Summary
हम Agrobacterium - वायरस मध्यस्थता प्रेरित कपास में जीन मुंह बंद परख (VIGS) के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. तंबाकू खड़खड़ (TRV) वायरस व्युत्पन्न VIGS वैक्टर GrCLA1 कपास, Cloroplastos alterados एक जीन का मुंह बंद आरएनए प्रेरित करने के लिए तैनात किया गया था. सूरजमुखी मनुष्य GrCLA1 मुंह बंद करने के कारण phenotype अंकुर चरण में 2 सप्ताह के भीतर टीकाकरण के बाद मनाया गया.
Protocol
1. कपास seedlings बढ़ने
- Upland कपास (Gossypium hirsutum) किस्म 832 Fibermax, Phytogen 425RF, Phytogen 480WR और बर्तन (व्यास में 7 सेमी) मेट्रो 700 मिक्स (SunGR, Beavile, WA) युक्त में 90 Deltapine के बीज बोना.
- एक 23 में एक प्लास्टिक के गुंबद के साथ कवर ट्रे में बर्तन रखें डिग्री सेल्सियस, 120 μE -2 एस -1 प्रकाश मीटर एक 12 घंटे की एक वृद्धि कमरे में light/12 घंटे अंधेरे photoperiod के साथ.
- जब दो cotyledons उभरा है गुंबद निकालें.
- लगभग दो सप्ताह बाद, VIGS परख के लिए दो पूरी तरह से विस्तार cotyledons के साथ पौधों का उपयोग. इस स्तर पर, अभी तक सच पत्तियों (चित्रा 1) नहीं उभरा है.
2. निर्माण VIGS GrCLA1 जीन ले सदिश
- प्राइमरों GrCLA1 - एफ के साथ पीसीआर, 5'-GCCCTTTGTGCATCTTC-3 'और GrCLA1 आर, 5'-CTCTAGGGGCATTGAAG-3' जी की एक सीडीएनए लाइब्रेरी से कपास की Cloroplastos alterados 1 जीन (GrCLA1) बढ़ाना raimondii पत्ता ऊतकों.
- EcoRI और KpnI साथ GrCLA1 की पीसीआर उत्पादों डाइजेस्ट और ligation के द्वारा pYL156 (pTRV - RNA2) वेक्टर में सम्मिलित.
- लेग अगर 50 μg / Kanamycin के एमएल युक्त प्लेटों पर क्लोन स्क्रीन. प्रतिबंध एंजाइम पाचन और अनुक्रमण द्वारा constructs सत्यापित करें.
- Agrobacterium tumefaciens GV3101 में प्लाज्मिड electroporation द्वारा रूपांतरण और 28 पौंड तरल माध्यम में ठीक डिग्री सेल्सियस लेग साथ प्लेटों पर transformants चुनें + Kanamycin + (50 μg / एमएल) Gentamycin (25 μg / एमएल). बैक्टीरिया -80 डिग्री लंबी अवधि के उपयोग के लिए सी 25% ग्लिसरॉल में संग्रहीत किया जा सकता है है.
3. VIGS टीका प्रदर्शन
- तीन दिन पहले टीका Agrobacterium pYL192 (TRV) ले जाने tumefaciens की लकीर जमी ग्लिसरॉल शेयरों: RNA1, pYL156 (TRV): RNA2 (वेक्टर अकेले) और pYL156 (TRV): लेग अगर 50 μg / Kanamycin के एमएल युक्त प्लेटों पर RNA2 - GrCLA1 और 25 Gentamycin के μg / एमएल. 28 ° C पर 24 घंटे के लिए प्लेटों का सेते हैं.
- दो VIGS घुसपैठ से पहले दिन, ऊपर प्लेटों से प्रत्येक का निर्माण के लिए एक एकल कॉलोनी और लेने के लिए यह लेग 50 Kanamycin के μg / एमएल और 25 μg / एमएल Gentamycin के साथ पूरक मध्यम 5 एमएल में टीका लगाना, 28 जीवाणु संस्कृति ग्रो ° सी 50 rpm के एक गति से एक रोलर ड्रम में रात भर के लिए.
- (- (4 morpholino) एटैन sulfonic एसिड 2) और 20 सुक्ष्ममापी acetosyringone फ्लास्क लेग 50 Kanamycin के μg / एमएल और 25 μg / Gentamycin के एमएल, प्लस 10 मिमी एमईएस के साथ पूरक मध्यम के 50 एमएल के साथ ऊपर संस्कृति स्थानांतरण. 28 ° 50 rpm के एक गति के साथ एक प्रकार के बरतन में रात भर के लिए सी संस्कृति हो जाओ.
