Summary
השיטה מתוארת למדוד סמנים ביוכימיים של הילוד היפוקסיה, איסכמיה. הגישה מנצל גבוהה כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ (HPLC) וגז כרומטוגרפיה ספקטרומטריית מסה (GC / MS).
Abstract
איסכמיה היפוקסיה ילודים מאופיינת זלוף דם לקויה של רקמה או חוסר מערכתית של חמצן. מצב זה הוא חשב לגרום / להחמיר הפרעות בילוד מתועדת היטב כולל ליקוי נוירולוגי 1-3. ירידה בייצור אדנוזין טריפוספט מתרחשת עקב חוסר זרחון חמצוני. כדי לפצות על האנרגיה הזו מולקולות מקופח במדינה המכיל פוספט גבוה באג"ח אנרגיה 2 מושפל. זה מוביל רמות גבוהות של אדנוזין שהוא מושפל לאחר מכן inosine, hypoxanthine, xanthine, ולבסוף חומצת השתן. הסופי שני שלבים בתהליך זה השפלה מבוצעות על ידי oxidoreductase xanthine. אנזים זה קיים בצורה של דהידרוגנז xanthine בתנאים normoxic אבל מומר מונואמין xanthine (XO) תחת היפוקסיה-reperfusion בנסיבות 4, 5. בניגוד דהידרוגנז xanthine, XO מייצר חמצן כתוצר לוואי של purine השפלה 4, 6. זה מי חמצן בשילוב עם אחרים מינים חמצן מגיב (ROS) המיוצר במהלך היפוקסיה, oxidizes חומצת שתן כדי ליצור allantoin ומגיב עם ממברנות שומנים בדם ליצירת malondialdehyde (מד"א) 7-9. רוב היונקים, בני האדם פטור, להחזיק את uricase האנזים, אשר ממיר חומצת שתן כדי allantoin. אצל בני אדם, לעומת זאת, allantoin יכול להיות רק נוצרו על ידי חמצון ROS בתיווך של חומצת השתן. בגלל זה, allantoin נחשב סמן של עקה חמצונית בבני אדם, אך לא יונקים כי יש uricase.
אנו מתארים שיטות העסקת גבוהה כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ (HPLC) גז כרומטוגרפיה ספקטרומטריית מסה (GCMS) כדי למדוד סמנים ביוכימיים של איסכמיה היפוקסיה הילוד. דם האדם משמש עבור רוב הבדיקות. דם בעלי חיים עשוי לשמש גם תוך הכרה פוטנציאל allantoin uricase שנוצר. מטבוליטים purine היו קשורים היפוקסיה מוקדם ככל 1963 ואמינות hypoxanthine, xanthine, וחומצת השתן כאינדיקטורים ביוכימיים של היפוקסיה בילוד היה תוקף על ידי מספר חוקרים 10-13. שיטת HPLC משמש וכימות של תרכובות purine הוא מהיר, אמין לשחזור. השיטה GC / MS המשמש כימות של allantoin, סמן חדש יחסית של סטרס חמצוני, הותאם מ גרובר ואח' 7. שיטה זו מונעת חפצים מסוימים דורש כמויות נמוכות של המדגם. שיטות המשמשות לסינתזה של MMDA תוארו במקום אחר 14, 15. GC / MS כימות מבוסס מד"א הותאם מ Paroni et al. ו Cighetti et al. 16, 17. פעילות מונואמין Xanthine נמדדה על ידי HPLC ידי לכימות ההמרה של pterin כדי isoxanthopterin 18. גישה זו הוכיחה להיות רגיש מספיק לשחזור.
Protocol
1. לדוגמה איסוף ועיבוד
- איסוף דגימת דם בתוך צינור K3E 6ml K3 EDTA אשר נשמר על הקרח.
- בתוך דקות 2 של אוסף, צנטריפוגות מדגם ב 4 ° C ב ז 1500 עבור 10 דקות.
- מעבירים את supernatant (פלזמה) אל צינור microcentrifuge 1.5ml.
- צנטריפוגה ב 4 ° C ב g 18,000 למשך 30 דקות.
- הסר את aliquots supernatant ולהעביר אותם לתוך צינורות microcentrifuge נפרד purine (200μl), allantoin (50μl), מד"א (100μl), וניתוח XO (120μl). היזהר שלא לזהם את דגימות עם כדוריות דם אדומות. ייתכן שיהיה עליך להתאים את הכרכים של פלזמה עבור מד"א, XO, ו purines מבוסס על מהנפח הכולל של פלזמה זמין.
