Summary
Это исследование описывает метод, который позволяет быстро и ясно диагностики вирусных заболеваний растений примерно в половине дня с помощью комбинации СВЧ помощь пробоподготовки завод по просвечивающей электронной микроскопии и отрицательные методы окрашивания.
Abstract
Исследования ультраструктурные изменения, вызванные вирусами часто необходимо четко определить вирусных заболеваний растений. С обычной подготовки образцов для просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) таких исследований может занять несколько дней 1,2 и, следовательно, не подходит для экспресс-диагностики болезней растений вирусом. Микроволновая печь фиксации могут быть использованы резко сократить время подготовки образцов для ПЭМ исследования с похожими ультраструктурным результаты наблюдаются после условно подготовки образцов 3-5. Много различных заказу СВЧ-устройств в настоящее время доступны, которые могут быть использованы для успешной фиксации и вложение биологических образцов для исследования TEM 5-8. В этом исследовании мы демонстрируем по борьбе против табака Вирус мозаики (ВТМ), инфицированные растения Nicotiana аЬасит, что это возможно, чтобы диагностировать ультраструктурные изменения в листьях примерно в половине дня с помощью микроволновой помощью подготовки образца для TEM. Мы выбрали для выполнения этого исследования имеющихся в продаже СВЧ устройств, как он выполняет подготовки образца почти полностью автоматически 5 в отличие от других доступных устройств, где много шагов все равно придется выполнять вручную 6-8 и, следовательно, больше времени и трудоемкий. В качестве подготовки проб выполняется полностью автоматически негативного окрашивания вирусных частиц в соке оставшиеся ВТМ-инфицированных листьев и следующее рассмотрение ультраструктуры и размеры могут быть выполнены во время фиксации и вложения.
Protocol
Микроволновая печь помощь пробоподготовки
- Перед началом подготовки образца нужны для программирования автоматического процессор ткани микроволновую печь для электронного микроскопа (Leica EM AMW, Leica Microsystems, Вена, Австрия) со следующими протоколами (табл. 1) для микроволновой помощью подготовки образцов для TEM:
Таблица 1. Протокол для пробоподготовки с использованием микроволнового облучения. Различных столбцах (слева направо):- Флакон номер (флакон Тел.) Представляет собой порядок, в котором флакон загружается в карусель процессора.
- Шаг самого процесса.
- Реагенты в ампулах.
- Продолжительность фактического шага.
- Максимальная температура, которая достигается во флаконе до микроволнового облучения выключен.
- Микроволновое облучение установка: Непрерывная = быстрое приращение температурыаза, держа заданной температуры; Наклон = нежным повышение температуры, конечная температура достигается в конце; Импульсные = Быстрое повышение температуры, питание выключается, пока температура не упала 5 ° C, питание возобновилось достичь температуры.
- Максимальная мощность СВЧ-излучения.
- Свежий приготовления растворов для различных шагов, описанных в протоколе подготовки образца (для Agar 100 эпоксидной смолы см. п. 1.7), заполнить их в назначенный флаконов в соответствии с запрограммированной протокола (табл. 1), загрузить флаконов на карусели, а затем вставьте Карусель в процессор микроволновой ткани, и, наконец, загрузить первый флакон в моно-режиме камеры.
- Вырежьте небольшие участки листьев (1 мм 2) из Nicotiana аЬасит инфицированных Вирус табачной мозаики (ВТМ) с лезвием на тарелку моделирования воском в капле 3% глутарового альдегида (агар Научно ООО, Станстед, Англия) в 60мм Серенсен фосфатного буфера (рН 7,2) при комнатной температуреerature.
- Передача участков с тонкой пинцетом сразу в назначенное корзин с ячейками шириной около 200 мкм. Стек корзины друг на друга и вставить их в моно-режиме камеры. Необходимо позаботиться о том, что образцы постоянно покрыта фиксатором решение во время погрузки и укладки корзины так, чтобы они не высыхали.
- Начать ранее запрограммированных микроволновой помощью протокола подготовки проб для фиксации, дегидратации и инфильтрации.
- В то время как подготовка проб производится автоматически процессором ткани микроволновой продолжать с отрицательной окраской оставшиеся растительного материала, как описано в разделе 3 (отрицательная окраска).
- Свежий подготовить агар 100 эпоксидных смол путем смешивания следующих компонентов, как описано: 24g заливки агар 100, 16г додеценил янтарного ангидрида и 10 г метил nadic ангидрида (для всех компонентов см. Агар Научно ООО, Станстед, Англия) в пластиковый стаканчик, тепло его40 ° C и хорошо перемешать. Добавить 1,2 г бензил-диметиламин и тщательно перемешайте. Заполните Агар 100 эпоксидной смолы в назначенное полимеризации образует как раз перед протоколом подготовки проб подходит к концу (например, при шаге 22 в таблице 1).