- अगले दिन पर नीचे 5 मिनट के लिए 4000 rpm पर कृषि बैक्टीरियल कोशिकाओं स्पिन, घुसपैठ बफर में 10 मिमी 2 MgCl, 10 मिमी एमईएस और 200 सुक्ष्ममापी acetosyringone युक्त संस्कृति फिर से निलंबित. 1.5 से 600 आयुध डिपो की संस्कृति को समायोजित करें.
- बेंच पर कमरे के तापमान पर 3 घंटे के लिए संस्कृति छोड़ दो.
- Agrobacterial घुसपैठ के पहले, पंच cotyledons के माध्यम से भेदी के बिना एक 25 जी सुई के साथ कपास के पौधों के cotyledons के नीचे. एक या दो छेद (ऊतक की कोमलता पर निर्भर करता है) cotyledon (चित्रा 2) के प्रत्येक अनुभाग पर मुक्का मारा गया.
- एक 1:1 अनुपात में RNA2 GrCLA1, हाथ cotyledons के नीचे से घायल एक 1 का उपयोग साइटों के माध्यम से मिश्रण घुसपैठ: RNA1 और pYL156 (TRV): RNA2 या pYL156 (TRV) pYL192 के Agrobacterial संस्कृति निलंबन (TRV) मिक्स एमएल needleless सिरिंज (चित्रा 3).
- पौधों को एक प्लास्टिक के गुंबद के साथ कवर और मंद प्रकाश शर्त के तहत रात भर के लिए कमरे के तापमान पर घुसपैठ पौधों छोड़.
- 23 के तापमान के साथ एक वृद्धि कमरे में पौधों स्थानांतरण डिग्री सेल्सियस, 120 μE -2 एस एक 12 घंटे के घंटे / प्रकाश 12 अंधेरे चक्र के साथ -1 प्रकाश हूँ.
नोट: VIGS काम करता है जब पौधों या तो 23 डिग्री सेल्सियस या glasshouse (25-28 डिग्री सेल्सियस) के अधीन हैं. जब तापमान अपेक्षाकृत कम है (23 से 25 डिग्री सेल्सियस) है, यह टीका के लिए आसान है और phenotype उच्च (28-30 डिग्री सेल्सियस) या fluctuated तापमान के साथ तुलना में अधिक है वर्दी. एक गुंबद के साथ पौधों को कवर भी VIGS अधिक कुशल बनाता है.
- ~ 7 8 दिनों के बाद घुसपैठ पर मुंह बंद phenotype जांच करते हैं. pYL156 (TRV) खामोश पौधों का सच पत्तियों: RNA2 GrCLA1 विवर्ण phenotype (चित्रा 4) प्रदर्शित करने के लिए शुरू कर दिया. पौधों Agrobacteria pYL156 ले जाने (TRV) के साथ घुसपैठ: RNA2 एक नियंत्रण के रूप में सेवा करते हैं.
- जीन मुंह बंद दक्षता अंतर्जात नियंत्रण और खामोश कपास के पौधों से अलग शाही सेना के साथ रिवर्स प्रतिलेखन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (RT-पीसीआर) का उपयोग कर जीनों की अभिव्यक्ति के स्तर की जांच करके सत्यापित करें.
नोट: VIGS एड पौधों निहित संगरोध शर्तों और पौधों के तहत रखा जाना चाहिए ठीक हो सकता है और autoclaved चाहिए assays के बाद निपटारा रूप TRV एक व्यापक मेजबान रेंज है और एक दर्ज रोगज़नक़ है.
4.प्रतिनिधि परिणाम:
Agrobacterial मिश्रण के साथ हाथ - घुसपैठ के बाद लगभग दो सप्ताह, विवर्ण GrCLA1 मुंह बंद करने की वजह से phenotype स्पष्ट रूप से सच के पत्तों पर मनाया गया. मुंह बंद दक्षता 50 से अधिक पौधों के साथ कई प्रयोगों में लगभग 100% तक पहुँचता है. खामोश पौधों नव बड़ी पत्तियों (चित्रा 4) पर एक मोज़ेक के साथ पत्तियों के विकास पर एक समान रूप से वितरित और बहुत मजबूत विवर्ण phenotype प्रदर्शित करते हैं.
चित्रा 1 के बारे में दो सप्ताह पुरानी चरण में एक पूरी तरह से दो विस्तार Agrobacterial घुसपैठ के लिए इस्तेमाल किया cotyledons के साथ कपास अंकुर.
चित्रा 2 कपास Agrobacterial घुसपैठ की सुविधा के लिए 25 जी सुई का उपयोग करने के लिए पौधों की cotyledons के underside पर छोटे छेद छिद्रण.
