Summary
هذه الدراسة توضح الأسلوب الذي يسمح للتشخيص السريع والواضح من الأمراض الفيروسية النباتية في يوم واحد نحو نصف باستخدام مزيج من الميكروويف بمساعدة محطة إعداد العينات للفحص المجهري الإلكتروني النافذ والأساليب تلطيخ السلبية.
Abstract
التحقيقات من التغييرات التي تحدثها الفيروسات التركيبية وغالبا ما تكون ضرورية لتحديد بشكل واضح الأمراض الفيروسية في النباتات. مع إعداد العينات للفحص المجهري الإلكترون التقليدي انتقال (TEM) مثل هذه التحقيقات يمكن أن يستغرق عدة أيام 1،2 و بالتالي فهي غير مناسبة لتشخيص السريع للأمراض النباتية الفيروس. ويمكن استخدام الميكروويف لتثبيت خفض كبير مثال لوقت التحضير للتحقيقات TEM مع نتائج مماثلة التركيبية كما لوحظ بعد إعداد العينات تقليديا 3-5. العديد من مختلف الأجهزة المخصصة الميكروويف التي تتوفر حاليا والتي يمكن استخدامها لتثبيت ناجحة وتضمينها من العينات البيولوجية للتحقيقات TEM 5-8. في هذه الدراسة أن نبرهن على فيروس موزاييك التبغ (TMV) إصابة النباتات تبغ نيكوتيانا أنه من الممكن لتشخيص التغيرات التركيبية في الأوراق في يوم واحد نحو نصف الميكروويف باستخدام إعداد نموذج لمساعدة TEM. لقد اخترنا لتنفيذ هذه الدراسة مع جهاز الميكروويف المتاحة تجاريا لأنه يؤدي إعداد العينات تقريبا بالكامل تلقائيا 5 في عكس الأجهزة الأخرى المتاحة حيث لا يزال العديد من الخطوات التي يتعين القيام بها يدويا هي 6-8 وبالتالي مزيد من الوقت والمستهلكة العمل. كما يمكن إعداد العينات يتم تنفيذ كامل تلطيخ السلبية تلقائيا من الجسيمات الفيروسية في العصارة من الأوراق المتبقية TMV المصابين وفحص التركيب الدقيق ليلي وحجم إجراء التثبيت وخلال التضمين.
Protocol
إعداد نموذج الميكروويف بمساعدة
- قبل بدء إعداد العينات يحتاج المرء لبرنامج نسيج الميكروويف التلقائي للمعالج المجهر الإلكتروني (لايكا EM AMW؛ ايكا مايكروسيستمز، فيينا، النمسا) مع البروتوكولات التالية (الجدول 1) لإعداد عينة بمساعدة الميكروويف لTEM:
الجدول 1. بروتوكول لإعداد العينات باستخدام أشعة الميكروويف. وتظهر أعمدة مختلفة (من اليسار إلى اليمين):- عدد فيال (فيال NR.) يمثل الترتيب الذي يتم تحميل فيال في دائري من المعالج.
- خطوة من العملية الفعلية.
- الكواشف في قارورة.
- مدة الخطوة الفعلية.
- درجة الحرارة العظمى التي تم التوصل إليها في القارورة قبل تشغيل أشعة الميكروويف قبالة.
- الميكروويف الإعداد التشعيع: incre المستمر = درجة الحرارة السريعبورصة عمان، وعقد درجة حرارة مجموعة؛ المنحدر = ارتفاع درجة الحرارة لطيف، ودرجة الحرارة النهائية تم التوصل إليها في الغاية؛ نابض = ارتفاع درجة الحرارة السريع، والسلطة، إيقاف حتى انخفضت درجة الحرارة 5 درجات مئوية، والسلطة، استأنفت لتصل إلى درجة الحرارة.
- أقصى قوة أشعة الميكروويف.
- إعداد طازجة الحلول لمختلف الخطوات الموضحة في نموذج إعداد بروتوكول (لراتنج الايبوكسي آجار 100 انظر 1.7)، وملء لهم في قارورة المعينة وفقا لبروتوكول المبرمجة (الجدول 1)، تحميل قوارير على دائري، ثم إدراج دائري في الميكروويف المعالج الأنسجة، وأخيرا تحميل القارورة لأول مرة في غرفة أحادية النمط.
