Summary
אנו מציגים את פרוטוקול מפורט עבור Agrobacterium בתיווך וירוס-Induced assay השתקה (VIGS) גנים כותנה. רעשן טבק וירוס (TRV) הנגזרות וקטורים VIGS נפרסו לגרום RNA השתקת GrCLA1 כותנה, Cloroplastos alterados 1 הגן. פנוטיפ לבקן הנגרמת על ידי השתקת GrCLA1 נצפתה בשלב שתיל בתוך 2 שבועות לאחר חיסון.
Abstract
כותנה (Gossypium hirsutum) הוא אחד הגידולים החשובים ביותר בעולם. מאמצים רבים נעשו על הריבוי המולקולרי של זנים חדשים. ניתוח בקנה מידה גדול גן תפקודית כותנה כבר פיגרה רוב מיני הצמחים המודרנית, ככל הנראה בשל גודלו של הגנום, שכפול גנטי polyploidy, מחזור צמיחה סרבנות ארוך לשינוי גנטי 1. כדי להקל על מחקר גנטי גבוה התפוקה / גנומית פונקציונלית כותנה, אנו מנסים לפתח מבחני חולף מהיר ויעיל כדי להעריך את גן פונקציות כותנה.
Virus-induced להשתקת גנים (VIGS) היא טכניקה רבת עוצמה אשר פותחה על בסיס לארח את הפוסט תעתיק להשתקת גנים (PTGS) לדכא התפשטות ויראלית 2,3. Agrobacterium בתיווך VIGS יושם בהצלחה במגוון רחב של מינים dicots כגון Solanaceae, ארבידופסיס ומינים קטניות, מינים monocots כולל שעורה, חיטה, תירס, עבור מחקרים שונים גנומית תפקודית 3,4. כפי גישה זו מהיר ויעיל ימנע שינוי הצמח מתגבר יתירות פונקציונלית, הוא אטרקטיבי במיוחד ומתאימה המחקר הגנומי תפקודית מינים כמו יבול הכותנה לא ניתנות לשינוי.
במחקר זה, אנו מדווחים על פרוטוקול מפורט של מערכת VIGS Agrobacterium בתיווך כותנה. בין וקטורים ויראליים VIGS מספר, טרטור טבק וירוס (TRV) פולש מגוון רחב של המארחים, והוא מסוגל להתפשט נמרצות ברחבי המפעל כולו עדיין לייצר סימפטומים קלים על hosts5. כדי לבדוק את יעילות השתקה, GrCLA1, גן homolog של Cloroplastos ארבידופסיס alterados 1 גן (AtCLA1) כותנה, כבר משובטים ונוסף וקטור בינארי VIGS pYL156. CLA1 גן עוסקת בפיתוח הכלורופלסט 6, מחקרים קודמים הראו כי ההפסד-of-פונקציה של AtCLA1 הביא פנוטיפ לבקן על העלים נכון 7, מתן סמן ויזואלי מצוין השתקה יעילות. בסביבות שבועיים שלאחר חדירת Agrobacterium, את הפנוטיפ לבקן החלו להופיע על העלים נכון, עם יעילות ההשתקה של 100% כל הניסויים משוכפל. השתקה של ביטוי גנים אנדוגניים אושרה גם על ידי ניתוח RT-PCR. ראוי לציין, השתקה potently יכול להתרחש בכל הזנים שנבדקו, כולל זנים מסחריים שונים גדל בטקסס. זה מהיר ויעיל Agrobacterium בתיווך assay VIGS מספק כלי רב עוצמה עבור ניתוח בקנה מידה גדול מהירה של פונקציות גן ברמת הגנום כולו כותנה.
Protocol
1. לגדול שתילי גפן
- זרעו את זרעי הכותנה הגבעות (Gossypium hirsutum) מגוון Fibermax 832, Phytogen 425RF, Phytogen 480WR ו Deltapine 90 בעציצים (7 ס"מ קוטר) המכיל מערבבים מטרו 700 (SunGR, Beavile, WA).
- שמור את הסירים על מגש מכוסה כיפה פלסטיק ב 23 ° C, 120 μE מ -1 S -2 קל, עם photoperiod 12 light/12 שעה שעה חשוך בחדר צמיחה.
- הסר את הכיפה כאשר שני cotyledons צמחו.
- כשבועיים לאחר מכן, השתמש צמחים עם שתי cotyledons הרחיב באופן מלא עבור assay VIGS. בשלב זה, את העלים האמיתיים עדיין לא הופיעו (איור 1).
2. Construct VIGS וקטור נושאת GrCLA1 גן
- להגביר את alterados Cloroplastos 1 גן של כותנה (GrCLA1) על ידי PCR עם פריימרים GrCLA1 F-5'-GCCCTTTGTGCATCTTC-3 'ו GrCLA1-R, 5'-CTCTAGGGGCATTGAAG-3 "מספריית cDNA של G. raimondii עלה רקמות.
