Summary
우리는 목화의 Agrobacterium - 중재 바이러스 유발 유전자 입을 (VIGS) 분석에 대한 상세한 프로토콜을 제시한다. 담배 래틀 바이러스 (TRV) - 파생 VIGS 벡터는 면화 GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 유전자의 입을 RNA를 유도하기 위해 배치되었다. 입을 GrCLA1로 인한 흰둥이 표현형은 접종 후 2 주 이내에 세들링 단계에서 관찰되었다.
Abstract
커튼 (고십피움 히르수툼)는 세계적으로 가장 중요한 작물 중 하나입니다. 상당한 노력은 새로운 종류의 분자 육종에되었습니다. 면화의 대규모 유전자 기능 분석은 게놈, 유전자 복제 및 polyploidy, 유전자 변형 1 길이 성장주기와 말을 안들음 자사의 대형에 의한 가능성이 현대 식물 종, 대부분의 뒤에서 느껴지되었습니다. 커튼 높은 처리량 기능 유전자 / 게놈 연구를 촉진하기 위해, 우리는 면화 유전자 기능을 평가하기 위해 신속하고 효율적인 과도 assays을 개발하려고합니다.
바이러스 유도된 유전자 입을 (VIGS)은 바이러스 확산 2,3을 주체할 수있는 호스트 포스트 Transcriptional 진 입을 (PTGS)을 기반으로 개발된 강력한 기술입니다. Agrobacterium - 중재 VIGS가 성공적으로 같은 Solanaceae, Arabidopsis과 콩과의 식물 수종으로 dicots 종의 다양한 적용 및 monocots 수종 다양한 기능적 게놈 연구 3,4을 위해 보리, 밀 및 옥수수를 포함하고 있습니다. 이 신속하고 효율적인 접근법 식물 변환을 피할 수와 기능 중복을 극복로서, 그것은 특히 매력적이고 변화에 대한 의무가없는 목화 같은 작물 종의 기능 게놈 연구에 적합합니다.
본 연구에서는, 우리는 목화의 Agrobacterium - 중재 VIGS 시스템의 상세한 프로토콜을보고합니다. 여러 바이러스 VIGS 벡터 중에서 담배 래틀 바이러스 (TRV)는 호스트의 다양한 침공하고 아직 hosts5에 가벼운 증상을 생산하여 전체 공장을 통해 적극적으로 전파 수 있습니다. 입을 효율, GrCLA1, alterados 1 면화의 유전자 (AtCLA1). CLA1 유전자가 엽록체 개발 6 관여 복제 및 VIGS 이진 벡터 pYL156에 삽입되었으며, 이전의 연구 보여주 Arabidopsis Cloroplastos의 상동체 유전자를 모니터링하는 것을 AtCLA1의 손실 기능은 효율을 입을 수있는 훌륭한 시각적인 마커를 제공하고, 진정한 나뭇잎 7 흰둥이 표현형 결과. 약 이주에 게시 Agrobacterium의 침투, 흰둥이 표현형은 모든 복제 실험에서 100 % 입을 효율, 진정한 나뭇잎에 표시하기 시작했습니다. 내생 유전자 표현의 입을는 RT - PCR 분석에 의해 확인되었다. 크게, 입을는 potently 텍사스 다양한 상업적으로 재배 품종을 포함하여 우리가 테스트한 모든 cultivars에 발생할 수 있습니다. 이것은 신속하고 효율적인 Agrobacterium - 중재 VIGS 분석은 목화의 게놈 - 넓은 수준에서 유전자 기능을 신속하게 대규모 분석을위한 매우 강력한 도구를 제공합니다.
Protocol
1. 목화 모종의 성장
- 업랜드 커튼 (고십피움 히르수툼) 다양한 Fibermax 832, Phytogen 425RF, Phytogen 480WR 및 지하철 믹스 700 (SunGR, Beavile, WA)이있는 냄비 (지름 7cm)에 Deltapine 90 씨앗을 뿌리다.
- 23 플라스틱 돔 덮여 트레이에서 냄비를 유지 성장 방에 12시간 light/12 시간 어두운 photoperiod 함께 ° C, 120 μE m -2 S -1 빛.
- 이 cotyledons가 등장 돔을 제거합니다.
- 약 2 주후에 VIGS 분석의 두 가지 완전히 확장된 cotyledons과 식물을 사용합니다. 이 단계에서, 진정한 단풍은 아직 (그림 1) 등장하지 않았습니다.