2. הכנת התקן פנימי, 2-Aminopurine (2-AP), עבור purine וניתוח XO
- לשקול את 0.01351g 2-AP ולהוסיף אותו 8ml מים כי כבר acidified עם 2-5 טיפות HCl. אם 2-AP לא המסת אתה צריך להוסיף חומצה יותר. התאמת עוצמת השמע הסופי 10 מ"ל.
- השתמש ספקטרופוטומטר UV-VIS כדי לקבוע את הריכוז האמיתי של המניות שלך 2-AP פתרון. (Λmax 315, ε 4000).
- לאחר ריכוז של המניה 2-AP פתרון נקבע, לחשב את כמויות נדרש להכיל 1x10 -7 mol 2-AP תקן פנימי עבור מדידות purine ו 1x10 -8 mol 2-AP תקן פנימי עבור מדידות XO.
- Aliquot הכרכים מחושב לתוך צינורות microcentrifuge נפרד להתאדות עד יובש SpeedVac.
משוואה 1: 
משוואה 2: 
3. HPLC מדידה של Purines
- העברת פלזמה (200μl) כדי Microcon YM-10 מכשיר מסנן צנטריפוגה צנטריפוגלי ובו 4 ° C ב g 14,000 עבור 1.5 שעות.
- הסר את תסנין והעברת צינור המכיל microcentrifuge 1x10 -7 mol 2-AP. הקפד לרשום את נפח תסנין הוסיף הצינור microcentrifuge המכיל את 2-AP. וורטקס דגימות עבור 10-20 שניות.
- ניתוח דגימות עם HPLC. שלוש זריקות 50 μl משמשים מדגם זה. דוגמאות מוזרקים על Supelcosil LC-18-S, 15 ס"מ X 4.6 מ"מ, 5 מיקרומטר טור מצויד LC-18 S-Supelguard השומר העמודה. התנאים הדרגתי המתואר בטבלה 1 יש להשתמש כדי להשיג הפרדה נאותה שיא: ממס מים, ממס B-מתנול, formate ממס C-50mm אמוניום חיץ, pH 5.5.
| זמן | זרימה (mL / min) | % | % B | ג% | |
| 1 | 1.00 | 0.0 | 0.0 | 100.0 | |
| 2 | 16.00 | 1.00 | 0.0 | 0.0 | 100.0 |
| 3 | 17.00 | 1.00 | 100.0 | 0.0 | 0.0 |
| 4 | 22.00 | 1.00 | 100.0 | 0.0 | 0.0 |
| 5 | 27.00 | 1.00 | 0.0 | 100.0 | 0.0 |
| 6 | 32.00 | 1.00 | 0.0 | 100.0 | 0.0 |
| 7 | 33.00 | 1.00 | 100.0 | 0.0 | 0.0 |
| 8 | 38.00 | 1.00 | 100.0 | 0.0 | 0.0 |
| 9 | 39.00 | 1.00 | 0.0 | 0.0 | 100.0 |
| 10 | 45.00 | 1.00 | 0.0 | 0.0 | 100.0 |
טבלה 1. שינויים מרכך למדידה HPLC של תרכובות purine.
- קבע את הריכוז של purines במדגם. לכמת hypoxanthine, xanthine, וחומצת השתן ידי השגת שטחים לשיא של החזקת ואת אורכי הגל המתואר בטבלה 2. קבע את אזור השיא של 2-AP. קבע את יחס שטח של hypoxanthine, xanthine, וחומצת השתן אל 2-AP להמיר את יחסי לריכוזים μmolar באמצעות עקומות סטנדרטיות.
| זמן השמירה * | נצפה λ max * | מדווחים λ max 19 | מדווחים ε max 19 | |
| של שתןחומצה | ~ 3.5 דקות | 288 | 283 [2] | 11,500 [2] |
| Hypoxanthine | ~ 7.0 דקות | 248 | 248 [1] | 10,800 [1] |
| Xanthine | ~ 9.5 דקות | 267 | 267 [2] | 10,200 [2] |
| 2-Aminopurine | ~ 12.5 דקות | 305 | 314 [2] | 4000 [2] |
טבלה 2. פעמים השמירה טיפוסיים λ max עבור purines תקן פנימי. * נקבע על HPLC באמצעות formate isocratic 50mm אמוניום חיץ (pH 5.5) עם קצב הזרימה של 1mL/min. pH הוא [].