- قطع أجزاء صغيرة من أوراق (1MM 2) من تبغ نيكوتيانا المصابين بفيروس موزاييك التبغ (TMV) مع شفرة حلاقة على النمذجة لوحة الشمع في قطرة من غلوتارالدهيد 3٪ (آجار العلمية المحدودة، ستانستيد، انكلترا) في سورنسن 60mM الفوسفات العازلة (درجة الحموضة 7.2) في درجة حرارة الغرفةerature.
- نقل المقاطع مع ملاقط غرامة على الفور في سلال المعينة مع عرض شبكة من 200μm تقريبا. كومة من سلال على رأس كل منهما الآخر وإدراجها في غرفة أحادية النمط. يجب توخي الحذر التي يتم تناولها باستمرار مع عينات حل مثبت أثناء التحميل والتراص من سلال بحيث لا تجف.
- بدء المبرمجة سابقا الميكروويف إعداد العينات بمساعدة بروتوكول للجفاف، وتثبيت التسلل.
- في حين يتم تنفيذ إعداد العينات تلقائيا باستخدام الميكروويف المعالج الأنسجة تواصل مع تلطيخ السلبية مع المواد النباتية المتبقية كما هو موضح في القسم 3 (تلطيخ السلبية).
- إعداد طازجة الراتنج الايبوكسي آجار 100 من خلط المكونات التالية كما هو موضح: التعبئة 24G آجار 100، 16G أنهيدريد السكسينيك dodecenyl، و 10 أنهيدريد الميثيل ز نادك (لجميع مكونات انظر آجار العلمية المحدودة، ستانستيد، انكلترا) في كوب من البلاستيك، والحرارة إلى40 ° C ويخلط جيدا. إضافة 1.2G ثنائي ميثيل أمين من البنزيل ومزيج دقيق. الراتنج الايبوكسي ملء أجار 100 في البلمرة المعينة تشكل قبل بروتوكول إعداد العينات إلى نهايته (على سبيل المثال أثناء الخطوة 22 في الجدول 1).
- بعد الانتهاء من البروتوكول (بعد الخطوة 22 في الجدول 1) الإفراج عن سلال تحتوي على عينات مكدسة تسللوا الى البلاد من دائرة أحادية النمط في القارورة الأخيرة من دائري. إزالة دائري من الجهاز الميكروويف، unstack سلال وتحميلها باستخدام ملاقط غرامة في أشكال البلمرة المعينة. يجب توخي الحذر دائما أن يتم تغطية العينات مع الراتنج الايبوكسي آجار 100 اثناء التحميل وunstacking بحيث لا تجف.
- كومة من أشكال البلمرة على رأس كل منهما الآخر. يجب توخي الحذر دائما أن يتم تغطية العينات مع الراتنج الايبوكسي آجار 100 اثناء التحميل والتراص بحيث لا تجف.
- إزالة قارورة كانت تستخدم في السابق من دائري من TISS ميكروويفرق المعالج، تحميله مع سلال مكدسة وإدراج دائري في الميكروويف المعالج الأنسجة.
- بدء البلمرة بروتوكول المبرمجة سابقا (الجدول 1).
- في حين يتم تنفيذ البلمرة من تلقائيا باستخدام الميكروويف المعالج الأنسجة، دراسة شبكات الملون سلبا مع ناقل حركة المجهر الالكتروني [مثل فيليبس CM10 TEM، الاتحاد الدولي للفروسية (سابقا فيليبس)، ايندهوفن، هولندا] وإجراء تحليل الصور كما هو موضح في الباب 3 و 4 ( تلطيخ السلبية وتحليل الصور).
- بعد الانتهاء من إزالة أشكال البروتوكول البلمرة من غرفة أحادية النمط، unstack الأشكال وإزالة البلمرة بلمرة الكتل التي تحتوي على عينات. وهم الآن على استعداد ليكون مقطوع مع مشراح.
2. تقليم وتقطيع
- إدراج واحد أو أكثر من كتل منفصلة في أصحاب عينة لتقطيع سامسونج مع العينة على الخلاف حول 1CM الأعلى من حامل.
- تقليم مع كتلة الانتهازي العينة لTEM (مثل لايكا رايشرت Ultratrim؛ ايكا مايكروسيستمز) بحيث وجه كتلة من الحد الأقصى. 1MM في الطول والعرض في 200μm الذي يحتوي على أكبر قدر ممكن ورقة المواد يتحقق (حجم كتلة وجه قد تحتاج إلى تعديل لحجم السكين الماس).
