Summary
방법은 hypoxia - 국소 빈혈 신생아의 생화 학적 마커를 측정하는 설명되어 있습니다. 접근 방식은 고압 액체 크로마 토그래피 (HPLC)와 가스 크로마 토그래피 질량 분석계 (GC / MS)를 사용합니다.
Abstract
신생아 hypoxia의 국소 빈혈은 조직의 불충 분한 혈액 관류 또는 산소의 체계 부족이 특징입니다. 이 조건은 원인 / 1-3 신경 장해를 포함하여 잘 문서화 신생아 장애를 증명했다 생각합니다. 아데노신 삼인산 감소 생산 산화 인산화 부족으로 인해 발생합니다. 고에너지 인산 채권을 포함하는 에너지 박탈 상태 분자 무마하기 위해 저하 이아르. 이것은 마침내 요산을, hypoxanthine, 크산텐을 이노신하기 위해 이후 타락 아데노신의 증가 수준에 이르게한다. 이 열화 과정의 마지막 두 단계는 크산텐의 산화 환원 효소에 의해 수행됩니다. 이 효소는 normoxic 조건 크산텐 탈수소 효소의 형태로 존재하지만 hypoxia - reperfusion 상황 4, 5 이하 크산텐 산화 효소 (XO)로 변환됩니다. 크산텐 탈수소 효소와는 달리, XO는 purine 저하 4, 6의 부산물로 과산화수소를 생성합니다. hypoxia 동안 생산 다른 반응 산소 종 (ROS)와 함께이 과산화수소가 알란토인을 형성 요산을 산화하고 malondialdehyde (MDA) 7-9을 생성하는 지질 세포막과 반응. 대부분의 포유류는 인간 면제, 어떤 효소 uricase을 가지고 알란토인에 요산을 변환합니다. 인간 그러나, 알란토인은 요산의 ROS - 매개 산화에 의해 형성 수 있습니다. 이 때문에, 알란토인은 uricase을 가진 포유류에없는 인간의 산화 스트레스 마커로 간주하지만,이다.
우리는 신생아 hypoxia의 국소 빈혈의 생화 학적 마커를 측정하는 고압 액체 크로마 토그래피 (HPLC), 가스 크로마 토그래피 질량 분석계 (GCMS)를 고용하는 방법을 설명합니다. 인간의 혈액은 대부분의 테스트에 사용됩니다. uricase 생성 알란토인의 가능성을 인식하면서 동물의 혈액도 사용할 수 있습니다. Purine의 metabolites는 1963 빠르면 hypoxia와 hypoxanthine, 크산텐의 신뢰성에 연결되었고, 신생아 hypoxia의 생화 학적 지표로서 요산이 여러 조사에 의해 10-13 확인되었습니다. purine 화합물의 부량 사용 HPLC 방법은 빠르고 안정적이고 재현할 수 있습니다. 알란토인, 산화 스트레스의 새로운 마커의 부량 사용되는 GC / MS 방법, 지시 사항 외 7 적응했다. 이 방법은 특정 아티팩트를 방지하고 샘플의 낮은 볼륨을 필요로합니다. MMDA의 합성에 사용되는 방법은, 다른 14 15 설명했다. MDA의 GC / MS 기반 부량는 Paroni 외에서 적응했다. 그리고 Cighetti 외. 16, 17. 크산텐 산화 효소 활동이 isoxanthopterin 18 pterin의 전환 quantifying하여 HPLC로 측정되었다. 이러한 접근 방식은 충분히 민감하고 재현할 수이었다.
Protocol
1. 샘플 수집 및 처리
- 얼음에 보관 6ml K3E EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) K3 튜브에 혈액 샘플을 수집합니다.
- 컬렉션 2 분 이내, 4에서 샘플을 원심 ° C, 10 분 1천5백g에서.
- 1.5ml microcentrifuge 관에 뜨는 (플라즈마)를 전송합니다.
- 30 분 18,000그램 4 ° C에서 원심 분리기.
- 뜨는 aliquots를 제거하고 purine (200μl), 알란토인 (50μl), MDA (100μl), 그리고 XO (120μl) 분석을위한 별도의 microcentrifuge 튜브로 그들을 전송합니다. 적혈구와 함께 샘플을 오염하지 않도록주의하십시오. 사용 가능한 플라즈마의 전체 부피에 따라 MDA, XO 및 purines에 대한 플라즈마의 볼륨을 조정해야 할 수도 있습니다.