- כל ניתוח דגימות בשלושה עותקים, אלא רק לכלול ערכים עבור ניתוחים מאוחר יותר אם מקדם השונות הוא פחות מ -10%.
4. GC / MS מדידה של Allantoin
- הוסף 50μl 10μM DL-Allantoin-5-13 C: 1-15 N (פנימי סטנדרטי) כדי פלזמה 50 μl להפריש עבור assay allantoin במהלך איסוף דגימה ועיבוד.
- הוסף 100 μl אצטוניטריל לפתרון זה פלזמה.
- וורטקס התערובת במשך 10-20 שניות ואז צנטריפוגות ב 4 ° C ב g 20,000 עבור 10 דקות.
- הסר את supernatant, למקם אותו בקבוקון GC / MS ויבש תחת N 2.
- לאחר ייבוש, הוסף 50 μl של derivatizing סוכן N-טרט-Butyldimethylsilyl-N-methyltrifluoroacetamide (MTBSTFA) ב פירידין (1:1 כרך / כרך), כובע צלוחיות דגירה אותם 50 מעלות צלזיוס למשך 2 ח Derivatization זה מניב לכימות באופן עקבי מ / z הפסגות של 398.0 ו 400.0 עבור allantoin ו DL-allantoin-5-13 C: 1-15 N, 20 בהתאמה.
- ניתוח דגימות על Agilent Technologies ו-MS-GC 6890N 5973 מצויד סמפלר אוטומטי. ביצוע הפרדה על מתחם Agilent 122-5532G טור נימי (25.7m אורך, קוטר פנימי 0.25mm). השתמש בהליום כגז המוביל בקצב הזרימה של 1.5 mL / min. הזרק מוצר derivatized (1 μl) במצב הפיצול (פיצול יחס 20:01, תזרים לפצל 29.4 מ"ל / דק, זרימה מוחלטת 33.8 mL / min). הגדר את הטמפרטורה ההתחלתית טור ב 100 ° C ו להכיל באותה טמפרטורה עבור 2 דקות לפני הגדלת אותו 180 מעלות בקצב של 10 ° C / min. החזק את הטמפרטורה 4 דקות ואחר כך להגדיל אותו עד 260 מעלות צלזיוס בשיעור של 20 ° C / min. שמרו על טמפרטורה זו עד סוף הריצה. לאחר כל דגימה, לנקות את הטור עם 2 זריקות של הקסאן.
- לכמת allantoin שימוש במצב לבחור ניטור יון תוך ניטור 398.0 מ '/ z יון עבור allantoin ואת 400.0 מ' / z יון של DL-allantoin-5-13 C: 1-15 נ המר יחסי שפע של יון allantoin / (allantoin כבד) לריכוזים של מיקרו allantoin באמצעות עקומת סטנדרט מוכן.
- כל הדגימות מנותחות בשלושה עותקים, אלא רק עם מקדם ערכים של וריאציה של פחות מ -10% משמשים ניתוחים נוספים.
5. הכנת התקן פנימי, מתיל Malondialdehyde (MMDA), לניתוח מד"א
- הוסף 523μl 3-ethoxymethacrolein כדי 1477μl 7m NaOH בתוך בקבוקון עגול 100 מ"ל התחתונה. הוספת stirbar.
- מניחים את הבקבוק בתוך אמבט מים ב 45 ° C ומערבבים עד התגובה הלכה סיום. זה אמור לקחת בערך 140 דקות. מעקב אחר ההתקדמות של התגובה על ידי הסרת aliquot 10μl הנוזל מעת לעת במרווחים 10 דקות. לדלל כל המדגם נאספו בפקטור של 10 5 באמצעות 50 mM אשלגן זרחתי חיץ (pH 7) ומדידת ספיגת עם UV-VIS. לאחר ספיגת ב 275nm מגיע בערך 0.658 תגובה תושלם. כתגובה מתקדמת, פתרון יפנה צהוב כתום אז.
- אפשר התגובה התקדמות 15 דקות נוספות.
- הוסף 5 מ"ל מים מזוקקים כדי deionized בקבוק התחתונה סביב העברת הפתרון משפך separatory. השתמש מ"ל נוספים 3 מים כדי לשטוף את תכולת הבקבוק לתוך המשפך. הוסף 2ml נוספת של מים המשפך.
- חלץ את פתרון 3 פעמים עם dichloromethane 5 מ"ל. לאחר מיצוי כל להשליך את השכבה האורגנית.
