Summary
Agrobacterium pamuk virüs indüklenen gen susturulması (VIGS) tahlil için ayrıntılı protokol sunuyoruz. Tütün çıngırak virüsü (TRV) türetilen VIGS vektörler, pamuk GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 geninin RNA susturma ikna etmek için konuşlandırıldı. Susturulması GrCLA1 kaynaklanan albino fenotip fide aşamasında aşılama sonrası 2 hafta içinde gözlenmiştir.
Abstract
Pamuk (Gossypium hirsutum), dünya çapında en önemli bitkileri biridir . , Yeni çeşitlerin moleküler ıslahı konusunda önemli çabalar yapılmıştır. Genomu, gen çoğaltılması ve poliploidi, genetik transformasyon 1 uzun büyüme döngüsü ve inatçılıklarıyla büyük boyutu nedeniyle büyük olasılıkla modern bitki türleri, en gerisinde kalmıştır pamuk büyük ölçekli gen fonksiyonel analiz edilmiştir . Yüksek pamuk üretilen fonksiyonel genetik / genomik çalışma kolaylaştırmak için, pamuk gen fonksiyonlarını değerlendirmek için hızlı ve etkili bir geçici testleri geliştirmek için çalışırlar.
Virüs Bağlı Gen susturma (VIGS), viral çoğalma 2,3 bastırmak için ana Post-transkripsiyonel gen susturma (PTGS) dayalı olarak geliştirilen güçlü bir tekniktir. Agrobacterium VIGS Solanaceae, Arabidopsis ve baklagil türlerinin ikiçeneklilerin türlerin geniş bir yelpazede başarıyla uygulanan ve biçeneklilerin türler arpa, buğday ve mısır, çeşitli fonksiyonel genomik çalışmalar için 3,4 dahil olmuştur. Bu hızlı ve verimli bir yaklaşım bitki dönüşüm önler ve fonksiyonel fazlalık üstesinden, özellikle çekici ve dönüşüm için uygun değildir pamuk gibi bitki türleri işlevsel genomik çalışmaları için uygundur.
Bu çalışmada, pamuk Agrobacterium VIGS sisteminin ayrıntılı protokol rapor. Çeşitli viral VIGS vektörleri arasında, tütün çıngırak virüsü (TRV) ev sahipliği yapan geniş bir yelpazede işgal etti ve henüz hosts5 hafif belirtiler üretmek tüm bitki boyunca kuvvetlice yaymak mümkün. Susturulması verimliliği, GrCLA1 alterados 1 geni (AtCLA1) pamuk, CLA1 gen kloroplast gelişimi 6 yer almaktadır klonlanmış ve VIGS ikili vektör pYL156 takılı olan ve önceki çalışmalar göstermiştir Arabidopsis Cloroplastos bir homolog gen izlemek için AtCLA1,-fonksiyon kaybı, verimlilik susturmak için mükemmel bir görsel belirteç sağlayarak, gerçek yaprakları 7 bir albino fenotip sonuçlandı . Yaklaşık iki haftada sonrası Agrobacterium infiltrasyon, albino fenotip çoğaltılan tüm deneylerde% 100 susturulması verimliliği ile, gerçek yaprakları görünmeye başladı. Susturulması endojen gen ekspresyonu RT-PCR analizleri ile de teyit edilmiştir. Önemli ölçüde, susturulması kuvvetli Texas çeşitli ticari olarak yetiştirilen çeşitler de dahil olmak üzere, test edilen tüm çeşitlerin meydana gelebilir. Bu hızlı ve verimli Agrobacterium VIGS tahlil pamuk genom düzeyinde gen fonksiyonları hızlı bir şekilde büyük çaplı bir analiz için çok güçlü bir araç sağlar.
Protocol
1. Grow pamuk fideleri
- Upland pamuk (Gossypium hirsutum) çeşitli Fibermax 832, Phytogen 425RF, Phytogen 480WR ve Deltapine 90 Metro Mix 700 (SunGR, Beavile, WA) içeren tencere (çapı 7 cm) tohumları Sow.
- Bir büyüme odasında 12 saat light/12 saat karanlık fotoperiyodun ° C, 120 μE m -2 G -1 ışık, 23 plastik bir kubbe ile örtülü bir tepsi tencere tutun.
- Kubbenin iki kotiledonlarında ortaya çıkarın.
- Yaklaşık iki hafta sonra, VIGS tayini için iki tam genişletilmiş kotiledonlarında bitkiler kullanın. Bu aşamada, gerçek yaprakları henüz (Şekil 1) ortaya çıkmış değil.
2. GrCLA1 geni taşıyan Construct VIGS vektör
- G. cDNA kütüphanesi PCR primerleri GrCLA1-F ile 5'-GCCCTTTGTGCATCTTC-3 've GrCLA1-R, 5'-CTCTAGGGGCATTGAAG-3' pamuk Cloroplastos alterados 1 geni (GrCLA1) Amplify raimondii yaprak dokuları.