2. Purine 및 XO 분석, 내부 표준, 2 Aminopurine (2 - AP) 준비
- 0.01351g 2 AP를 무게와 HCL 2-5 방울과 산성되었습니다 물 8ml에 추가합니다. 2 - AP가 해소되지 않을 경우 더 많은 마약을 추가해야합니다. 10ml에 마지막으로 볼륨을 조정합니다.
- 당신의 주식 2 - AP 솔루션의 진정한 농도를 결정하는 UV - 비스 분광 광도계를 사용합니다. (λmax 315, ε 4000).
- 일단 주식의 농도가 2 - AP 솔루션 결정, 1x10 -7 몰 2 - AP purine 측정을위한 내부 표준 및 1x10 -8 몰 2 - AP XO 측정 내부 표준을 포함하는 데 필요한 볼륨을 계산합니다.
- 별도의 microcentrifuge 튜브로 나누어지는 계산 볼륨과 SpeedVac에 건조하기 위해 증발.
수식 1 : 
수식 2 : 
3. Purines의 HPLC 측정
- 1.5 시간 1만4천그램에서 Microcon YM - 10 4 원심 필터 장치 및 원심 분리기는 ° C로 전송 플라즈마 (200μl).
- 여과액를 제거하고 1x10 -7 몰 2 - AP를 포함하는 microcentrifuge 관에 전송할 수 있습니다. 2 - AP를 포함하는 microcentrifuge 관에 추가 여과물의 볼륨을 기록해야합니다. 10-20 초에 대한 소용돌이 샘플을.
- HPLC와 함께 샘플을 분석할 수 있습니다. 세 50 μl 주사는 각 샘플에 사용됩니다. 샘플 Supelcosil LC - 18 - S에 주입되며, 15cm는 X 4.6 mm, 5 μm의 칼럼 Supelguard LC - 18 - S 칼럼 가드가 장착되어. 솔벤트 - 물, 용매 B - 메탄올, 솔벤트 C - 50mM 암모늄 편대 버퍼, pH를 5.5 : 표 1에서 설명한 기울기 조건 적절한 피크 분리를 얻는 데 사용해야합니다.
| 시간 | 흐름 (ML / 분) | % | %의 B | %의 C | |
| 1 | 1.00 | 0.0 | 0.0 | 100.0 | |
| 2 | 16.00 | 1.00 | 0.0 | 0.0 | 100.0 |
| 3 | 17.00 | 1.00 | 100.0 | 0.0 | 0.0 |
| 4 | 22.00 | 1.00 | 100.0 | 0.0 | 0.0 |
| 5 | 27.00 | 1.00 | 0.0 | 100.0 | 0.0 |
| 6 | 32.00 | 1.00 | 0.0 | 100.0 | 0.0 |
| 7 | 33.00 | 1.00 | 100.0 | 0.0 | 0.0 |
| 8 | 38.00 | 1.00 | 100.0 | 0.0 | 0.0 |
| 9 | 39.00 | 1.00 | 0.0 | 0.0 | 100.0 |
| 10 | 45.00 | 1.00 | 0.0 | 0.0 | 100.0 |
purine 화합물의 HPLC 측정 표 1. 용매 변경됩니다.
- 예제에서 purines의 농도를 결정합니다. 유지 및 2. 2 - AP의 최대 영역을 결정 테이블에서 설명하는 파장의 피크 영역을 얻어 hypoxanthine, 크산텐 및 요산을 수량. 2 - AP에 지역 hypoxanthine, 크산텐의 비율, 그리고 요산을 파악하고 표준 곡선을 사용하여 μmolar 농도에 대한 비율을 변환합니다.
| 유지 시간 * | 관찰된 λ 최대 * | λ 최대 19 신고된 | ε 최대 19 신고된 | |
| 오줌의산 | ~ 3.5 분 | 288 | 283 [2] | 11500 [2] |
| Hypoxanthine | ~ 7.0 분 | 248 | 248 [1] | 10800 [1] |
| 크산텐 | ~ 9.5 분 | 267 | 267 [2] | 10200 [2] |
| 2 Aminopurine | ~ 12.5 분 | 305 | 314 [2] | 4000 [2] |
표 2. purines 및 내부 표준에 대한 일반적인 유지 시간과 λ 최대. * 1mL/min의 흐름 속도 isocratic 50mM 암모늄 편대 버퍼 (산도 5.5)을 사용하여 HPLC 결정. 산도는 []입니다.
