Summary
Bu çalışma, transmisyon elektron mikroskobu ve negatif boyama yöntemleri için mikrodalga destekli bitki numune hazırlama kombinasyonu kullanarak yaklaşık yarım gün bitki virüs hastalıklarının hızlı ve net bir teşhis sağlayan bir yöntem açıklanır.
Abstract
Virüsler tarafından oluşturulan ultrastrüktürel değişikliklerin incelenmesi genellikle açıkça Bitkilerde viral hastalıkların saptanması için gereklidir. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) için geleneksel numune hazırlama ile bu soruşturmaların birkaç gün 1,2 alabilir ve bu nedenle bitki virüs hastalıklarının hızlı tanı için uygun değildir. Mikrodalga tespit ölçüde geleneksel numune hazırlama 3-5 sonra gözlemlenen ile benzer sonuçlar ile ince yapı TEM incelemeler için numune hazırlama süresini azaltmak için kullanılabilir. Birçok farklı ölçüye mikrodalga cihazlar başarılı tespit ve TEM araştırmalar 5-8 için biyolojik numunelerin gömülmesi için kullanılabilecek şu anda mevcuttur. Bu çalışmada Tütün Mozaik Virüsü göstermektedirler (TMV) o T mikrodalga destekli numune hazırlama ile yaklaşık yarım gün içinde yapraklarda ultrastrüktürel değişiklikler teşhis etmek mümkün olduğunu Nicotiana tabacum bitkileri enfekteEM. Birçok adımlar yine elle 6-8 yapılmak zorundadır ve bu nedenle daha fazla zaman ve emek alıcı olan diğer mevcut cihazlar aksine neredeyse tamamen otomatik olarak 5 numune hazırlama yapar gibi biz piyasada satılan bir mikrodalga cihazı ile bu çalışma gerçekleştirmek için seçtiniz. Numune hazırlama kalan TMV-enfekte yaprakları ve ince yapısı ve boyutu, aşağıdaki inceleme sap içinde viral parçacıkların tam otomatik olarak negatif boyama gerçekleştirilir olarak tespit ve gömme sırasında gerçekleştirilebilir.
Protocol
Mikrodalga destekli numune hazırlama
- Numune hazırlama birinin başlangıç elektron mikroskobu için otomatik mikrodalga doku işlemci (Leica EM AMW; Leica Microsystems, Viyana, Avusturya) programlamak gerekiyor önce TEM için mikrodalga destekli numune hazırlama için aşağıdaki protokolleri (Tablo 1):
Tablo 1. Mikrodalga radyasyon kullanarak numune hazırlama için protokol. Farklı sütunlar (soldan sağa) gösterir:- Vial numarası (Vial no.) Şişenin işlemcinin atlıkarınca içine yüklenir sırasını temsil eder.
- Gerçek sürecinin Adım.
- Flakonlarda Reaktifler.
- Gerçek adım süresi.
- Mikrodalga ışınlama kapatılmadan önce flakon içinde ulaşılır maksimum sıcaklık.
- Mikrodalga radyasyon ayar: Sürekli = hızlı sıcaklık artışlarlaase, ayarlanan sıcaklık tutarak; Eğim = nazik sıcaklık artışı, sonunda ulaşılan nihai sıcaklığı; sıcaklığı 5 düştü kadar Atımlı = Hızlı sıcaklık artışı, güç kapatıldığında ° C, güç sıcaklığa ulaşmak için yeniden başladı.
- Mikrodalga radyasyonun Maksimum güç.
- Taze numune hazırlama protokolü (Agar 100 epoksi reçine için 1.7 'ye bakınız) açıklanan farklı adımları için çözümler hazırlamak, programlanan protokolü (Tablo 1) göre belirlenen şişeleri içine doldurun, atlıkarınca şişeleri yükleyin, ardından eklemek mikrodalga doku işlemci, ve içine carousel nihayet monomod odasına ilk flakon yükleyin.