2. GrCLA1 유전자를 운반 건설 VIGS 벡터
- G.의 cDNA 라이브러리에서 primers GrCLA1 - F와 PCR, 5' - GCCCTTTGTGCATCTTC - 3 '와 GrCLA1 - R, 5' - CTCTAGGGGCATTGAAG - 3'로 무명의 Cloroplastos alterados 한 유전자 (GrCLA1)를 증폭 raimondii 잎 조직.
- EcoRI과 KpnI과 GrCLA1의 PCR 제품을 다이제스트와 결합하여 pYL156 (pTRV - RNA2) 벡터에 삽입합니다.
- 50 μg / Kanamycin의 ML이 포함된 LB 한천 플레이트에 클론을 화면. 제한 효소 분해 및 시퀀싱하여 구조를 확인합니다.
- electroporation에 의해 Agrobacterium tumefaciens GV3101으로 플라스미드를 변환 28에서 LB 액체 배지에 복구 ° C. LB와 함께 접시에 transformants을 선택 + Kanamycin (50 μg / ML) + Gentamycin (25 μg / ML). 박테리아는 -80 ° C에서 장기 사용을 위해 25 % 글리세롤에 저장할 수 있습니다.
3. VIGS 접종을 수행
- pYL192 (TRV)를 들고 Agrobacterium의 tumefaciens의 접종, 탄력 냉동 글리세롤 주식 사흘 전에 : RNA1, pYL156 (TRV) : RNA2 (벡터 혼자)과 pYL156 (TRV) : 50 μg / Kanamycin의 ML이 포함된 LB 한천 플레이트에 RNA2 - GrCLA1 25 μg / Gentamycin의 ML. 24 시간 동안 28 ° C에서 접시를 품어.
- VIGS 침투하기 전에 이틀, 위의 접시에서 각 구조에 대한 하나의 식민지를 선택 50 μg / Kanamycin의 ML 25 μg / Gentamycin의 ML과 보충 LB 매체의 5 ML에 그것을 예방, 28에서 세균성 문화를 성장 ° 50 RPM의 속도로 롤러 드럼에서 하룻밤을위한 C.
- (- (4 morpholino) 에탄 설폰산 2) 및 20 μm의 제품 acetosyringone 50 μg / Kanamycin의 ML 25 Gentamycin의 μg / ML, 추가로 10 MM MES와 보충 LB 매체 50 ML있는 플라스크에 위의 문화를 전송합니다. ° C 50 RPM의 속도로 통에 하루를위한 28의 문화를 성장.
- 다음날, 5 분 4,000 RPM에서 농업 박테리아 세포를 스핀 다운, 10 MM MgCl 2, 10 MM MES와 200 μm의의 acetosyringone를 포함하는 침투 버퍼의 문화를 다시는 - 일시 중지합니다. 1.5 문화의 OD 600 조정합니다.
- 3 시간 동안 실온에서 벤치에 문화를 둡니다.
- Agrobacterial 침투하기 전에, 펀치 cotyledons 통해 피어싱없이 25 G 바늘로 목화 식물의 cotyledons의 아래쪽. 하나 또는 두 개의 구멍 (조직의 부드러움에 따라 다름) 떡잎의 각 섹션 (그림 2)에 펀치했다.
- 1:1 비율 RNA2 - GrCLA1, 손 1을 사용하여 입힐 수있는 총알 사이트를 통해 cotyledons의 아래쪽에서 혼합물에 침투해 : RNA1 및 pYL156 (TRV) : RNA2 또는 pYL156 (TRV) pYL192의 Agrobacterial 문화 서스펜션 (TRV)를 혼합 ML needleless 주사기 (그림 3).
- 플라스틱 돔과 함께 식물을 커버하고 야간에 대한 희미한 빛 조건하에 상온에서 침입 식물을 두십시오.
- 23 온도와 성장 방에 식물을 전송 ° C, 120 μE m 12 시간 조명 / 12시간 어두운주기 -2 S -1 빛.
참고 : 식물 23 ° C 또는 글래스 하우스 (25-28 ° C) 중 아래의 경우 VIGS가 작동합니다. 온도 (23-25 ° C) 상대적으로 낮은 경우, 그것은 접종을 위해 쉽게하고 표현형 높은 (28-30 ° C) 또는 오르 내렸는지를 보여준다 온도에 비해 더 균일합니다. 돔과 식물을 포함하면 VIGS가 더 효율적입니다.