- 세중의 모든 샘플을 분석하지만, 변화의 계수가 10 % 미만 경우에만 나중에 분석을위한 값을 포함합니다.
4. 알란토인의 GC / MS 측정
- 추가 50μl 10μM DL - 알란토인 - 5-13 C, 1 - 샘플 수집 및 처리하는 동안 알란토인 분석을 위해 정해 50 μl 플라즈마 15 N (내부 기준).
- 이 플라즈마 솔루션을 100 μl acetonitrile을 추가합니다.
- 소용돌이 혼합물은 10-20을위한 초 다음 ° C 20,000g 10 분 4 원심 분리기.
- 뜨는을 제거, GC / MS 병을에 장소와 N 2 이하 건조.
- 건조 후, 에이전트 피리딘의 N - tert - Butyldimethylsilyl - N - methyltrifluoroacetamide (MTBSTFA) (1:1 권 / 권), 캡 튜브를 derivatizing 50 μl를 추가하고 50 그들을 품어 ° C를 두 H.위한 - 15 N, 각각 20 1;이 derivatization는 알란토인과 DL - 알란토인 - 5-13 C 위해 398.0 및 400.0의 지속 같지는 M / Z 봉우리를 산출.
- 애질런트 테크놀로지 GC 6890N와 MS 5973에 대한 분석 샘플 자동 시료 채취기를 갖춘. 애질런트 122 - 5532G 모세관 컬럼 (25.7m 길이 0.25mm 내경)에 화합물 분리를 수행합니다. 1.5 ML / 분 유량에 캐리어 가스로 헬륨을 사용합니다. 분할 모드 (비율 20시 1분, 분할 흐름 29.4 ML / 분, 총 유량 33.8 ML / 분 분할)에 derivatized 제품 (1 μl)을 주사. 100 초기 열 온도를 설정 ° C와 180을 증가하기 전에 2 분 그 온도에서 개최 ° C 10의 비율 ° C / 분. 4 분에 대한 온도를 잡고 다음 ° C 20 ° C 비율 / 분 260을 향상시킬 수 있습니다. 실행이 끝날 때까지이 온도를 유지합니다. 각 샘플 후, 헥산 2 주사로 컬럼을 청소하십시오.
- 15 N. - 1, 398.0 M / Z 이온 알란토인과 400.0 M / Z 이온을 감시하면서 DL - 알란토인 - 5-13 C을 선택 이온 모니터링 모드를 사용 알란토인을 수량 준비된 표준 곡선을 사용하여 알란토인의 micromolar 농도에 알란토인 / (무거운 알란토인)의 이온 풍부한 비율을 변환합니다.
- 모든 샘플은 세중의에 분석 있지만 10 % 미만의 편차의 계수에만 값이 추가로 분석에 사용됩니다.
5. MDA 분석을위한 내부 표준, 메틸 Malondialdehyde (MMDA)를 준비
- 100ml 둥근 바닥 플라스크에 1477μl은 7m NaOH에 523μl 3 ethoxymethacrolein을 추가합니다. stirbar를 추가합니다.
- 45 물 목욕에있는 술병을 플레이스 ° C와 반응이 완료 간 때까지 저어. 이것은 약 140 분 정도 소요됩니다. 10 분 간격으로 정기적으로 액체의 10μl 나누어지는을 제거하여 반응의 진행 상황을 모니터링합니다. 50 MM의 칼륨 인산 버퍼 (산도 7)를 사용하여 UV - 비스와 흡광도를 측정 10 5의 요소에 의해 수집된 각각의 샘플을 희석. 일단 275nm에서 흡광도가 약 0.658 반응이 완료되면 도달합니다. 반응이 진행되는 동안 솔루션은 노란색 그러면 주황색으로 바뀔 것이다.
- 추가 15 분에 대한 진행 상황에 대한 반응을 허용합니다.
- 둥근 바닥 플라스크에 증류수 탈이온수의 5ml를 추가하고 분리 깔때기에 대한 해결책을 전송합니다. 깔때기에 술병의 내용을 씻어 물을 추가 3 ML을 사용합니다. 깔때기로 물을 추가 2ml를 추가합니다.
- 5 ML의 dichloromethane있는 솔루션을 3 번이나 압축을 풉니다. 각 추출 후 유기 층을 삭제.
- 세 번째 추출 후, 둥근 바닥 플라스크에 수성 레이어를 전송하고 건조하는 rotovap.