- После завершения протокола (после шага 22 в таблице 1) освободить сложены корзины содержащие проникли образцы из моно-режиме камера в последний флакон карусели. Снимите карусель из микроволновой печи устройства, поместить значение корзины и загрузить их с помощью пинцета штрафа в назначенное формы полимеризации. Необходимо позаботиться о том, что образцы всегда покрыта Агар 100 эпоксидной смолы во время unstacking и загрузки так, чтобы они не высыхали.
- Стек полимеризации формы друг на друга. Необходимо позаботиться о том, что образцы всегда покрыта Агар 100 эпоксидной смолы во время укладки и загрузки так, чтобы они не высыхали.
- Удалите ранее использовали флаконы из карусели СВЧ Tissие процессор, загрузить его с сложены корзины и вставить карусель в процессор ткани микроволновой печи.
- Начать ранее запрограммированных полимеризации протокол (таблица 1).
- В то время как полимеризация осуществляется автоматически с помощью процессора ткани микроволновая печь, изучить негативно окрашенных сеток с просвечивающего электронного микроскопа [например, Philips CM10 TEM, FEI (бывший Philips), Эйндховен, Нидерланды] и выполняет анализ изображения, как описано в разделе 3 и 4 ( негативного окрашивания и анализа изображений).
- После того, как протокол закончили удалить полимеризации формы из моно-режиме камера, поместить значение полимеризации формы и удалить полимеризованный блоки, содержащие образцы. Теперь они готовы быть с разрезом микротоме.
2. Обрезка и секционирования
- Вставьте один или несколько блоков в отдельные держатели образца для ультратонких срезов с образцов на вершине прилипания около 1 см из держателя.
- Обрезка блока с образцом триммер для TEM (например, Leica Reichert Ultratrim, Leica Microsystems), так что блок лицом макс. 1 мм в длину и 200 мкм в ширину, которая содержит столько же листьев материала возможна достигается (блок лице размер может нуждаться в корректировке размера алмазного ножа).
- Раздел блок с ультрамикротомом (например, Reichert Ultracut Leica S, Leica Microsystems) с помощью алмазного ножа на нож под углом 45 ° (например, Diatome Ultra 45, Gröpl, Tulln, Австрия). Раздел толщина должна быть скорректирована с 70 до 90 нм и скорость резки должна быть около 1 мм / с. Возьмите несколько разделов с формвар (агар Научно ООО) с покрытием медью или никелем 200 квадратных защитной сетки.
- После окраски секций на сетке с цитратом свинца (Агар ООО Научно; 1.1g цитратом свинца, растворенных в 42 мл дистиллированной воды и 8 мл 1N NaOH) в течение 5 минут в чашке Петри частично заполненный NaOH для создания CO 2-бесплатно окружающей среды и на 15 мильnutes с 1% уранилацетата (агар Научно ООО) растворяют в дистиллированной воде при комнатной температуре. Мыть сетки с дистиллированной воде в течение 1 минуты между каждой должности окрашивания шаг. Воздух сухой сетки в сетку окна.
- Изучите разделы с просвечивающего электронного микроскопа (например, Philips CM10 TEM, FEI, Эйндховен, Нидерланды).
3. Отрицательные окрашивания
- Урожай о 100мг ВТМ-инфицированного материала листа и подготовка сырой сок путем гомогенизации материала в течение 2 минут с лезвием на предметное стекло микроскопа в 100 мкл 60 мм Søfrensen фосфатного буфера (рН 7,2).
- Передача 20 мкл полученного гомогената на первую лунку с тефлоновым покрытием стекло микроскопа с 4 и более скважин (в качестве альтернативы можно также передать гомогената на кусок парафильмом).
- Поместите формвар покрытием сетки в верхней части гомогената с формвар (агар Научно ООО) покрытием стороне, обращенной к капле и инкубаторыуменьшать ее в течение 5 минут.
- Промойте сетку 2 раза по 2 минуты каждый, поставив сетку сверху две капли 200 мкл 60 мм Серенсен фосфатного буфера (рН 7,2).
- Инкубируйте сетке в течение 1 минуты с свежеприготовленного 2% фосфорно-вольфрамовой кислоты (агар Научно ООО) раствора в 60 мм Серенсен фосфатного буфера (рН 6,5).
- Снимите сетку и дайте ему высохнуть на воздухе в сетке окна.