- 7 ~ 8 일 게시 침투에 입을 표현형을 검사합니다. pYL156 (TRV)에 의해 입막음을 식물의 진정한 잎 : RNA2 - GrCLA1는 흰둥이 표현형를 (그림 4)을 표시하기 시작했습니다. Agrobacteria 운반 pYL156 (TRV)와 침투 식물 : RNA2는 컨트롤 역할을합니다.
- 제어 및 침묵 면화 공장으로부터 격리 RNA와 리버스 전사 중합 효소의 연쇄 반응 (RT - PCR)을 사용하여 내생 유전자의 표현 수준을 검사하여 유전자 입을 효율성을 확인합니다.
참고 : TRV는 광범위한 호스트 범위를 가지고 있으며 신고 대상 병원체이므로 VIGS - ed를 식물이 포함된 검역 조건과 식물에 따라 보관해야 제대로 autoclaved 및 assays 후 처리하여야한다.
4.대표 결과 :
약 이주 Agrobacterial 혼합 손으로 침투 후 GrCLA1 입을 의한 흰둥이 표현형 분명 진정한 나뭇잎에서 관찰되었다. 입을 효율 50 개 이상의 식물을 여러 실험을 거의 100 %에 도달합니다. 입을 식물 새롭게 엘더 단풍 (그림 4)에 모자이크와 나뭇잎을 개발에 균일하게 배포하고 강한 흰둥이 표현형를 표시합니다.
그림 1. Agrobacterial 침투에 사용이 완전히 확장 cotyledons 두 주간 올드 스테이지에 대해에서 무명 세들링.
그림 2. Agrobacterial 침투를 용이하게하기 위해 25 G 바늘을 사용하여 목화 식물의 cotyledons의 아래쪽에 작은 구멍을 펀칭.
그림 3. 입힐 수있는 총알 사이트를 통해 무명의 cotyledons에 Agrobacterial 혼합의 핸드 침투는 needleless 주사기를 사용하여
그림 4. 알비노 표현형은 면화 공장을 침묵 VIGS에 나타났습니다. 네 cultivars가 표시됩니다. A) Fibermax 832, B) Phytogen 480WR, C) Phytogen 425RF, D) Deltapine 90.
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Discussion
VIGS은 transiently 내생 유전자의 표현을 쓰러뜨린하여 기능적 게놈 분석에 강력한 도구로 입증되었습니다. 본 연구에서는, 우리는 TRV 기반 이진 벡터를 이용하여 Agrobacterium - 중재 VIGS을 개발했습니다. 커튼 CLA1 (GrCLA1) 유전자는 입을 효율성을 모니터링하는 시각 마커로 개발되었습니다. 우리는 지속적으로 모든 종류의 진정한 나뭇잎에 나타나는 흰둥이 표현형은 약 2 주 게시물 침투로부터 시작, 테스트에 의해 입증 유전자 입을 효율의 100 %를 획득했습니다. 그러나, CLA1 - 침묵 면화 공장 거의 가능성이 엽록체 개발에 강한 결함에 의한 섬유 또는 종자 단계로 발전하지 않습니다. 목화 VIGS의 성공적인 개발은 쉽게 손실 기능 assays에 대한 관심의 유전자를 침묵하는 대안을 제공하고 빠르게 다가오고 포스트 게놈 시대 8 면화 기능 유전학 / 유전체학에 대한 기초를 낳는다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 DRS에게 감사하고 있습니다. SP Dinesh - 쿠마과 율 리우 TRV - VIGS 벡터, 그리고 DRS. 척 Kenerley, 테리 휠러, 짐 스타와 무명의 씨앗을 제공 바이엘 CropScience. 이 작품은 PH에 LS와 NIH에 NSF에 의해 투자되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Roller drum | Glas-Col | 099A TC108 | Agro-bacterium culture |
| Incubator | Sheldon Manufacturing, Inc. | 01046209 | Agro-bacterium culture |
| UV/Vis spectrophotometer | Beckman Coulter Inc. | Model: DU530 | Measuring OD |
| Gene Pulser | Bio-Rad | Model: 1652076; Serial: 154BR3880 | Electroporation |
| Pulser Controller | Bio-Rad | Model: 1652098; Serial: 232BR4833 | Electroporation |
| Micropulser Electroporation cuvette | Bio-Rad | 165-2081 | Electroporation |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 30962 | Inoculation of agro-bacterium |
| Metro Mix 700 | SUNGR | SKU# 553001 | Growing seedling |
| Terra Cotta pot | T.O.Plastics | GPS 3001B2 | Growing seedling |
| MES monohydrate | USB Corp., Affymetrix | 18886 | Infiltration buffer |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | Infiltration buffer |
References
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