- לאחר החילוץ השלישי, להעביר את השכבה המימית על בקבוק תחתית עגולה rotovap עד יובש.
- Resuspend את המוצר אתנול 3ml והעברת צינור טרום שקל חרוטי 15 מ"ל. יש לשטוף את הבקבוק עם אתנול 2ml נוספות ולהוסיף את לשטוף את צינור חרוטי.
- הוסף בנזין 5 מ"ל ו דגירה הצינור במים חמים עד מוצר נמס מיד לאחר מכן במקום צינור על קרח למשך 10 דקות. צנטריפוגה זה 5 דקות ב g 15,000 ולהסיר את supernatant.
- הוסף 5 מ"ל אתנול ו 5 מ"ל אתר איזופרופיל כדי precipitant. ממיסים את נמהר על ידי דוגרים הצינור במים חמים הטיית מעת לעת את הצינור בעדינות רבה. לאחר לזרז נמס, במקום צינור על הקרח במשך 10 דקות. ביצוע זה recrystallization פי 2 עם אתנול אתר איזופרופילי. נתחי חלק לבן מסיס של המוצר עשוי להיווצר.
- לאחר השלב האחרון recrystallization להסיר כמו supernatant הרבה כתוצר אפשרי יבש וכתוצאה מכך Speedvac. לשקול את צינור חרוטי עם המוצר מסונתז.
- הוסף 5 מ"ל מים אל המערבולת צינור, ולסנן כל מוצקים שנותרו.
- השתמש ספקטרופוטומטר UV-VIS כדי לקבוע את הריכוז הסופי של MMDA. Λmax עבור MMDA ב 50 חיץ פוספט אשלגן מ"מ (pH 7) הוא 274 ננומטר עם מקדם הכחדה של 29,900 M -1 cm -1 14.
6. GC / MS מדידה של מד"א
- הכן פתרון של 0.5mm טולואן הידרוקסיל butylated (BTH) באתנול על ידי הוספת 0.11 גרם BTH אתנול 9ml והתאמת נפח סופי 10 מ"ל. ואז לבצע דילול ידי הוספת 10μl של פתרון זה מרוכזים כדי אתנול 990μl.
- הכן פתרון של הידרזין פניל 50mm ידי הוספת 4.92μl של הידרזין פניל כדי 995μl מים בצינור microcentrifuge כהה. הפתרון וורטקס.
- הוסף 5μl 10μM MMDA אל הפלזמה 100μl להפריש עבור assay מד"א במהלך איסוף דגימה ועיבוד.
- ואז להוסיף BTH 0.5mm 10μl לתערובת MMDA / פלזמה ואחריו תוספת של סודיום ציטרט 200μl 1M ב-pH 4. PH זה הוא קריטי עבור derivatization נכונה של המדגם. PH גבוה או נמוך תגרום מוטה רמות מד"א.
- לדלל את התערובת הסופית על ידי הוספת מים מזוקקים deionized לנפח הסופי של 480μl.
- Derivatize את הפתרון על ידי הוספת פניל 20μl הידרזין 50mm, מכסת צלוחיות דוגרים הפתרון של 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות על שייקר מסלולית.
- הוסף 1ml של הקסאן, מערבולת של 1 דקות ו צנטריפוגות בסל"ד 3000 עבור 10 דקות.
- מעבירים את השכבה האורגנית בקבוקון GC / MS ולהתרכז הפתרון 100μl על ידי זרם N 2.
- ניתוח דגימות על GC / MS באמצעות דוגם אוטומטי. ביצוע הפרדה על מתחם Agilent 122-5532G טור נימי (25.7 מ 'אורך, 0.25 מ"מ קוטר פנימי). השתמש בהליום כגז המוביל בקצב הזרימה של 0.6-0.8 מ"ל / דקה. הזרק מוצר derivatized (2 μl) במצב הפיצול (פיצול יחס 20:01, תזרים לפצל 23.0 מ"ל / דק, זרימה מוחלטת 27.1 mL / min). הגדר את הטמפרטורה ההתחלתית טור ב 110 ° C ו להכיל באותה טמפרטורה דקות 1 לפני הגדלת אותו 250 ° C בשיעור של 40 ° C / min. שמרו על טמפרטורה זו עד סוף הריצה. לאחר כל דגימה, לנקות את הטור עם 2 זריקות של הקסאן.