- Изучите сетку с просвечивающего электронного микроскопа (например, Philips CM10 ТЕМ, FEI, Эйндховен, Нидерланды). Взять хотя бы 10 изображений случайно выбранных негативно окрашенных вирионов (по крайней мере 10 или более вирионов должны быть видны на каждом изображении) с просвечивающего электронного микроскопа при первичном увеличении 21000X или выше. Необходимо соблюдать осторожность, что все изображения имеют одинаковый увеличения.
4. Анализ изображений
- Измерьте длину и ширину не менее 100 случайно выбранных отдельные частицы вируса на микрофотографии взята изнегативно окрашенных образцов с помощью любого компьютера, программного обеспечения для анализа изображений [например, сотового D (Olympus, жизни и наук о материалах Europe GmbH, Гамбург, Германия) с помощью инструмента анализа частиц или Optimas-6.5.1 (Media кибернетики Inc, Bethesda, Maryland, США)].
- Рассчитать средние и стандартные отклонения для достижения средней длины и ширины вирусных частиц визуализировали отрицательные методы окрашивания и ТЕА.
- Сравните длину и ультраструктурные особенности (получено в 2,5) с размерами вирусов и ультраструктурные изменения индуцированных вирусом заболеваний, известных в литературе, с тем чтобы четко определить вирусных заболеваний.
5. Представитель результаты:
После микроволновой подготовки проб помощью типичных ВТМ-индуцированной ультраструктурные изменения, такие как большие районы, содержащие вирионы расположены параллельно форму можно было наблюдать с просвечивающей электронной микроскопии в цитоплазме зараженных курильщикаЬасит клетки (рис. 1А). Кроме того, в сырой сок ВТМ-инфицированных листьев ВТМ частиц можно было наблюдать, как извилистые, палочковидные структуры после негативного окрашивания (рис. 1б). Анализ изображений из 100 вирусных частиц показал средний размер для ВТМ из 280 нм в длину и в ширину 17nm (рис. 2). Ультраструктуры ВТМ-инфицированных клеток и размер вирионов, наблюдавшиеся в этом исследовании было установлено, что в соответствии с ВТМ-индуцированной ультраструктурным свойства табака и диапазон размеров частиц ВТМ ранее сообщалось в литературе 9-15.
Рисунок 1. Просвечивающей электронной микроскопии ВТМ-инфицированных клеток листьев и вирионов. А) На рисунке показан ультраструктуры ВТМ-инфицированных мезофилла листьев клетки Nicotiana аЬасит после микроволновой подготовки проб помощью растений. Обратите внимание на большой площади параллельно соответствие вирионов, которые накапливаются в цитозоле.C = хлоропластов с крахмалом (St), M = митохондрии, N = ядро, V = вакуоль, Bar = 2 мкм. B) изображения показывает, вирионы которых были обнаружены негативного окрашивания в соке пораженных листьев.
Рисунок 2. Относительный размер вирионов. Относительное распределение длины и ширины ВТМ-частиц после негативного окрашивания сока зараженные листья, как они появились в электронный микроскоп. Средние значения (средняя длина / ширина ± стандартное отклонение) были рассчитаны от 100 вирионов.
Discussion
Микроволновая печь помощью подготовки образца установки для TEM было доказано на поставку быстрый и надежный ультраструктурным данных в течение нескольких часов 3,4,16. Тонких структурных сохранение органелл и мембран достигается с методом, использованным в данном исследовании была похожа на обычные и cryofixed образцы 5,15 с преимуществом массовые сокращения в образце фиксации и вложения времени от 3 дней или дольше 2 часов. Это представляет собой самый быстрый протокол подготовки образцов для ПЭМ в настоящее время в литературе. Метод, описанный в данном исследовании в сочетании микроволновой подготовки проб помощью установки для TEM с отрицательным методы окрашивания, который позволил четко и быстрой идентификации ВТМ-индуцированной ультраструктурные изменения и вирусных агентов себя. ВТМ, индуцированной ультраструктурные изменения могут быть исследованы после обрезки, секционирования и после окрашивания в течение 4 часов после начала фиксации в передаче электроновэлектронного микроскопа. Использование полностью автоматическом режиме подготовки образца освободил исследователя для проведения негативного окрашивания в промежуточный для того, чтобы определить размер и ширину вирусного агента. Таким образом, мы можем заключить, что этот метод позволяет четко и экспресс-диагностики вирусных заболеваний растений примерно в половине дня, который имеет большое значение для будущего использования в сельском хозяйстве и научных экспериментов на заводе фитопатологии. Поскольку этот метод также может быть использован для экспресс-диагностики человека и животных заболеваний она имеет большой потенциал для будущего применения в медицинской и ветеринарной патологии.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Австрийским научным фондом (FWF, P20619 и P22988 для BZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glutaraldehyde | Agar Scientific | R1312 | |
| Osmium tetroxide | Agar Scientific | R1022 | |
| Agar 100 resin | Agar Scientific | R1043 | |
| Dodecenyl succinic anhydride | Agar Scientific | R1051 | |
| Methyl nadic anhydride | Agar Scientific | R1081 | |
| Benzyl dimethylamine | Agar Scientific | R1060 | |
| Lead citrate | Agar Scientific | R1210 | |
| Uranyl acetate | Agar Scientific | R1260A | |
| Phosphotungstic acid | Agar Scientific | R1213 | |
| Formvar | Agar Scientific | R1202 | |
| Leica EM AMW | Leica Microsystems | ||
| Leica (Reichert) Ultratrim | Leica Microsystems | Newer model is available | |
| Leica (Reichert) Ultracut S | Leica Microsystems | Newer model is available | |
| Diatome Ultra 45 | Gröpl | ||
| Philips CM10 TEM | FEI | Newer model is available | |
| Cell D | Olympus Corporation | ||
| Optimas 6.5.1 | Media Cybernetics Inc. | Newer version is available |
References
- Bozzola, J. J., Russell, D. Electron Microscopy. , Jones and Barlett Publishers. Boston. (1999).