- القسم كتلة مع مشراح مستدق (مثل لايكا رايشرت Ultracut S؛ ايكا مايكروسيستمز) باستخدام سكين الماس بزاوية 45 درجة بسكين من (مثل Diatome الترا 45، Gröpl، مدينة Tulln، النمسا). ينبغي تعديل سمك الباب إلى حوالي 70 إلى 90nm وسرعة القطع يجب أن يكون حول 1MM / ثانية. التقاط مقاطع متعددة مع (آجار العلمية المحدودة) formvar المغلفة النحاس أو النيكل 200 شبكة سلكية مربع.
- بعد وصمة عار الأقسام على الشبكة مع سترات الرصاص (آجار العلمية المحدودة؛ 1.1g سترات الرصاص المذاب في الماء المقطر 42ml مزدوجة وهيدروكسيد الصوديوم 1N 8ML) لمدة 5 دقائق في طبق بتري مليئة جزئيا مع هيدروكسيد الصوديوم لإنشاء CO 2-مجانا البيئة وعن 15 ميلnutes مع خلات اليورانيل 1٪ (آجار العلمية المحدودة) الذائب في الماء المقطر في درجة حرارة الغرفة. شبكات غسل بالماء المقطر لمدة 1 دقيقة في كل خطوة بين ما بعد تلطيخ. تجفيف الهواء في شبكات مربع الشبكة.
- دراسة المقاطع مع ناقل حركة المجهر الإلكتروني (مثل فيليبس CM10 TEM، الاتحاد الدولي للفروسية، ايندهوفن، هولندا).
3. تلوين سلبي
- الحصاد عن 100mg من TMV المصابين وإعداد المواد ورقة النسغ الخام من المواد المجانسة لمدة 2 دقيقة مع شفرة حلاقة على شريحة المجهر في 100μl من الفوسفات عازلة 60mM Søfrensen (الرقم الهيدروجيني 7.2).
- نقل 20μl من الناتج جناسة على أول بئر من المجهر الشريحة تفلون المغلفة مع 4 أو أكثر الآبار (بدلا من أن من الممكن أيضا لنقل جناسة على قطعة من parafilm).
- وضع شبكة formvar المغلفة على رأس جناسة مع الجانب (آجار العلمية المحدودة) formvar المغلفة يواجه نحو الانخفاض وincuخفض صوته لمدة 5 دقائق.
- غسل الشبكة 2 مرات لمدة 2 دقيقة في كل طريق وضع الشبكة على أعلى نقطتين من 60mM 200μl العازلة الفوسفات سورنسن (الرقم الهيدروجيني 7.2).
- احتضان الشبكة لمدة 1 دقيقة مع حمض الطازجة الفسفوتنغستيك 2٪ (آجار العلمية المحدودة) في حل الفوسفات عازلة 60mM سورنسن (الرقم الهيدروجيني 6.5).
- إزالة الشبكة والسماح لها الهواء الجاف في صندوق الشبكة.
- دراسة الشبكة مع انتقال المجهر الإلكتروني (مثل فيليبس CM10 TEM؛ الاتحاد الدولي للفروسية، ايندهوفن، هولندا). يستغرق على الأقل 10 صور من اختيارها عشوائيا virions الملون سلبا (على الأقل 10 أو أكثر virions يجب أن تكون مرئية على كل صورة) مع انتقال المجهر الالكتروني في التكبير الرئيسي لل21000X أو أعلى. يجب الحرص على أن يكون كل الصور التكبير نفسه.
4. تحليل الصور
- قياس طول وعرض لا يقل عن 100 موقع سكني بطريقة عشوائية جزيئات الفيروس واحد على micrographs مأخوذة منالعينات الملون سلبا باستخدام أي جهاز كمبيوتر تحليل البرمجيات صورة [مثل خلية D (أوليمبوس، الحياة وعلم المواد أوروبا المحدودة، هامبورغ، ألمانيا) مع أداة تحليل الجسيمات أو Optimas 6.5.1-(وسائل الإعلام علم التحكم الآلي شركة في بيثيسدا، ميريلاند، USA)].
- حساب الوسائل والانحرافات المعيارية من أجل تحقيق متوسط طول وعرض تصور جزيئات الفيروس بطرق سلبية وتلطيخ TEM.
- مقارنة طول وخصائص التركيبية (التي تم الحصول عليها في 2.5) ذات أحجام من الفيروسات والتعديلات الناجمة عن الأمراض التركيبية فيروس يعرف في الأدبيات من أجل تحديد بوضوح الأمراض الفيروسية.