- לכמת מד"א לבחור להשתמש יון ניטור מצב משתמש 144.00 מ '/ z עבור מד"א לבין 158.00 מ' / z עבור MMDA. המרת מד"א / MMDA יחסי יון שפע לריכוזים מיקרו באמצעות עקומת סטנדרטי.
- ניתוח דגימות בשלושה עותקים ורק להשתמש בערכים עם מקדם של וריאציה של פחות מ -10%.
7. HPLC מדידה של מונואמין Xanthine
- זיהוי של פונקציה מונואמין xanthine תלויה ביכולת וברגישות למדוד את רמות של מצע מתאים (pterin), כמו גם את המוצר שלה (isoxanthopterin). פלזמה היא מודגרות עם המצע או דקות 0 (שליטה) או 4 שעות, ואת המצע הדגירה תלוי המרה מוצר נקבע.
- הוסף 240μl 0.2 M טריס-HCl חיץ (pH 9.0) ו 4.63μl 7.083x10 -3 M pterin על צינור אחד (0 ו 4H) ו preincubate אותם על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- ליזום את התגובה על ידי הוספת אנזים 60μl של פלזמה על צינור אחד.
- מיד להוסיף 300μl 4% HClO 4 לצינור הבקרה (0 דקות) אך לאפשר את התערובת אחרים כדי לדגור במשך 4 שעות לפני מרווה את התגובה עם 4% 300μl HClO 4.
- לאחר תוספת של HClO 4, במרץ לנער את הצינור, ואז צנטריפוגות ב 4 ° C ב g 15,000 עבור 15 דקות.
- הסר 500μl של supernatant ולנטרל ידי הוספת 20μl של 5M K 2 CO 3. בתוקף ללחוץ את הצינור, ואז צנטריפוגות ב 4 ° C ב g 15,000 עבור 15 דקות.
- הוסף 350μl הפתרון לנטרל את שפופרת המכילה microcentrifuge 1x10 -8 mol 2-AP.
- ניתוח דגימות על HPLC מצוידים גלאי הקרינה סריקה. שלוש זריקות 50 μl משמשים מדגם זה. דוגמאות יהיה מוזרק על Wacosil 5C-18-200 250 מ"מ x 6.0 טור 5 מ"מ, מיקרומטר מצויד שומר Supelguard LC-18-S טור. התנאים isocratic הבאים יש להשתמש כדי להשיג הפרדה שיא זיהוי נאותים: 95% 20mm KPO 4 חיץ (pH 2.2), מתנול 5% ב 1ml/min שיעור הזרימה. קבע את אורך הגל עירור עבור גלאי הקרינה ב 345 ננומטר גל הפליטהאורך ב 410 ננומטר.
- קבע את יחס pterine ו isoxanthopterine ל 2-AP ידי השגת שטחים שיא הספקטרום גלאי פלואורסצנטי. השיא הראשון של הספקטרום, ~ 5 דקות, מתאים 2-AP. השיא השני בגודלו יהיה pterine. Isoxanthopterine שיא elutes האחרון.
- השג את ההבדל בתחום יחסי isoxanthopterine/2-AP שיא בין 0 לבין 4 שעות זמן הדגירה נקודות. השתמש בערך זה כדי לחשב את פעילות ה-XO של עקומות סטנדרטיות.
- ניתוח דגימות triplicates אלא להשתמש בערכים רק עם מקדם של וריאציה של פחות מ -10%.
8. נציג תוצאות:
דוגמה כימות HPLC של תרכובות purine מוצג באיור 1 א. פעמים השמירה ספציפיים אורכי גל הפליטה של hypoxanthine, xanthine, וחומצת השתן לאפשר כימות סימולטני של תרכובות purine (טבלה 2). כאשר assay מנוהלת כראוי, תרכובות תהיה הפרדה נאותה את הצורה השיא יהיה חד unimodal. פסגות אלה מומרות לתוך ריכוזי, הטווחים המוצגים בטבלה 3, באמצעות עקומות סטנדרטיות. בגלל עיבוד המדגם עבור assay זה היא מינימלית, הבעיות רק מדגם מבוסס שתתגלה תהיה lysing של כדוריות דם אדומות. אם בתאי הדם האדומים lyse לפני דוגמאות centrifuged, פלזמה ייקח על צבע כתום / אדום אינו יכול לשמש להערכת איסכמיה hypoxic. סוגיות נוספות אשר עשויות להתעורר כאשר מודדים purines מערבת את מערכת HPLC והעמודה (איור 1B). אם יש בועות אוויר במערכת HPLC פעמים החזקת יעבור והלחץ HPLC תשתנה באופן דרמטי. אם מחסנית השומר צריך להיות שונה, הלחץ יגדל הפסגות תרחיב ולהיות דו או תלת מודאלי.