- Kuo, J. Processing plant tissues for ultrastructural study. Methods in Molecular Biology, Electron Microscopy, Methods and Protocols. Kuo, J. 369, Humana Press. 47-65 (2007).
- Schroeder, J. A., Gelderblom, H. R., Hauroeder, B., Schmetz, C., Milios, J., Hofstaedter, F. Microwave-assisted tissue processing for sameday EM-diagnosis of potential bioterrorism and clinical samples. Micron. 37, 577-590 (2006).
- Webster, P. Microwave-assisted processing and embedding for transmission electron microscopy. Methods in Molecular Biology, Electron Microscopy, Methods and Protocols. Kuo, J. 369, Humana Press. 47-65 (2007).
- Zechmann, B., Zellnig, G. Microwave assisted rapid plant sample preparation for transmission electron microscopy. J. Microsc. 233, 258-268 (2009).
- Lería, F., Marco, R., Medina, F. J. Structural and antigenic preservation of plant samples by microwave-enhanced fixation, using dedicated hardware, minimizing heat-related effects. Micr. Res. Techniq. 65, 86-100 (2004).
- Giberson, R. T., Austin, R. L., Charlesworth, J., Adamson, G., Herrera, G. A. Microwave and digital imaging technology reduce turnaround times for diagnostic electron microscopy. Ultrastruct. Pathol. 27, 187-196 (2003).
- Cavusoglu, I., Minbay, F. Z., Temel, S. G., Noyan, S. Rapid polymerisation with microwave irradiation for transmission electron microscopy. Eur. J. Morph. 39, 313-317 (2001).
- Ermolina, I., Morgana, H., Greena, N. G., Milnerb, J. J., Feldmanc, Y. Dielectric spectroscopy of tobacco mosaic virus. Biochim. Biophys. Acta. 1622, 57-63 (2003).
- Maeda, H. An atomic force microscopy study for the assembly structures of tobacco mosaic virus and their size evaluation. Langmuir. 13, 4150-4161 (1997).
- Milne, R. G. Multiplication of tobacco mosaic virus in tobacco leaf palisade cells. Virology. 28, 527-532 (1966).
- Reunov, A. V., Gnutova, I. V., Lapshina, L. A. Effect of tobacco mosaic virus strains on the ultrastructure of tobacco leaf parenchymal cells. Biol. Bull. 33, 409-415 (2006).
- Sachse, C., Chen, J. Z., Coureux, P. D., Stroupe, M. E., Fändrich, M., Grigorieff, N. High-resolution electron microscopy of helical specimens: a fresh look at tobacco mosaic virus. J. Mol. Biol. 371, 812-835 (2007).
- Smith, M. L., Lindbo, J. A., Dillard-Telm, S., Brosio, P. M., Lasnik, A. B., McCormick, A. A., Nguyen, L. V., Palmer, K. E. Modified tobacco mosaic virus particles as scaffolds for display of protein antigens for vaccine applications. Virology. 348, 475-488 (2006).
- Zechmann, B., Zellnig, G. Rapid TEM diagnosis of plant virus diseases. J. Virol. Meth. 162, 163-169 (2009).
- Giberson, R. T., Demaree, R. S. Jr Microwave processing techniques for electron microscopy: a four-hour protocol. Meth. Molec. Biol. 117, 145-158 (1999).