चित्रा 3. Agrobacterial मिश्रण के लोग घायल हो गए साइटों के माध्यम से कपास की cotyledons में हाथ घुसपैठ needleless सिरिंज का उपयोग
चित्रा 4 सूरजमुखी मनुष्य phenotype कपास पौधों खामोश VIGS पर दिखाई दिया. चार cultivars दिखाए जाते हैं. ए) Fibermax 832, बी) Phytogen 480WR; सी) Phytogen 425RF, डी) 90 Deltapine.
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Discussion
VIGS transiently नीचे अंतर्जात जीन की अभिव्यक्ति दस्तक द्वारा कार्यात्मक जीनोमिक्स विश्लेषण में एक शक्तिशाली उपकरण होना सिद्ध किया गया है. इस अध्ययन में, हम एक द्विआधारी TRV आधारित सदिश का उपयोग करके एक Agrobacterium की मध्यस्थता VIGS विकसित की है. कपास CLA1 जीन (GrCLA1) एक दृश्य मार्कर के रूप में विकसित किया गया था मुंह बंद दक्षता की निगरानी . हम लगातार जीन मुंह बंद दक्षता के 100%, विवर्ण सभी किस्मों में सच के पत्तों पर दिखने phenotype परीक्षण, के बारे में दो सप्ताह के बाद घुसपैठ से शुरू प्रदर्शन प्राप्त किया है. हालांकि, CLA1 - खामोश कपास पौधों को शायद ही फाइबर या बीज मंच है, जो की संभावना है chloroplast विकास पर मजबूत दोष के कारण में विकसित की है. कपास VIGS के सफल विकास के एक वैकल्पिक करने के लिए आसानी से ब्याज की हानि के समारोह assays के लिए जीन चुप्पी प्रदान करता है और तेजी से आ जीनोम के बाद 8 युग में कपास कार्यात्मक / आनुवंशिकी और जीनोमिक्स के लिए आधार देता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम डीआरएस के आभारी हैं. सपा दिनेश कुमार और यूल लियू TRV-VIGS वैक्टर के लिए, और डीआरएस. चक Kenerley, टेरी व्हीलर, जिम स्टार और कपास के बीज उपलब्ध कराने के लिए बायर CropScience. इस काम NSF द्वारा पीएच रास और NIH के लिए वित्त पोषित किया गया था
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Roller drum | Glas-Col | 099A TC108 | Agro-bacterium culture |
| Incubator | Sheldon Manufacturing, Inc. | 01046209 | Agro-bacterium culture |
| UV/Vis spectrophotometer | Beckman Coulter Inc. | Model: DU530 | Measuring OD |
| Gene Pulser | Bio-Rad | Model: 1652076; Serial: 154BR3880 | Electroporation |
| Pulser Controller | Bio-Rad | Model: 1652098; Serial: 232BR4833 | Electroporation |
| Micropulser Electroporation cuvette | Bio-Rad | 165-2081 | Electroporation |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 30962 | Inoculation of agro-bacterium |
| Metro Mix 700 | SUNGR | SKU# 553001 | Growing seedling |
| Terra Cotta pot | T.O.Plastics | GPS 3001B2 | Growing seedling |
| MES monohydrate | USB Corp., Affymetrix | 18886 | Infiltration buffer |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | Infiltration buffer |
References
- Chen, Z. J., Scheffler, B. E., Dennis, E., Triplett, B. A., Zhang, T., Guo, W. Toward sequencing cotton (Gossypium) genomes. Plant Physiol. 145, 1303-1310 (2007).
- Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y.
- Hamilton, A. J., Baulcombe, D. C. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science. 286, 950-952 (1999).
- Burch-Smith, T. M., Anderson, J. C., Martin, G. B., Dinesh-Kumar, S. P. Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants. Plant J. 39, 734-746 (2004).
- Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P.
- Estevez, J. M., Cantero, A., Romero, C., Kawaide, H., Jimenez, L. F., Kuzuyama, T. Analysis of the expression of CLA1, a gene that encodes the 1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway in Arabidopsis. Plant Physiol. 124, 95-104 (2000).
- Mandel, M. A., Feldmann, K. A., Herrera-Estrella, L., Rocha-Sosa, M., Leon, P. CLA1, a novel gene required for chloroplast development, is highly conserved in evolution. Plant J. 9, 649-658 (1996).
- Gao, X., Wheeler, T., Li, Z., Kenerley, C., He, P., Shan, L. Silencing GhNDR1 and GhMKK2 compromised cotton resistance to Verticillium wilt. Plant J. 66, 293-305 (2011).