- EcoRI ve KpnI GrCLA1, PCR ürünleri Digest ve ligasyonu ile pYL156 (pTRV-RNA2) vektör takın.
- 50 mg / Kanamisin ml içeren LB agar plaklarına klonlar Ekran. Restriksiyon enzimi sindirim ve sıralama yapıları olun.
- Elektroporasyon Agrobacterium tumefaciens GV3101 plazmid Transform ve 28 LB sıvı ortamda kurtarmak ° C LB ile plakalar transformants seçin + Kanamisin (50 mg / ml) + Gentamisin (25 mg / ml). Bakteri, -80 ° C ile uzun süreli kullanım için% 25 gliserol içerisinde saklanabilir.
3. VIGS aşılama gerçekleştirin
- Üç gün önce taşıma pYL192 (TRV) Agrobacterium tumefaciens aşılama, çizgi dondurulmuş gliserol stokları RNA1, pYL156 (TRV): RNA2 (vektör tek başına) ve pYL156 (TRV): 50 mg / Kanamisin ml içeren LB agar plaklarına RNA2-GrCLA1 ve 25 mikrogram / mL Gentamisin. Plakalar için 28 ° C'de 24 saat inkübe edin.
- İki gün önce VIGS infiltrasyon, yukarıdaki plakalardan her inşa için tek bir koloni almak ve içine 5 ml, 50 mg / Kanamisin mL ve 25 mcg / ml Gentamisin ile desteklenmiş LB orta aşılamak; 28 bakteri kültürü büyütün ° C 50 rpm hızında bir rulo davul geceleme.
- 50 ml LB orta (- (4 morfolino)-etan, propan sülfonik asit 2) ve 20 mcM acetosyringone 50 mcg / Kanamisin mL ve 25 mcg / mL Gentamisin, artı 10 mM (MES) ile desteklenmiş bir şişesi için yukarıdaki kültür aktarın. 28 ° C'de 50 rpm hızında bir çalkalayıcı geceleme kültür büyütün.
- Ertesi gün, 5 dakika 4000 rpm'de agro-bakteriyel hücreler aşağı doğru döndürün; 10 mM MgCl 2, 10 mM (MES) ve 200 mcM acetosyringone içeren infiltrasyon tampon kültür yeniden askıya. 1.5 kültürü OD 600 ayarlayın.
- 3 saat boyunca oda sıcaklığında tezgah kültür bırakın.
- Agrobacterial infiltrasyon önce yumruk kotiledonlarında delip olmadan 25 G iğne ile pamuk bitkileri kotiledonlarında alt. Kotiledon her bölümünde (Şekil 2) Bir veya iki delik (doku yumuşaklık bağlıdır) delikli edildi.
- 1:1 oranında RNA2 GrCLA1; el karışımı 1 kullanarak yaralama siteleri aracılığıyla kotiledonlarında alt sızmak: RNA1 ve pYL156 (TRV): RNA2 veya pYL156 (TRV) pYL192 Agrobacterial kültür süspansiyon (TRV) karıştırın ml iğnesiz şırınga (Şekil 3).
- Bitkilerin plastik bir kubbe ile örtün ve loş ışık koşulu altında gece boyunca oda sıcaklığında sızmış bitkiler bırakın.
- Bitkilerin büyüme oda sıcaklığı 23 transfer ° C, 120 μE m -2 S 12 saat 12 saat ışık / karanlık döngüsünü -1 ışık.
Not: bitkiler, 23 ° C veya cam sera (25-28 ° C) ya altında VIGS çalışır. (23 - 25 ° C) sıcaklığın nispeten düşük olduğunda, aşılama için daha kolay ve fenotip ile karşılaştırıldığında daha yüksek (28-30 ° C) ya da dalgalanma sıcaklık üniforma daha fazla. Bir kubbe ile bitkileri kapsayan VIGS daha verimli hale getirir.
- 7 ~ 8 gün infiltrasyon susturma fenotip inceleyin. PYL156 (TRV) tarafından susturuldu bitkilerin gerçek yaprakları: RNA2-GrCLA1 albino fenotip (Şekil 4) görüntülemek için başladı. Agrobacteria taşıma pYL156 (TRV) ile infiltre bitki: RNA2 kontrol olarak hizmet vermektedir.
- Kontrolü ve susturulması pamuk bitkileri izole edilen RNA ile ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) kullanarak endojen genlerin ekspresyon seviyesi inceleyerek gen susturulması verimliliği olun.
Not: TRV geniş bir konak yelpazesine sahiptir ve bildirilmesi gereken bir patojen olarak VIGS-ed bitki karantina koşulları ve bitkilerin altında tutulmalıdır düzgün otoklavlanabilir ve deneyleri sonra imha edilmelidir.