5. ممثل النتائج:
يمكن بعد إعداد نموذج الميكروويف بمساعدة التعديلات التي يسببها TMV نموذجية التركيبية مثل ملاحظتها مناطق واسعة تحتوي على virions الانحياز في شكل متواز مع انتقال المجهر الالكتروني في العصارة الخلوية من Nicotian المصابةوالخلايا تبغ (الشكل 1A). بالإضافة إلى ذلك، في النسغ الخام من TMV المصابين يترك ويمكن ملاحظة الجسيمات TMV كما flexuous هياكل على شكل قضيب، وبعد تلطيخ السلبية (الشكل 1B). كشف تحليل الصور من جزيئات الفيروسات 100 حجم متوسط TMV من 280nm في الطول والعرض في 17nm (الشكل 2). تم العثور على التركيب الدقيق في TMV المصابين وحجم الخلايا من virions لوحظ في هذه الدراسة أن تكون وفقا للخصائص التي يسببها TMV التركيبية في التبغ، ومجموعة من الجسيمات حجم TMV ذكرت سابقا في الأدب 9-15.
الرقم انتقال الإلكترون 1. micrographs من الخلايا المصابة ورقة TMV وvirions. A) الصورة تبين التركيب الدقيق للخلايا المصابة TMV أوراق تبغ نيكوتيانا من نسيج الورقة المتوسط بعد الميكروويف بمساعدة محطة إعداد العينات. لاحظ مساحة واسعة من virions موازية الانحياز التي تراكمت في العصارة الخلوية.C = بلاستيدات الخضراء مع النشا (القديس)، M = الحبيبات الخيطية، N = النواة، V = فجوة، بار = 2μm. B) الصورة تظهر virions التي تم الكشف من قبل تلطيخ السلبية في النسغ من الأوراق المصابة.
الشكل 2. الحجم النسبي من virions. توزيع نسبي طول وعرض TMV-الجسيمات بعد تلطيخ السلبية النسغ من الأوراق المصابة لأنها ظهرت في المجهر الإلكتروني. تم حساب قيم متوسطة (يعني طول / عرض ± الانحراف المعياري) من 100 virions.
Discussion
وقد ثبت الميكروويف عينة النبات بمساعدة استعدادا لTEM لتوفير بيانات التركيبية سريعة وموثوق بها في غضون ساعات قليلة 3،4،16. كان الحفاظ غرامة الهيكلية للعضيات والأغشية تحقيق مع الطريقة المستخدمة في هذه الدراسة مشابهة لعينات التقليدية وcryofixed 5،15 مع الاستفادة من انخفاض كبير في تثبيت العينة وتضمينها الوقت من 3 أيام أو أكثر إلى حوالي 2 ساعة. هذا يمثل أسرع إعداد بروتوكول للعينة TEM المتاحة حاليا في الأدب. الطريقة الموضحة في هذه الدراسة جنبا إلى جنب الميكروويف عينة النبات بمساعدة استعدادا لTEM مع أساليب تلطيخ السلبية التي سمحت تحديد واضح وسريع من TMV الناجم عن التغيرات التركيبية وكيل الفيروسية نفسها. يمكن التحقيق TMV التعديلات التي يسببها التركيبية بعد التشذيب، وتقطيع آخر تلطيخ داخل حوالي 4 ساعات بعد بداية التثبيت في نقل كهربائيترون المجهر. باستخدام عينة بالكامل إعداد وضع تلقائيا الافراج عن الباحث لإجراء تلطيخ السلبية في هذه الأثناء من أجل تحديد حجم وعرض وكيل الفيروسية. وهكذا، يمكننا أن نستنتج أن هذا الأسلوب يسمح للتشخيص واضح وسريع من الأمراض الفيروسية النباتية في يوم واحد نحو نصف وهو أمر ذو أهمية كبيرة لاستخدامها في المستقبل في تجارب الزراعة والعلمية في أمراض النبات النبات. كما يمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لتشخيص السريع للحيوان والأمراض التي تصيب الإنسان لديها إمكانيات كبيرة لتطبيقها في المستقبل في علم الأمراض الطبية والبيطرية.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل صندوق العلوم النمساوية (FWF، P20619 P22988 لوBZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glutaraldehyde | Agar Scientific | R1312 | |
| Osmium tetroxide | Agar Scientific | R1022 | |
| Agar 100 resin | Agar Scientific | R1043 | |
| Dodecenyl succinic anhydride | Agar Scientific | R1051 | |
| Methyl nadic anhydride | Agar Scientific | R1081 | |
| Benzyl dimethylamine | Agar Scientific | R1060 | |
| Lead citrate | Agar Scientific | R1210 | |
| Uranyl acetate | Agar Scientific | R1260A | |
| Phosphotungstic acid | Agar Scientific | R1213 | |
| Formvar | Agar Scientific | R1202 | |
| Leica EM AMW | Leica Microsystems | ||
| Leica (Reichert) Ultratrim | Leica Microsystems | Newer model is available | |
| Leica (Reichert) Ultracut S | Leica Microsystems | Newer model is available | |
| Diatome Ultra 45 | Gröpl | ||
| Philips CM10 TEM | FEI | Newer model is available | |
| Cell D | Olympus Corporation | ||
| Optimas 6.5.1 | Media Cybernetics Inc. | Newer version is available |
References
- Bozzola, J. J., Russell, D. Electron Microscopy. , Jones and Barlett Publishers. Boston. (1999).