| Hypoxanthine (מיקרומטר) | Xanthine (מיקרומטר) | חומצת השתן (מיקרומטר) | מונואמין Xanthine ((מוצר nmol) / min) | Malondialdehyde (מיקרומטר) | Allantoin (מיקרומטר) | |
| טווח Normoxic | 1.13-19.3 (64) | 0.02-3.69 (61) | 107.20-726.12 (63) | 2.47x10 -6 - 3.92x10 -3 (20) | 0.44-3.76 (53) | NA |
| מצוקה נשימתית לזמן | 1.78-12.59 (27) | 0.07-11.8 (24) | 225.40-653.32 (27) | 0 - 1.03x10 -5 (8) | 0.82-2.73 (24) | NA |
| טווח hypoxic | 0.38-31.80 (13) | 0.11-2.88 (13) | 235.65-1348.13 (13) | 1.20x10 -5 -236.44 (9) | 0.95-2.15 (7) | NA |
| מוקדמת Normoxic | 1.54-4.39 (9) | 0.03-1.77 (9) | 178.92-593.49 (9) | 2.46x10 -5 - 5.44x10 -4 (2) | 0.95-2.74 (8) | 2.30-5.26 (67) |
| מצוקה נשימתית מוקדמת | 3.04-8.04 (2) | NA | 327.56-365.11 (2) | NA | 2.40-3.46 (3) | NA |
Min-Max (n)
לוח 3. טווחי נציג עבור purines, מונואמין xanthine, malondialdehyde ו allantoin.
דוגמה כימות GC / MS של Allantoin מוצג באיור 2. בגלל המסה של allantoin derivitized ו allantoin כבד derivitized ידוע, בחר במצב יון יכול לשמש כדי לזהות תרכובות אלו על המפרט את המסה. אם assay הוא נעשה בצורה נכונה, שתי פסגות יקויימו בזמן השמירה זהה. אחת המתאימה allantoin (398.00 מ '/ z) והשני allantoin כבד (400.00 מ' / z). פסגות אלה מומרות לתוך ריכוזי, הטווחים המוצגים בטבלה 3, באמצעות עקומת סטנדרט. אם assay מנוהלת באופן שגוי, דגימות לא היו derivitized כראוי, פסגות לא יכול להיות נוכח או לא להיות נציג כמותית. שוב, אם את כדוריות הדם האדומות lysed הפלזמה לא ניתן להשתמש כדי להעריך סטרס חמצוני של איסכמיה hypoxic הילוד.
התוצאות עבור כימות של מד"א דומים לאלה של allantoin למעט כי שתי פסגות הם נצפו לעתים שימור שונות. ב ~ 3.5 דקות זמן השמירה, 144.00 מ '/ z השיא של מד"א ובזמן ~ 4 דקות שמירה, 158.00 מ' / z השיא MMDA הוא ציין (איור 3). פסגות אלה מומרות לתוך ריכוזי, הטווחים המוצגים בטבלה 3, באמצעות עקומת סטנדרט. אם assay מנוהלת בצורה לא נכונה, או דוגמאות לא derivitized כראוי, פסגות לא אפשר לראות בבחירת עבור 144.00m / z ו 158.00m / z. יצוין כיאם יש עודף של שומנים בפלסמה של האכלות בולוס אוראלי או תוך ורידי הממשל שומנים בדם, בפלסמה ייקח על מראה חלבי ולא ניתן להשתמש בהם כדי להעריך סטרס חמצוני של איסכמיה hypoxic הילוד.
דוגמה כימות HPLC מבוססי הפונקציה מונואמין xanthine מוצג באיור 4. אם assay מנוהלת כראוי, שלוש פסגות יש לשים לב עם גלאי פלורסנט, אחת pterin, אחד isoxanthopterin, ואחד עבור 2-AP. פסגות אלה מומרות לתוך ריכוזי, הטווחים המוצגים בטבלה 3, באמצעות עקומת סטנדרט. צריך להיות גם שיא המתאים isoxanthopterin ו 2-AP בספקטרום שנוצר גלאי ה-PDA. אם פעילות האנזים הוא נעדר, שיא המקביל isoxanthopterin לא יראו. בגלל זה assay מודד תפקוד האנזים, הקפאת חוזרות הפשרת מדגם עשוי לשנות את זה.