- 3ml 에탄올과 미리 무게 15ml 원뿔 튜브로 전송에서 제품을 Resuspend. 추가 2ml 에탄올로 술병을 씻어 원뿔 튜브에 린스를 추가합니다.
- 5ml 벤젠을 추가하고 제품이 즉시 10 분 얼음에 튜브를 삽입 후 해체까지 따뜻한 물에 튜브를 품어. 15,000g에서 5 분을 위해 원심 분리기와 뜨는을 제거하십시오.
- precip에 5ml 에탄올 5 ML 이소 프로필 에테르 추가itant. 아주 부드럽게 튜브를 따뜻한 물에 튜브를 잠복기와 정기적으로 기울이기로 침전제를 해산. 침전물이 용해되면, 10 분 얼음 튜브를 놓으십시오. 이 재결정에게 에탄올과 이소 프로필 에테르 2 번 이상을 수행합니다. 제품의 일부 불용성 백색 덩어리가 형성됩니다.
- 마지막 재결정 단계 후 Speedvac 가능하고 건조 결과 제품으로 많이 뜨는으로 제거합니다. 합성 제품과 함께 원뿔 튜브를 달다.
- 튜브, 소용돌이에 5ml 물을 추가하고 남은 고체를 필터링합니다.
- MMDA의 최종 농도를 결정하는 UV - 마주 분광 광도계를 사용합니다. 50 MM 칼륨 인산염 버퍼의 MMDA에 대한 λmax (산도 7) 29,900 M -1 cm -1 14 흡광 계수와 274 nm의 수 있습니다.
6. MDA의 GC / MS 측정
- 9ml 에탄올에 0.11 g BTH를 추가하고 10ml로 최종 볼륨을 조정하여 에탄올에 0.5mM butylated 히드록실 톨루엔 (BTH)의 솔루션을 준비합니다. 다음 990μl 에탄올이 집중 솔루션의 10μl를 추가하여 희석을 수행합니다.
- 어두운 microcentrifuge 관에 물이 995μl로 페닐 히드 라진의 4.92μl를 추가하여 50mM 페닐 히드 라진의 솔루션을 준비합니다. 와동 솔루션입니다.
- 시료 수집 및 처리하는 동안 MDA 분석을 위해 별도로 설정 100μl 플라즈마에 5μl 10μM MMDA를 추가합니다.
- 다음 10μl 0.5mM BTH는 산도 4 200μl 1M 나트륨 구연 산염의 또한 다음 MMDA / 플라즈마 혼합물에 추가할 수 있습니다.이 산도는 시료의 정확한 derivatization 중요합니다. 높거나 낮은 산도 괴상한 MDA 수준에서 발생합니다.
- 480μl의 최종 볼륨에 증류수 탈이온수를 추가하여 최종 혼합물을 희석.
- , 20μl 50mM 페닐의 히드 라진을 추가 튜브를 상한 및 궤도 쉐이크 30 분 25 솔루션 ° C를 잠복기하여 솔루션을 Derivatize.
- 헥산 10 분 3,000 rpm으로 1 분, 그리고 원심 분리기를위한 소용돌이 1ml를 추가합니다.
- GC / MS 유리병에 유기 레이어를 전송하고 N 2 스트림에 의해 100μl에 대한 해결책을 집중.
- 자동 시료 채취기를 사용하여 GC / MS에 샘플을 분석할 수 있습니다. 애질런트의 화합물 분리 수행 122 - 5532G 모세관 컬럼 (25.7 m 길이, 0.25 mm 내경). 0.6-0.8 ML / 분 유량에 캐리어 가스로 헬륨을 사용합니다. 분할 모드 (비율 20시 1분 분할, 분할 흐름 23.0 ML / 분, 총 유량 27.1 ML / 분)에서 derivatized 제품 (2 μl)를 주사. 110 초기 열 온도를 설정 ° C와 250을 증가하기 전에 1 분 그 온도에서 개최 ° C - 40의 비율 ° C / 분. 실행이 끝날 때까지이 온도를 유지합니다. 각 샘플 후, 헥산 2 주사로 컬럼을 청소하십시오.
- 144.00 m / MDA에 대한 Z와 158.00 M / MMDA에 대한 Z를 사용하여 선택 이온 모니터링 모드를 사용하여 MDA를 계량. 표준 곡선을 사용하여 micromolar 농도에 MDA / MMDA 이온 풍부한 비율을 변환합니다.
- 세중의에 샘플을 분석하고 단 10 % 미만의 계수 변화와 가치를 사용합니다.
