Summary
Apresentamos o protocolo detalhado para Agrobacterium mediada induzida pelo vírus ensaio de silenciamento de genes (VIGS) em algodão. O vírus chocalho tabaco (TRV) derivados de vetores VIGS foram mobilizados para induzir silenciamento de RNA de algodão GrCLA1, Cloroplastos alterados um gene. O fenótipo albino causada pelo silenciamento GrCLA1 foi observada na fase de mudas dentro de 2 semanas após a inoculação.
Abstract
Algodão (Gossypium hirsutum) é uma das culturas mais importantes do mundo. Esforços consideráveis têm sido feitos sobre melhoramento molecular de novas variedades. A análise de genes em larga escala funcional em algodão tem sido ficado para trás a maioria das espécies de plantas modernas, provavelmente devido a seu grande tamanho do genoma, o gene duplicação e poliploidia, ciclo de crescimento longo e recalcitrância à transformação genética 1. Para facilitar o estudo funcional de alto rendimento genética / genômica em algodão, tentamos desenvolver rápida e eficiente ensaios transitórios para avaliar as funções dos genes do algodão.
Virus-Induced silenciamento gênico (VIGS) é uma poderosa técnica que foi desenvolvida com base no host silenciamento pós-transcricional Gene (PTGS) para reprimir a proliferação viral 2,3. Mediada por Agrobacterium VIGS tem sido aplicado com sucesso em uma ampla gama de espécies como dicotiledôneas Solanaceae, Arabidopsis e espécies de leguminosas, e as espécies monocotiledôneas incluindo trigo, cevada e milho, por vários estudos genômicos funcionais 3,4. Como esta abordagem rápida e eficiente evita transformação de plantas e supera redundância funcional, é particularmente atraente e adequado para o estudo do genoma funcional de espécies de culturas como o algodão não passíveis de transformação.
Neste estudo, relatamos o protocolo detalhado de Agrobacterium mediada sistema VIGS em algodão. Entre os vários vetores virais VIGS, o vírus chocalho tabaco (TRV) invade uma ampla gama de hospedeiros e é capaz de espalhar vigorosamente em toda a planta ainda produzir sintomas leves na hosts5. Para monitorar a eficiência silenciamento, GrCLA1, um gene homólogo de Cloroplastos Arabidopsis alterados um gene (AtCLA1) em algodão, foi clonado e inserido no vetor binário VIGS pYL156. CLA1 gene está envolvida no desenvolvimento do cloroplasto 6, e estudos anteriores demonstraram que perda de função de AtCLA1 resultou em um fenótipo albino em folhas verdadeiras 7, proporcionando um excelente marcador visual para silenciar eficiência. Em aproximadamente duas semanas infiltração Agrobacterium post, o fenótipo albino começaram a aparecer nas folhas verdadeiras, com eficiência de 100% em silenciar todos os experimentos replicados. O silenciamento da expressão do gene endógeno também foi confirmada por RT-PCR. Significativamente, silenciando poderia potently ocorrer em todas as cultivares testadas, incluindo diversas variedades comercialmente cultivadas em Texas. Essa rápida e eficiente mediada por Agrobacterium ensaio VIGS fornece uma ferramenta muito poderosa para a análise em larga escala rápida de funções dos genes no genoma nível em algodão.
Protocol
1. Crescer mudas de algodão
- Semear as sementes do algodão herbáceo (Gossypium hirsutum) variedade Fibermax 832, PhytoGen 425RF, PhytoGen 480WR e Deltapine 90 em vasos (7 cm de diâmetro) contendo Metro Mix 700 (SunGR, Beavile, WA).
- Manter os vasos em uma bandeja coberta com uma cúpula de plástico a 23 ° C, 120 μE m -2 S luz -1, com um fotoperíodo 12 horas horas light/12 escuros em sala de crescimento.
- Remova a cúpula quando dois cotilédones têm surgido.
- Aproximadamente duas semanas depois, use as plantas com dois cotilédones totalmente expandidos para o ensaio VIGS. Nesta fase, as folhas verdade ainda não surgiram (Figura 1).
2. Construir vector VIGS carregando GrCLA1 gene
- Amplificar o Cloroplastos alterados 1 gene de algodão (GrCLA1) por PCR com primers GrCLA1-F, 5'-GCCCTTTGTGCATCTTC-3 'e GrCLA1-R, 5'-CTCTAGGGGCATTGAAG-3' a partir de uma biblioteca de cDNA de G. tecidos raimondii folha.