באיור 1. HPLC ספקטרום לזיהוי תרכובות purine. A). אם נציג תוצאות assay היה לפעול כראוי. B). תוצאות נציג אם יש בעיה עם HPLC, העמודה או שומר מחסנית.
איור 2. GC / MS ספקטרום עבור כימות של Allantoin. לשיא של 398.00 מ 'יון / z המתאים allantoin. לשיא של 400.00 יון z m / מתאים allantoin כבד.
איור 3. GC / MS ספקטרום עבור כימות של מד"א. לשיא של 144.00 יון z m / מתאים מד"א. לשיא של 158.00 יון z m / מתאים MMDA.
איור 4. ספקטרום HPLC למדידת פעילות XO.) נציג תוצאות עבור זמן הדגירה 0 דקות ו - ב ') תוצאות נציג בפעם הדגירה 4 שעה. הערה השיא isoxanthopterine גבוה יותר (ב 17 דקות ~) בפעם הדגירה 4 שעה. בספקטרום הקרינה, 2-AP elutes הראשון ~ elutes 5min ו pterine הבאה ב ~ 10min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטות שתוארו כאן היתר הערכה של איסכמיה היפוקסיה הילוד. פרוטוקול זה משלב מדידות של סמנים של קיפוח (ATP) באנרגיה, סטרס חמצוני, נזק חמצוני, ופעילות האנזים לקבל תמונה ביוכימיים הכוללת של נוכחות או אפילו את מידת איסכמיה hypoxic. למרות התועלת של שיטה זו, קיימות מגבלות פוטנציאליים. ראשית, זה לוקח בערך 1-2 מ"ל של דם כדי לאסוף פלזמה מספיק כדי להפעיל את כל מבחני. זו לא תהיה בעיה של מבוגרים או ילדים, אבל זה הופך להיות עניין בעבודה עם תינוקות, במיוחד אלה מוקדמת. אנו לעקוף בעיה זו על ידי מתן עדיפות מבחני דילול כמה דוגמאות במידת הצורך שנית, זה יכול להיות קשה לסנתז MMDA:. לעומת זאת, deuterated מד"א יכול לשמש כתחליף MMDA כסטנדרט פנימי.
למרות המגבלות הללו, השיטות שתוארו לספק כלי יעיל להערכת איסכמיה היפוקסיה הילוד כמו גם הפרעות אחרות הקשורות הומאוסטזיס חמזור מאוזן. יתר על כן, כל סמנים אלה, למעט XO, ניתן למדוד בשתן, מתן פולשני אמצעי ניטור בילודים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו ממומנת על ידי המכונים הלאומיים לבריאות NR011209 R01-03
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6ml K3E EDTA K3 tube | Fisher Scientific | 2204061 | |
| 5702R centrifuge | Fisher Scientific | 05413319 | With 13&16MM adaptor |
| 1.5ml microcentrifuge tube | USA Scientific, Inc. | 1615-5599 | |
| 2-Aminopurine | Sigma-Aldrich | A3509 | |
| Varian Cary 100 spectrophotometer | Agilent Technologies | 0010071500 | |
| Savant SpeedVac | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SC210A-115 | |
| Micron centrifugal filter device | Fisher Scientific | UFC501596 | |
| Supelcosil LC-18-S Column | Sigma-Aldrich | 58931 | |
| Supelcosil LC-18-S Supelguard cartridge and holder | Sigma-Aldrich | 59629 | |
| HPLC | Waters | ||
| GCMS Vial | Fisher Scientific | 03376607 | |
| DL-Allantoin-5-13C;1-15N | CDN Isotopes | M-2307 | Lot #L340P9 |
| MTBSTFA | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 48920 | |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | |
| 5973E GC/MSD | Agilent Technologies | G7021A | Part # for 5975E GC/MS |
| 3-Ethoxymethacrolein | Sigma-Aldrich | 232548 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Benzene | Sigma-Aldrich | 401765 | |
| Diisopropyl ether | Sigma-Aldrich | 38270 | |
| BHT | Sigma-Aldrich | B1378 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Phenylhydrazine | Sigma-Aldrich | P26252 |
References
- Harkness, R. A., Whitelaw, A. G., Simmonds, R. J. Intrapartum hypoxia: the association between neurological assessment of damage and abnormal excretion of ATP metabolites. J Clin Pathol. 35, 999-1007 (1982).