7. 크산텐 산화 효소의 HPLC 측정
- 크산텐 산화 효소 기능의 감지는 sensitively 적합한 기판 (pterin)뿐만 아니라 그 제품 (isoxanthopterin)의 수준을 측정할 수있는 능력에 따라 달라집니다. 플라즈마 중 0 분 (제어) 또는 4 H에 대한 기판과 incubated이며, 제품의 변환에 부화에 의존 기판이 결정됩니다.
- 각 튜브 (0 4h)을 240μl 0.2 M 트리스 - HCL 버퍼 (산도 9.0)와 4.63μl 7.083x10 -3 M pterin을 추가하고 37 그들을 preincubate ° C를 5 분.
- 각각의 튜브에 플라즈마의 60μl를 추가하여 효소 반응을 시작합니다.
- 즉시 제어 튜브 (0 분)에 HClO 4 300μl 4 % 추가지만, 다른 혼합물은 담금질하기 전에 4 시간 300μl 4% HClO 4 반응을 품어 수 있습니다.
- HClO 4 추가 후, 적극적으로 튜브를 흔들 다음 ° C 1만5천g 15 분 4 원심 분리기.
- 뜨는의 500μl를 제거하고 5M K 2 CO 3 20μl를 추가하여 중화. 적극적으로 튜브를 흔들 다음 ° C 15,000g 15 분 4 원심 분리기.
- 1x10 -8 몰 2 - AP를 포함하는 microcentrifuge 관에 대한 무력화 솔루션의 350μl를 추가합니다.
- 스캔 형광 검출기를 갖춘 HPLC에 샘플을 분석할 수 있습니다. 세 50 μl 주사는 각 샘플에 사용됩니다. 샘플은 Supelguard LC - 18 - S 칼럼 경비를 갖춘 Wacosil 5C - 18-200 250mm X 6.0 mm, 5 μm의 칼럼에 주입한다. 유량 1ml/min에서 95% 20mM KPO 4 버퍼 (산도 2.2) 및 5 % 메탄올 : 다음 isocratic 조건은 충분한 피크 분리 및 신분증을 얻기 위해 사용해야합니다. 345 nm의 형광 검출기에 대한 여기 파장과 방출 파장을 설정410 nm의 길이에.
- pterine의 비율과 형광 검출기 스펙트럼의 피크 영역을 취득하여 2 - AP에 isoxanthopterine를 결정합니다. 스펙트럼의 첫 번째 피크는 ~ 5 분, 2 - AP에 해당합니다. 두 번째이자 최대 규모의 절정은 pterine 것입니다. Isoxanthopterine 정상은 지난 elutes.
- 0 4 H 보육 시간 지점 사이 isoxanthopterine/2-AP 피크 면적 비율의 차이를 구합니다. 표준 곡선에서 XO 활동을 계산하기 위해이 값을 사용합니다.
- triplicates의 샘플을 분석하지만, 10 % 미만의 계수 변화에만 값을 사용합니다.
8. 대표 결과 :
purine 화합물의 HPLC의 부량의 예제는 그림 1A에 표시됩니다. 특정 유지 시간 및 hypoxanthine, 크산텐의 방출 파장 및 요산은 purine 화합물의 동시 부량 (표 2)를 허용합니다. 분석이 제대로 실행되면, 화합물 적절한 분리를하고 정상 모양 샤프하고 unimodal 것입니다. 이 봉우리는 다음 표준 곡선의 사용을 통해, 표 3에 나타난 농도, 범위로 변환됩니다. 이 분석을위한 샘플 처리가 최소한이기 때문에 발생할 수있는 유일한 샘플을 기반으로 문제가 적혈구의 lysing 것입니다. 샘플 centrifuged되기 전에 적혈구가 lyse 경우, 플라즈마 오렌지 / 레드 색상에 걸릴 것이며, hypoxic 국소 빈혈을 평가하기위한 사용하실 수 없습니다. purines을 측정하는 경우 발생할 수있는 다른 문제는 HPLC 시스템과 컬럼 (그림 1B)를 포함합니다. HPLC 시스템에 공기 방울이있다면 유지 시간은 변화하고 HPLC 압력이 크게 변동됩니다. 가드 카트리지를 변경해야 할 경우, 압력은 증가하며 봉우리 넓혀 및 BI 또는 트라이 - 모달 될 것입니다.