- Kuo, J. Processing plant tissues for ultrastructural study. Methods in Molecular Biology, Electron Microscopy, Methods and Protocols. Kuo, J. 369, Humana Press. 47-65 (2007).
- Schroeder, J. A., Gelderblom, H. R., Hauroeder, B., Schmetz, C., Milios, J., Hofstaedter, F. Microwave-assisted tissue processing for sameday EM-diagnosis of potential bioterrorism and clinical samples. Micron. 37, 577-590 (2006).
- Webster, P. Microwave-assisted processing and embedding for transmission electron microscopy. Methods in Molecular Biology, Electron Microscopy, Methods and Protocols. Kuo, J. 369, Humana Press. 47-65 (2007).
- Zechmann, B., Zellnig, G. Microwave assisted rapid plant sample preparation for transmission electron microscopy. J. Microsc. 233, 258-268 (2009).
- Lería, F., Marco, R., Medina, F. J. Structural and antigenic preservation of plant samples by microwave-enhanced fixation, using dedicated hardware, minimizing heat-related effects. Micr. Res. Techniq. 65, 86-100 (2004).
- Giberson, R. T., Austin, R. L., Charlesworth, J., Adamson, G., Herrera, G. A. Microwave and digital imaging technology reduce turnaround times for diagnostic electron microscopy. Ultrastruct. Pathol. 27, 187-196 (2003).
- Cavusoglu, I., Minbay, F. Z., Temel, S. G., Noyan, S. Rapid polymerisation with microwave irradiation for transmission electron microscopy. Eur. J. Morph. 39, 313-317 (2001).
- Ermolina, I., Morgana, H., Greena, N. G., Milnerb, J. J., Feldmanc, Y. Dielectric spectroscopy of tobacco mosaic virus. Biochim. Biophys. Acta. 1622, 57-63 (2003).
- Maeda, H. An atomic force microscopy study for the assembly structures of tobacco mosaic virus and their size evaluation. Langmuir. 13, 4150-4161 (1997).
- Milne, R. G. Multiplication of tobacco mosaic virus in tobacco leaf palisade cells. Virology. 28, 527-532 (1966).
- Reunov, A. V., Gnutova, I. V., Lapshina, L. A. Effect of tobacco mosaic virus strains on the ultrastructure of tobacco leaf parenchymal cells. Biol. Bull. 33, 409-415 (2006).
- Sachse, C., Chen, J. Z., Coureux, P. D., Stroupe, M. E., Fändrich, M., Grigorieff, N. High-resolution electron microscopy of helical specimens: a fresh look at tobacco mosaic virus. J. Mol. Biol. 371, 812-835 (2007).
- Smith, M. L., Lindbo, J. A., Dillard-Telm, S., Brosio, P. M., Lasnik, A. B., McCormick, A. A., Nguyen, L. V., Palmer, K. E. Modified tobacco mosaic virus particles as scaffolds for display of protein antigens for vaccine applications. Virology. 348, 475-488 (2006).
- Zechmann, B., Zellnig, G. Rapid TEM diagnosis of plant virus diseases. J. Virol. Meth. 162, 163-169 (2009).
- Giberson, R. T., Demaree, R. S. Jr Microwave processing techniques for electron microscopy: a four-hour protocol. Meth. Molec. Biol. 117, 145-158 (1999).