- Shalak, L., Perlman, J. M. Hypoxic-ischemic brain injury in the term infant-current concepts. Early Hum Dev. 80, 125-141 (2004).
- Webster, W. S., Abela, D.
- Engerson, T. D., McKelvey, T. G., Rhyne, D. B., Boggio, E. B., Snyder, S. J., Jones, H. P. Conversion of xanthine dehydrogenase to oxidase in ischemic rat tissues. J Clin Invest. 79, 1564-1570 (1987).
- Choi, E. Y., Stockert, A. L., Leimkuhler, S., Hille, R. Studies on the mechanism of action of xanthine oxidase. J Inorg Biochem. 98, 841-848 (2004).
- Godber, B. L., Schwarz, G., Mendel, R. R., Lowe, D. J., Bray, R. C., Eisenthal, R. Molecular characterization of human xanthine oxidoreductase: the enzyme is grossly deficient in molybdenum and substantially deficient in iron-sulphur centres. Biochem J. 388, 501-508 (2005).
- Gruber, J., Tang, S. Y., Jenner, A. M., Mudway, I., Blomberg, A., Behndig, A. Allantoin in human plasma, serum, and nasal-lining fluids as a biomarker of oxidative stress: avoiding artifacts and establishing real in vivo concentrations. Antioxid Redox Signal. 11, 1767-1776 (2009).
- Zitnanova, I., Korytar, P., Aruoma, O. I., Sustrova, M., Garaiova, I., Muchova, J. Uric acid and allantoin levels in Down syndrome: antioxidant and oxidative stress mechanisms? Clin Chim Acta. 341, 139-146 (2004).
- Siciarz, A., Weinberger, B., Witz, G., Hiatt, M., Hegyi, T. Urinary thiobarbituric acid-reacting substances as potential biomarkers of intrauterine hypoxia. Arch Pediatr Adolesc Med. 155, 718-722 (2001).
- Buonocore, G., Perrone, S., Longini, M., Terzuoli, L., Bracci, R. Total hydroperoxide and advanced oxidation protein products in preterm hypoxic babies. Pediatr Res. 47, 221-224 (2000).
- Berne, R. M. Cardiac nucleotides in hypoxia: possible role in regulation of coronary blood flow. Am J Physiol. 204, 317-322 (1963).
- Harkness, R. A., Lund, R. J. Cerebrospinal fluid concentrations of hypoxanthine, xanthine, uridine and inosine: high concentrations of the ATP metabolite, hypoxanthine, after hypoxia. J Clin Pathol. 36, 1-8 (1983).
- Plank, M. S., Boskovic, D. S., Sowers, L. C., Angeles, D. M.
- Cighetti, G., Allevi, P., Anastasia, L., Bortone, L., Paroni, R. Use of methyl malondialdehyde as an internal standard for malondialdehyde detection: validation by isotope-dilution gas chromatography-mass spectrometry. Clin Chem. 48, 2266-2269 (2002).
- Paroni, R., Fermo, I., Cighetti, G. Validation of methyl malondialdehyde as internal standard for malondialdehyde detection by capillary electrophoresis. Anal Biochem. 307, 92-98 (2002).
- Cighetti, G., Debiasi, S., Ciuffreda, P., Allevi, P. Beta-ethoxyacrolein contamination increases malondialdehyde inhibition of milk xanthine oxidase activity. Free Radic Biol Med. 25, 818-825 (1998).
- Cighetti, G., Debiasi, S., Paroni, R., Allevi, P. Free and total malondialdehyde assessment in biological matrices by gas chromatography-mass spectrometry: what is needed for an accurate detection. Anal Biochem. 266, 222-229 (1999).
- Yamamoto, T., Moriwaki, Y., Takahashi, S., Tsutsumi, Z., Yamakita, J., Nasako, Y. Determination of human plasma xanthine oxidase activity by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr B Biomed Appl. 681, 395-400 (1996).
- Handbook of Biochemistry and Molecular Biology. Fasman, G. , 3 ed, CRC Press. Boca Raton. (1988).
- Chen, X. B., Calder, A. G., Prasitkusol, P., Kyle, D. J., Jayasuriya, M. C. Determination of 15N isotopic enrichment and concentrations of allantoin and uric acid in urine by gas chromatography/mass spectrometry. J Mass Spectrom. 33, 130-137 (1998).