| Hypoxanthine (μm의) | 크산텐 (μm의) | 요산 (μm의) | 크산텐 산화 효소 ((nmol 제품) / 분) | Malondialdehyde (μm의) | 알란토인 (μm의) | |
| 기간 Normoxic | 1.13-19.3 (64) | 0.02-3.69 (61) | 107.20-726.12 (63) | 2.47x10 -6 - 3.92x10 -3 (20) | 0.44-3.76 (53) | NA |
| 기간 호흡 곤란 | 1.78-12.59 (27) | 0.07-11.8 (24) | 225.40-653.32 (27) | 0 - 1.03x10 -5 (8) | 0.82-2.73 (24) | NA |
| 기간 Hypoxic | 0.38-31.80 (13) | 0.11-2.88 (13) | 235.65-1348.13 (13) | 1.20x10 -5 -236.44 (9) | 0.95-2.15 (7) | NA |
| Preterm Normoxic | 1.54-4.39 (9) | 0.03-1.77 (9) | 178.92-593.49 (9) | 2.46x10 -5 - 5.44x10 -4 (2) | 0.95-2.74 (8) | 2.30-5.26 (67) |
| Preterm 호흡 곤란 | 3.04-8.04 (2) | NA | 327.56-365.11 (2) | NA | 2.40-3.46 (3) | NA |
최소 - 최대 (N)
표 3. purines, 크산텐 산화 효소, malondialdehyde, 그리고 알란토인을위한 대표 범위.
알란토인의 GC / MS 부량의 예제는 그림 2에 표시됩니다. derivitized 알란토인과 derivitized 무거운 알란토인의 질량이 알려져 있기 때문에, 이온 모드 질량 분석기에서 이러한 화합물을 식별하는 데 사용할 수 있습니다를 선택합니다. 분석이 제대로있다면, 두 봉우리가 동일한 보존 시간에 관찰됩니다. 알란토인에 해당 하나 (398.00 M / Z)와 무거운 알란토인 (400.00 M / Z)로 다른. 이 봉우리는 다음 표준 곡선의 사용을 통해, 표 3에 나타난 농도, 범위로 변환됩니다. 분석이 잘못 실행되고 샘플이 제대로 derivitized되지 않은 경우, 봉우리가 존재하지 않거나 양적 대표하지 않을 수 있습니다. 적혈구가 lysed 경우 다시 한번, 플라즈마는 신생아 hypoxic 국소 빈혈에 산화 스트레스를 평가하는 데 사용할 수 없습니다.
MDA의 부량에 대한 결과는 두 봉우리가 다른 유지 시간에 관찰되는 예외와 알란토인 분들과 비슷합니다. 에 ~ 3.5 분 유지 시간, 144.00 M / Z MDA에 대한 정상과 ~ 4 분 보존 시간에, MMDA에 대해 158.00 M / Z 피크는 (그림 3) 관찰합니다. 이 봉우리는 다음 표준 곡선의 사용을 통해, 표 3에 나타난 농도, 범위로 변환됩니다. 분석이 잘못 실행하거나, 샘플이 제대로 derivitized하지 않은 경우 144.00m / Z와 158.00m / Z. 위해 선택할 때, 어떤 봉우리가 관찰되지 않을 수 있습니다 그것은 언급해야볼러스 구두 feedings 또는 정맥 지질 관리에서 플라즈마에 지방질의 과잉이있다면, 플라즈마는 은하수 모양에 걸릴 것이며, 신생아 hypoxic 국소 빈혈에 산화 스트레스를 평가하는 데 사용할 수 없습니다.
크산텐 산화 효소 기능의 HPLC 기반 부량의 예제는 그림 4에 표시됩니다. 분석이 올바르게 실행되는 경우, 세 봉우리는, 형광 검출기로 pterin 한, isoxanthopterin 한, 2 - AP에 대한 하나를 관찰해야합니다. 이 봉우리는 다음 표준 곡선의 사용을 통해, 표 3에 나타난 농도, 범위로 변환됩니다. 또한 PDA 검출기에서 생성된 스펙트럼에 isoxanthopterin 2 - AP에 해당하는 피크가 있어야합니다. 효소 활동이 결석하는 경우, isoxanthopterin에 해당하는 최고 볼 수 없습니다. 이 분석은 효소 기능을 측정하기 때문에, 반복 동결 샘플 해동 이것을 변경할 수 있습니다.