- Digerir os produtos de PCR GrCLA1 com EcoRI e KpnI e inserir em pYL156 (pTRV-RNA2) vetor por ligadura.
- Tela os clones em placas LB ágar contendo 50 mcg / mL de canamicina. Verifique se as construções de digestão por enzimas de restrição e seqüenciamento.
- Transformar o plasmídeo em Agrobacterium tumefaciens GV3101 por eletroporação e recuperar em meio líquido LB a 28 ° C. Selecione o transformantes em placas com LB + canamicina (50 mg / mL) + Gentamicina (25 mg / mL). As bactérias podem ser armazenados em glicerol 25% a -80 ° C para o uso a longo prazo.
3. Executar VIGS inoculação
- Três dias antes da inoculação, raia stocks glicerol congelados de Agrobacterium tumefaciens carregando pYL192 (TRV): RNA1, pYL156 (TRV): RNA2 (vetor sozinho) e pYL156 (TRV): RNA2-GrCLA1 em placas de LB ágar contendo 50 mcg / mL de canamicina e 25 mg / mL de gentamicina. Incubar as placas a 28 ° C por 24 horas.
- Dois dias antes da infiltração VIGS, escolher uma única colônia de cada construção das placas acima e inocular-lo em 5 mL de meio LB suplementado com 50 mg / mL de canamicina e 25 mcg / ml de Gentamicina; Incubar a cultura bacteriana em 28 ° C para a noite em um tambor de rolo a uma velocidade de 50 rpm.
- Transferir a cultura acima para um frasco com 50 ml de meio LB suplementado com 50 mg / mL de canamicina e 25 mcg / ml de gentamicina, acrescido de 10 mM MES (2 - (4 morfolino) etano-sulfônico) e 20 mM acetosyringone. Crescer a cultura a 28 ° C para a noite em uma coqueteleira com uma velocidade de 50 rpm.
- No dia seguinte, girar as células agro-bacteriana a 4000 rpm por 5 minutos; re-suspender a cultura no buffer de infiltração contendo 10 mM MgCl 2, 10 mM MES e 200 acetosyringone mM. Ajustar o OD 600 da cultura para 1,5.
- Deixe a cultura no banco em temperatura ambiente por 3 horas.
- Antes de infiltração Agrobacterial, soco a parte de baixo cotilédones de plantas de algodão com uma agulha G 25 sem perfurar através dos cotilédones. Um ou dois furos (depende da maciez do tecido) foram perfurados em cada seção do cotilédone (Figura 2).
- Mix suspensão cultura Agrobacterial de pYL192 (TRV): RNA1 e pYL156 (TRV): RNA2 ou pYL156 (TRV): RNA2-GrCLA1 na proporção de 1:1; mão infiltrar a mistura do lado de cotilédones através dos sites ferindo usando a 1 mL seringa sem agulha (Figura 3).
- Cobrir as plantas com uma cúpula de plástico e deixe as plantas se infiltraram em temperatura ambiente sob condições de luz fraca para pernoite.
- Transferência de plantas para sala de crescimento com a temperatura de 23 ° C, 120 μE m -2 S luz -1 com um ciclo de 12 horas horas de luz / 12 escuro.
Nota: VIGS funciona quando as plantas estão sob ou 23 ° C ou em estufa (25-28 ° C). Quando a temperatura é relativamente baixa (23-25 ° C), é mais fácil para inoculação e fenótipo é mais uniforme em comparação com maior (28-30 ° C) ou temperatura oscilou. Cobrindo as plantas com uma cúpula também faz VIGS mais eficiente.
- Examine o fenótipo silenciar a 7 ~ infiltração pós 8 dias. As folhas de plantas verdade silenciada por pYL156 (TRV): RNA2-GrCLA1 começou a exibir o fenótipo albino (Figura 4). As plantas infiltradas com transporte Agrobacterium pYL156 (TRV): RNA2 servir como controle.
- Verificar a eficiência silenciamento do gene ao examinar o nível de expressão de genes endógenos com transcrição reversa reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) com RNA isolado de controle de plantas de algodão e silenciados.
Nota: As plantas VIGS-ed devem ser mantidos sob quarentena e condições contidas plantas devem ser devidamente esterilizado e descartado após os ensaios como TRV tem uma ampla gama de hospedeiros e é um patógeno de notificação obrigatória.