- תקציר המוצרים PCR של GrCLA1 עם EcoRI ו KpnI ולהכניס לתוך pYL156 (pTRV-RNA2) וקטור ידי קשירת.
- מסך שיבוטים על צלחות אגר LB המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל של Kanamycin. בדוק את המבנים על ידי אנזים העיכול הגבלה וסדר.
- להפוך את הפלסמיד לתוך Agrobacterium tumefaciens GV3101 ידי electroporation ולשחזר במדיום נוזלי LB ב 28 ° C. בחר את transformants על צלחות עם LB + Kanamycin (50 מיקרוגרם / מ"ל) + Gentamycin (25 מיקרוגרם / מ"ל). החיידק יכול להיות מאוחסן גליצרול 25% ב -80 ° C לשימוש לטווח ארוך.
3. בצע VIGS חיסון
- שלושה ימים לפני, חיסון פס מניות גליצרול קפוא של tumefaciens Agrobacterium נושאת pYL192 (TRV): RNA1, pYL156 (TRV): RNA2 (וקטור לבד) ו pYL156 (TRV): RNA2-GrCLA1 על צלחות אגר LB המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל של Kanamycin ו 25 מיקרוגרם / מ"ל של Gentamycin. דגירה צלחות ב 28 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
- יומיים לפני חדירת VIGS, בחר לבנות מושבת יחיד עבור כל אחד מן הלוחות לעיל לחסן אותו לתוך 5 מ"ל של מדיום LB בתוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל של Kanamycin ו 25 מיקרוגרם / מ"ל של Gentamycin; לגדל את תרבית החיידקים על 28 ° C עבור לילה תוף הרים במהירות של 50 סל"ד.
- העברת התרבות לעיל כדי בקבוקון עם 50 מ"ל של מדיום LB בתוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל של Kanamycin ו 25 מיקרוגרם / מ"ל של Gentamycin, בתוספת 10 mM MES (2 - (4 morpholino), אתאן חומצה sulfonic) ו 20 acetosyringone מיקרומטר. לגדול התרבות ב 28 מעלות צלזיוס למשך לילה שייקר עם מהירות של 50 סל"ד.
- למחרת, ספין למטה אגרו תאים חיידקיים בסל"ד 4000 למשך 5 דקות; מחדש להשעות את התרבות חדירה למאגר המכיל 10 mM MgCl 2, 10 mM ו - MES acetosyringone 200 מיקרומטר. התאם את OD 600 של התרבות על 1.5.
- השאירו את התרבות על הספסל בטמפרטורת החדר למשך 3 שעות.
- לפני חדירת Agrobacterial, אגרוף התחתון של cotyledons של צמחי הכותנה עם מחט 25 G בלי פירסינג דרך cotyledons. אחד או שני חורים (תלוי הרכות של רקמה) היו אגרופים על כל מקטע של טבורית (איור 2).
- מערבבים ההשעיה תרבות Agrobacterial של pYL192 (TRV): RNA1 ו pYL156 (TRV): RNA2 או pYL156 (TRV): RNA2-GrCLA1 ביחס 1:1; יד לחדור את התערובת מן החלק התחתון של cotyledons באמצעות אתרי ופצע באמצעות 1 מ"ל מזרק מחטים (איור 3).
- מכסים את הצמחים עם כיפה הפלסטיק ולהשאיר את הצמחים שחדרו בטמפרטורת החדר בתנאי אור עמום במשך הלילה.
- העברת צמחים לחדר עם צמיחה בטמפרטורה של 23 ° C, 120 מ 'אור μE -1 S -2 עם במחזור אור / 12 שעות 12 שעות חושך.
הערה: VIGS עובד כאשר הצמחים נמצאים תחת או 23 ° C או החממה (25-28 ° C). כאשר הטמפרטורה נמוכה יחסית (23-25 מעלות צלזיוס), קל יותר עבור חיסון לבין פנוטיפ הוא יותר אחיד, לעומת יותר (28-30 מעלות צלזיוס) או הטמפרטורה נע. כיסוי הצמחים עם כיפה גם עושה VIGS יעיל יותר.
- בדוק את הפנוטיפ השתקה ב 7 ימים חדירה ~ 8 לפרסם. העלים של צמחים נכון מושתקים על ידי pYL156 (TRV): RNA2-GrCLA1 החלו להציג את הפנוטיפ לבקן (איור 4). הצמחים שחדרו עם נושאים Agrobacteria pYL156 (TRV): RNA2 לשמש כביקורת.
- בדוק את היעילות להשתקת גנים באמצעות בחינת רמת הביטוי של גנים אנדוגניים באמצעות שעתוק לאחור polymerase תגובת שרשרת (RT-PCR) עם RNA שבודד מלאה צמחי הכותנה השתיק.
הערה: VIGS-ed צמחים צריך להישמר בתנאי הסגר צמחים הכלול צריך להיות autoclaved שצריך להיפטר לאחר מבחני כמו TRV יש מגוון רחב מארח הוא פתוגן רשומות.