그림 1. purine 화합물의 식별을위한 HPLC 스펙트럼. A). 대표 결과 분석이 제대로 실행 않았다. B). HPLC, 열, 또는 가드 카트리지에 문제가있는 대표적인 결과가있다면.
그림 2. 알란토인의 부량에 대한 GC / MS 스펙트럼. M / Z가 알란토인에 해당하는 이온 398.00에서 피크. 이온 400.00 M / Z에서 정상이 무거운 알란토인에 해당합니다.
그림 3. MDA의 부량에 대한 GC / MS 스펙트럼이. 이온 144.00 M / Z에서 절정는 MDA에 해당합니다. 이온 158.00 M / Z에서 절정은 MMDA에 해당합니다.
그림 4. XO 활동의 측정을위한 HPLC 스펙트럼.) 4 시간 배양 시간 0 분 배양 시간 및 B) 대표에 대한 검색 결과 대표 결과입니다. 4 시간 배양 시간에 높은 isoxanthopterine 정상 (~ 17 분) 참고. 형광 스펙트럼에서 2 - AP는 ~ 10 분 ~ 5 분에서 다음과 pterine elutes 처음엔 elutes.
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Discussion
방법은 신생아 hypoxia의 국소 빈혈의 평가를 허용 여기에서 설명한. 이 프로토콜도 전반적인 생화 학적 존재의 사진이나 hypoxic 국소 빈혈의 정도를 얻기 위해 에너지 (ATP) 빈곤, 산화 스트레스, 산화 손상, 및 효소 활동의 마커의 측정을 결합한 제품입니다. 이 방법의 유용에도 불구하고, 잠재적인 제한이 있습니다. 첫째, 그것은 assays 모두 실행할 정도로 플라즈마를 수집하는 혈액의 약 1-2 ML 걸립니다. 이것은 성인이나 어린이 문제가되지 않습니다하지만, 특히 neonates, 조기 분들과 함께 작업할 때 그것이 우려된다. 우리는 assays에 우선 순위를하고 필요한 경우 샘플의 일부를 diluting하여이 문제를 해결 둘째, 그것이 MMDA를 합성하기 어려울 수 있습니다. 그러나, MDA는 내부 표준으로 MMDA를위한 대용품으로 사용할 수 있습니다 진정제를 맞았을.
이러한 제한에도 불구하고, 방법은 신생아 hypoxia의 국소 빈혈뿐만 아니라 불균형 산화 환원 항상성와 관련된 다른 질환을 평가에 유용한 도구를 제공합니다 설명했다. 또한, XO를 제외한 이들 마커 모두, 모니터링 neonates의 비침습 방법을 제공하고, 소변에서 측정할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 건강 R01 NR011209 - 03 국립 연구소에 의해 자금 지원됩니다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6ml K3E EDTA K3 tube | Fisher Scientific | 2204061 | |
| 5702R centrifuge | Fisher Scientific | 05413319 | With 13&16MM adaptor |
| 1.5ml microcentrifuge tube | USA Scientific, Inc. | 1615-5599 | |
| 2-Aminopurine | Sigma-Aldrich | A3509 | |
| Varian Cary 100 spectrophotometer | Agilent Technologies | 0010071500 | |
| Savant SpeedVac | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SC210A-115 | |
| Micron centrifugal filter device | Fisher Scientific | UFC501596 | |
| Supelcosil LC-18-S Column | Sigma-Aldrich | 58931 | |
| Supelcosil LC-18-S Supelguard cartridge and holder | Sigma-Aldrich | 59629 | |
| HPLC | Waters | ||
| GCMS Vial | Fisher Scientific | 03376607 | |
| DL-Allantoin-5-13C;1-15N | CDN Isotopes | M-2307 | Lot #L340P9 |
| MTBSTFA | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 48920 | |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | |
| 5973E GC/MSD | Agilent Technologies | G7021A | Part # for 5975E GC/MS |
| 3-Ethoxymethacrolein | Sigma-Aldrich | 232548 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Benzene | Sigma-Aldrich | 401765 | |
| Diisopropyl ether | Sigma-Aldrich | 38270 | |
| BHT | Sigma-Aldrich | B1378 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Phenylhydrazine | Sigma-Aldrich | P26252 |
References
- Harkness, R. A., Whitelaw, A. G., Simmonds, R. J. Intrapartum hypoxia: the association between neurological assessment of damage and abnormal excretion of ATP metabolites. J Clin Pathol. 35, 999-1007 (1982).