4.Resultados representativos:
Aproximadamente duas semanas após a mão-de infiltração com mistura Agrobacterial, o fenótipo albino causada por GrCLA1 silenciamento foi claramente observado nas folhas verdadeiras. A eficiência silenciar atinge quase 100% em múltiplas experiências com mais de 50 plantas. As plantas silenciadas exibir um fenótipo uniformemente distribuída e muito forte em novos albino desenvolvimento folhas com um mosaico nas folhas mais velho (Figura 4).
Figura 1. Um mudas de algodão em cerca de duas semanas de estágio de idade com dois cotilédones totalmente expandidos utilizado para infiltração Agrobacterial.
Figura 2. Perfuração de pequenos orifícios na parte inferior do cotilédones de plantas de algodão com uma agulha de 25 G para facilitar a infiltração Agrobacterial.
Figura 3. Infiltração Mão de mistura Agrobacterial na cotilédones de algodão através dos sites ferindo usando uma seringa sem agulha
Figura 4. Fenótipo Albino apareceu na VIGS silenciados plantas de algodão. Quatro cultivares são mostrados. A) Fibermax 832; B) PhytoGen 480WR; C) PhytoGen 425RF; D) Deltapine 90.
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Discussion
VIGS foi provado ser uma ferramenta poderosa na análise genômica funcional por transitoriamente derrubando a expressão de genes endógenos. Neste estudo, desenvolvemos um VIGS Agrobacterium mediada pela utilização de um vetor binário TRV-based. O algodão CLA1 gene (GrCLA1) foi desenvolvido como um marcador visual para monitorar a eficiência silenciar. Temos consistentemente obteve 100% de eficiência silenciamento gênico, demonstrado pelo fenótipo albino aparecendo nas folhas verdadeiras em todas as variedades testadas, a partir de cerca de infiltração pós duas semanas. No entanto, silenciou-CLA1 plantas de algodão pouco desenvolvida na fibra ou fase de constituição, que é provavelmente devido a defeitos forte no desenvolvimento do cloroplasto. O êxito no desenvolvimento VIGS algodão oferece uma alternativa ao silêncio prontamente os genes de interesse para a perda de função ensaios e os alicerces para a genética do algodão funcional / genômica nos aproximando rapidamente da era pós-genómica 8.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Somos gratos aos Drs.. Dinesh Kumar-SP e Yule Liu para TRV-VIGS vetores, e as Dras. Chuck Kenerley, Terry Wheeler, Jim Starr e Bayer CropScience para o fornecimento de sementes de algodão. Este trabalho foi financiado pela NSF para LS e NIH para PH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Roller drum | Glas-Col | 099A TC108 | Agro-bacterium culture |
| Incubator | Sheldon Manufacturing, Inc. | 01046209 | Agro-bacterium culture |
| UV/Vis spectrophotometer | Beckman Coulter Inc. | Model: DU530 | Measuring OD |
| Gene Pulser | Bio-Rad | Model: 1652076; Serial: 154BR3880 | Electroporation |
| Pulser Controller | Bio-Rad | Model: 1652098; Serial: 232BR4833 | Electroporation |
| Micropulser Electroporation cuvette | Bio-Rad | 165-2081 | Electroporation |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 30962 | Inoculation of agro-bacterium |
| Metro Mix 700 | SUNGR | SKU# 553001 | Growing seedling |
| Terra Cotta pot | T.O.Plastics | GPS 3001B2 | Growing seedling |
| MES monohydrate | USB Corp., Affymetrix | 18886 | Infiltration buffer |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | Infiltration buffer |
References
- Chen, Z. J., Scheffler, B. E., Dennis, E., Triplett, B. A., Zhang, T., Guo, W. Toward sequencing cotton (Gossypium) genomes. Plant Physiol. 145, 1303-1310 (2007).
- Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y.
- Hamilton, A. J., Baulcombe, D. C. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science. 286, 950-952 (1999).
- Burch-Smith, T. M., Anderson, J. C., Martin, G. B., Dinesh-Kumar, S. P. Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants. Plant J. 39, 734-746 (2004).
- Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P.
- Estevez, J. M., Cantero, A., Romero, C., Kawaide, H., Jimenez, L. F., Kuzuyama, T. Analysis of the expression of CLA1, a gene that encodes the 1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway in Arabidopsis. Plant Physiol. 124, 95-104 (2000).
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- Gao, X., Wheeler, T., Li, Z., Kenerley, C., He, P., Shan, L. Silencing GhNDR1 and GhMKK2 compromised cotton resistance to Verticillium wilt. Plant J. 66, 293-305 (2011).
