emissioを取得したい単一光子感度、最大空間分解能と最小のアクイジション時間を持つ単一の測定の強度、位置、寿命、波長と偏光のn個の輪郭。そこにこの機能のユニークな組み合わせとの技術は現在ありません、1つはインスツルメンテーション開発者のための課題として残って構築する。細胞生物学における重要な問題への新しい物理的手法の適用は、しばしば予期しない発見へのパスであり、我々は細胞生物学のための蛍光イメージングの飽和機能を近いするまでに長い道のりがあります。実際、このような寿命、スペクトルと偏光と同様に、高い空間分解能で3Dでより迅速イメージングなどのイメージング蛍光パラメータは、細胞生物学の新しい側面を明らかにするために確信しています。
Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
MKKは、個人フェローシップ英国の工学物理科学研究評議会（EPSRC）ライフサイエンスインタフェースプログラムに感謝します。我々はまた、英国のバイオテクノロジー·生物科学研究会議（BBSRC）によって資金調達を承認したいと思います。
Materials
Sample with fluorescent molecular rotors Hardware: inverted Leica TCS SP2 confocal scanning microscope Coherent Mira 900 Ti:Sapphire femtosecond laser with a Verdi V6 pump laser or Hamamatsu PLP-10 470 picosecond pulsed diode laser excitation sources Becker & Hickl SPC 830 board in 3GHz, pentium IV, 1GB RAM computer with Windows XP cooled Becker & Hickl PMC100-01 detector head based on Hamamatsu H5773P-01 photomultipliers, mounted on microscope’s X1 port, or hybrid detectors DCC 100 detector control module Software: TRI-214 or SPCImage 2.8 by Becker & Hickl |
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