4.Temsilcisi Sonuçlar:
Agrobacterial karışımı ile el-infiltrasyon yaklaşık iki hafta sonra GrCLA1 susturulması kaynaklanan albino fenotip açıkça gerçek yaprakları gözlendi. Susturulması verimliliği 50'den fazla tesisleri ile birden fazla deneylerde hemen hemen% 100 ulaşır. Susturuldu bitkilerin yaprakları yaşlı yapraklar (Şekil 4) yeni bir mozaik ile gelişmekte olan bir düzgün dağıtılmış ve çok güçlü bir albino fenotipi gösterir.
Şekil 1 Agrobacterial infiltrasyon için kullanılan iki tam genişletilmiş kotiledonlarında iki hafta eski aşama hakkında bir pamuk fide.
Şekil 2 Agrobacterial geçişlerini kolaylaştırmak için bir 25 G iğne kullanarak pamuk bitkileri alt kotiledonlarında üzerinde küçük delikler Delme.
Şekil 3 yaralama siteleri aracılığıyla pamuk kotiledonlarında içine Agrobacterial karışımı El infiltrasyon iğnesiz bir şırınga kullanarak
Şekil 4 Albino fenotip pamuk bitkileri susturuldu VIGS çıktı. Dört çeşitlerin gösterilmiştir. A) Fibermax 832 B) Phytogen 480WR C) Phytogen 425RF D) Deltapine 90.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
VIGS, endojen genlerin ifade geçici olarak aşağı vurma işlevsel genomik analiz güçlü bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Bu çalışmada, biz TRV tabanlı bir ikili vektör kullanan bir Agrobacterium VIGS geliştirdi. Pamuk CLA1 (GrCLA1) gen susturma etkinliğini izlemek için görsel bir belirteci olarak geliştirilmiştir. Biz sürekli gen susturulması verimliliği% 100, yaklaşık iki hafta yazılan infiltrasyon başlayarak, test tüm çeşitleri gerçek yaprakları üzerinde görülen albino fenotip gösterdiği elde edilmiştir. Ancak CLA1 sessiz pamuk bitkileri, pek büyük olasılıkla kloroplast gelişimi üzerinde güçlü bir kusurları nedeniyle fiber veya tohum aşamasında içine geliştirdi. Pamuk VIGS başarılı gelişimi, ilgi kaybı fonksiyon testleri genlerin kolayca susturmak için bir alternatif sunuyor ve hızla yaklaşıyor genom sonrası dönemin 8 pamuk fonksiyonel genetik / genomik için bir temel oluşturur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz Dr minnettar. SP Dinesh Kumar ve Yule Liu TRV VIGS vektörler için, Dr. Kenerley Chuck, Terry Wheeler, Jim Starr ve pamuk tohumu sağlayan Bayer CropScience. Bu çalışma PH NSF LS ve NIH tarafından finanse edildi
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Roller drum | Glas-Col | 099A TC108 | Agro-bacterium culture |
| Incubator | Sheldon Manufacturing, Inc. | 01046209 | Agro-bacterium culture |
| UV/Vis spectrophotometer | Beckman Coulter Inc. | Model: DU530 | Measuring OD |
| Gene Pulser | Bio-Rad | Model: 1652076; Serial: 154BR3880 | Electroporation |
| Pulser Controller | Bio-Rad | Model: 1652098; Serial: 232BR4833 | Electroporation |
| Micropulser Electroporation cuvette | Bio-Rad | 165-2081 | Electroporation |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 30962 | Inoculation of agro-bacterium |
| Metro Mix 700 | SUNGR | SKU# 553001 | Growing seedling |
| Terra Cotta pot | T.O.Plastics | GPS 3001B2 | Growing seedling |
| MES monohydrate | USB Corp., Affymetrix | 18886 | Infiltration buffer |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | Infiltration buffer |
References
- Chen, Z. J., Scheffler, B. E., Dennis, E., Triplett, B. A., Zhang, T., Guo, W. Toward sequencing cotton (Gossypium) genomes. Plant Physiol. 145, 1303-1310 (2007).
- Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y. Virus-induced gene silencing. Methods Mol Biol. 236, 287-294 (2003).
- Hamilton, A. J., Baulcombe, D. C. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science. 286, 950-952 (1999).
- Burch-Smith, T. M., Anderson, J. C., Martin, G. B., Dinesh-Kumar, S. P. Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants. Plant J. 39, 734-746 (2004).
- Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P. Virus-induced gene silencing in tomato. Plant J. 31, 777-786 (2002).
- Estevez, J. M., Cantero, A., Romero, C., Kawaide, H., Jimenez, L. F., Kuzuyama, T. Analysis of the expression of CLA1, a gene that encodes the 1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway in Arabidopsis. Plant Physiol. 124, 95-104 (2000).
- Mandel, M. A., Feldmann, K. A., Herrera-Estrella, L., Rocha-Sosa, M., Leon, P. CLA1, a novel gene required for chloroplast development, is highly conserved in evolution. Plant J. 9, 649-658 (1996).
- Gao, X., Wheeler, T., Li, Z., Kenerley, C., He, P., Shan, L. Silencing GhNDR1 and GhMKK2 compromised cotton resistance to Verticillium wilt. Plant J. 66, 293-305 (2011).