- Shalak, L., Perlman, J. M. Hypoxic-ischemic brain injury in the term infant-current concepts. Early Hum Dev. 80, 125-141 (2004).
- Webster, W. S., Abela, D. The effect of hypoxia in development. Birth Defects Res C Embryo Today. 81, 215-228 (2007).
- Engerson, T. D., McKelvey, T. G., Rhyne, D. B., Boggio, E. B., Snyder, S. J., Jones, H. P. Conversion of xanthine dehydrogenase to oxidase in ischemic rat tissues. J Clin Invest. 79, 1564-1570 (1987).
- Choi, E. Y., Stockert, A. L., Leimkuhler, S., Hille, R. Studies on the mechanism of action of xanthine oxidase. J Inorg Biochem. 98, 841-848 (2004).
- Godber, B. L., Schwarz, G., Mendel, R. R., Lowe, D. J., Bray, R. C., Eisenthal, R. Molecular characterization of human xanthine oxidoreductase: the enzyme is grossly deficient in molybdenum and substantially deficient in iron-sulphur centres. Biochem J. 388, 501-508 (2005).
- Gruber, J., Tang, S. Y., Jenner, A. M., Mudway, I., Blomberg, A., Behndig, A. Allantoin in human plasma, serum, and nasal-lining fluids as a biomarker of oxidative stress: avoiding artifacts and establishing real in vivo concentrations. Antioxid Redox Signal. 11, 1767-1776 (2009).
- Zitnanova, I., Korytar, P., Aruoma, O. I., Sustrova, M., Garaiova, I., Muchova, J. Uric acid and allantoin levels in Down syndrome: antioxidant and oxidative stress mechanisms? Clin Chim Acta. 341, 139-146 (2004).
- Siciarz, A., Weinberger, B., Witz, G., Hiatt, M., Hegyi, T. Urinary thiobarbituric acid-reacting substances as potential biomarkers of intrauterine hypoxia. Arch Pediatr Adolesc Med. 155, 718-722 (2001).
- Buonocore, G., Perrone, S., Longini, M., Terzuoli, L., Bracci, R. Total hydroperoxide and advanced oxidation protein products in preterm hypoxic babies. Pediatr Res. 47, 221-224 (2000).
- Berne, R. M. Cardiac nucleotides in hypoxia: possible role in regulation of coronary blood flow. Am J Physiol. 204, 317-322 (1963).
- Harkness, R. A., Lund, R. J. Cerebrospinal fluid concentrations of hypoxanthine, xanthine, uridine and inosine: high concentrations of the ATP metabolite, hypoxanthine, after hypoxia. J Clin Pathol. 36, 1-8 (1983).
- Plank, M. S., Boskovic, D. S., Sowers, L. C., Angeles, D. M. Biochemical markers of neonatal hypoxia. Pediatric Health. 2, 485-501 (2008).
- Cighetti, G., Allevi, P., Anastasia, L., Bortone, L., Paroni, R. Use of methyl malondialdehyde as an internal standard for malondialdehyde detection: validation by isotope-dilution gas chromatography-mass spectrometry. Clin Chem. 48, 2266-2269 (2002).
- Paroni, R., Fermo, I., Cighetti, G. Validation of methyl malondialdehyde as internal standard for malondialdehyde detection by capillary electrophoresis. Anal Biochem. 307, 92-98 (2002).
- Cighetti, G., Debiasi, S., Ciuffreda, P., Allevi, P. Beta-ethoxyacrolein contamination increases malondialdehyde inhibition of milk xanthine oxidase activity. Free Radic Biol Med. 25, 818-825 (1998).
- Cighetti, G., Debiasi, S., Paroni, R., Allevi, P. Free and total malondialdehyde assessment in biological matrices by gas chromatography-mass spectrometry: what is needed for an accurate detection. Anal Biochem. 266, 222-229 (1999).
- Yamamoto, T., Moriwaki, Y., Takahashi, S., Tsutsumi, Z., Yamakita, J., Nasako, Y. Determination of human plasma xanthine oxidase activity by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr B Biomed Appl. 681, 395-400 (1996).
- Handbook of Biochemistry and Molecular Biology. Fasman, G. , 3 ed, CRC Press. Boca Raton. (1988).
- Chen, X. B., Calder, A. G., Prasitkusol, P., Kyle, D. J., Jayasuriya, M. C. Determination of 15N isotopic enrichment and concentrations of allantoin and uric acid in urine by gas chromatography/mass spectrometry. J Mass Spectrom. 33, 130-137 (1998).