4.נציג תוצאות:
כשבועיים לאחר חדירה ביד עם תערובת Agrobacterial, הפנוטיפ לבקן הנגרמת על ידי השתקת GrCLA1 נצפתה בבירור על העלים נכון. יעילות ההשתקה מגיע כמעט 100% בניסויים רבים עם יותר מ 50 צמחים. הצמחים השתיק להציג פנוטיפ לבקן מפוזרים באופן אחיד וחזק מאוד לאחרונה על פיתוח עלים בפסיפס על העלים הבכור (איור 4).
באיור 1. שתיל גפן על הבמה שבועיים הישן עם שני cotyledons הרחיב באופן מלא המשמש חדירה Agrobacterial.
איור 2. ניקוב חורים זעירים על החלק התחתון של cotyledons של צמחי הכותנה באמצעות מחט 25 G כדי להקל על חדירת Agrobacterial.
איור 3. הסתננות יד של תערובת Agrobacterial לתוך cotyledons כותנה באמצעות אתרי ופצע באמצעות מזרק מחטים
איור 4. פנוטיפ אלבינו הופיע VIGS השתיק צמחי הכותנה. ארבעה זנים מוצגים. א) Fibermax 832; B) Phytogen 480WR: C) Phytogen 425RF: D) Deltapine 90.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
VIGS הוכח להיות כלי רב עוצמה לניתוח גנומיקה תפקודית על ידי transiently מפילה את הביטוי של גנים אנדוגניים. במחקר זה, פיתחנו Agrobacterium בתיווך VIGS ידי ניצול וקטור TRV מבוססי בינארי. כותנה CLA1 (GrCLA1) גן פותחה כסמן ויזואלי כדי לעקוב אחר יעילות ההשתקה. השגנו בעקביות 100% יעילות השתקת הגן, שהפגינו פנוטיפ לבקן המופיעים העלים נכון כל הזנים שנבדקו, החל חדירה על שבועיים פירסום. עם זאת, CLA1-השתיק צמחי הכותנה כמעט שלא פיתחה לתוך הסיבים או בשלב הזרע, אשר צפוי עקב פגמים חזק על התפתחות הכלורופלסט. התפתחות מוצלחת של VIGS כותנה מספק אלטרנטיבה בקלות להשתיק את הגנים של הריבית על אובדן-of-פונקציה מבחני ומניח בסיס גנטיקה כותנה / גנומיקה תפקודית עידן מהיר שלאחר הגנום מתקרב 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
אנו מודים בני הזוג. SP-דינש קומאר חג המולד ליו עבור TRV-VIGS וקטורים, ואת בני הזוג. צ'אק Kenerley, טרי וילר, ג'ים סטר ו Bayer CropScience למתן זרעי כותנה. עבודה זו מומנה על ידי LS-NSF ו-NIH ל PH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Roller drum | Glas-Col | 099A TC108 | Agro-bacterium culture |
| Incubator | Sheldon Manufacturing, Inc. | 01046209 | Agro-bacterium culture |
| UV/Vis spectrophotometer | Beckman Coulter Inc. | Model: DU530 | Measuring OD |
| Gene Pulser | Bio-Rad | Model: 1652076; Serial: 154BR3880 | Electroporation |
| Pulser Controller | Bio-Rad | Model: 1652098; Serial: 232BR4833 | Electroporation |
| Micropulser Electroporation cuvette | Bio-Rad | 165-2081 | Electroporation |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 30962 | Inoculation of agro-bacterium |
| Metro Mix 700 | SUNGR | SKU# 553001 | Growing seedling |
| Terra Cotta pot | T.O.Plastics | GPS 3001B2 | Growing seedling |
| MES monohydrate | USB Corp., Affymetrix | 18886 | Infiltration buffer |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | Infiltration buffer |
References
- Chen, Z. J., Scheffler, B. E., Dennis, E., Triplett, B. A., Zhang, T., Guo, W. Toward sequencing cotton (Gossypium) genomes. Plant Physiol. 145, 1303-1310 (2007).
- Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y.
- Hamilton, A. J., Baulcombe, D. C. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science. 286, 950-952 (1999).
- Burch-Smith, T. M., Anderson, J. C., Martin, G. B., Dinesh-Kumar, S. P. Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants. Plant J. 39, 734-746 (2004).
- Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P.
- Estevez, J. M., Cantero, A., Romero, C., Kawaide, H., Jimenez, L. F., Kuzuyama, T. Analysis of the expression of CLA1, a gene that encodes the 1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway in Arabidopsis. Plant Physiol. 124, 95-104 (2000).
- Mandel, M. A., Feldmann, K. A., Herrera-Estrella, L., Rocha-Sosa, M., Leon, P. CLA1, a novel gene required for chloroplast development, is highly conserved in evolution. Plant J. 9, 649-658 (1996).
- Gao, X., Wheeler, T., Li, Z., Kenerley, C., He, P., Shan, L. Silencing GhNDR1 and GhMKK2 compromised cotton resistance to Verticillium wilt. Plant J. 66, 293-305 (2011).