- 60mm Sørensen% 3 glutaraldehit (Agar Bilimsel Ltd, Stansted, İngiltere) bir damla bir modelleme mumu plaka üzerinde bir jilet ile Tütün Mozaik Virüsü (TMV) ile enfekte Nicotiana tabacum yapraklarını küçük bölümler (1mm 2) Kes Oda sıcaklığında fosfat tampon maddesi (pH 7.2)erature.
- Hemen yaklaşık 200μm bir örgü genişliği ile belirlenen sepet içerisine ince cımbız ile bölümleri aktarın. Birbirlerinin üstüne sepetleri Yığın ve monomod odasının içine yerleştirin. Bakım örnekleri sürekli kurumasını yok ki yükleme ve sepetleri istifleme sırasında fiksatif solüsyonu ile kaplıdır dikkat edilmelidir.
- Fiksasyon, dehidratasyon ve infiltrasyon için önceden programlanmış mikrodalga destekli numune hazırlama protokolü başlatın.
- Numune hazırlama mikrodalga doku işlemci tarafından otomatik olarak gerçekleştirilir iken bölüm 3 (negatif boyanma) açıklandığı gibi kalan bitki materyali ile negatif boyanma ile devam edin.
- Plastik bir kap içinde dolgu 24g Agar 100, 16g dodecenyl süksinik anhidrit ve 10 g metil nadic anhidrit (tüm bileşenler için Agar Bilimsel Ltd, Stansted, İngiltere bakınız), ısı: Taze aşağıdaki bileşenleri tarif gibi karıştırılarak Agar 100 epoksi reçine hazırlamak buna40 ° C ve iyice karıştırın. Benzil dimetilamin 1.2g ekleyin ve iyice karıştırın. Numune hazırlama protokolü sona (örneğin masa 1 adım 22 sırasında) gelir hemen önce belirlenen polimerizasyon içine Agar 100 epoksi reçine doldurun oluşturur.
- Protokol tamamlandıktan sonra (tablo 1'de basamak sonra 22) monovalent odasından gelen atlıkarınca son şişenin içine sızma numuneleri içeren yığın sepet bırakın. Mikrodalga cihazdan atlıkarınca çıkarın, sepetler Unstack ve belirlenen polimerizasyon formları içine ince cımbız kullanarak bunları yükleyebilirsiniz. Bakım örnekleri her zaman unstacking ve kurumasını yok ki yükleme sırasında Agar 100 epoksi reçine ile kaplıdır dikkat edilmelidir.
- Birbirlerinin üstüne polimerizasyon formları yığını. Bakım örnekleri her zaman istifleme ve kurumasını yok ki yükleme sırasında Agar 100 epoksi reçine ile kaplıdır dikkat edilmelidir.
- Mikrodalga tiss bir atlıkarınca daha önce kullanılmış şişeleri kaldırue işlemci, yığılmış sepetleri ile yükleyebilirsiniz ve mikrodalga doku işlemci içine carousel yerleştirin.
- Önceden programlanmış polimerizasyon protokolü (tablo 1) başlatın.
- Polimerizasyon mikrodalga doku işlemci tarafından otomatik olarak yapılır iken, bir transmisyon elektron mikroskobu ile negatif boyanmış parmaklıkları incelemek [örneğin Philips CM10 TEM, FEI (eski Philips), Eindhoven, Hollanda] ve bölüm 3 ve 4 (açıklandığı gibi görüntü analizleri Negatif boyama ve görüntü analizi).
- Protokol Unstack, monovalent odasından gelen polimerizasyon biçimleri polimerizasyon biçimleri kaldırmak ve numuneler içeren polimerize bloklar kaldırmak tamamlandıktan sonra. Onlar şimdi bir mikrotom ile kesitli olmaya hazırız.
2. Kırpma ve kesit
- Ultra ince tutucu yaklaşık yapışma üst üzerinde numune ile 1cm üzerinden kesit için ayrı numune tutucular içine bir veya daha fazla blok yerleştirin.
- TEM (örneğin Leica Reichert Ultratrim; Leica Microsystems) için bir örnek düzeltici ile blok Trim böylece maksimum blok yüzü. Uzunluğu ve (yüz boyutu bloke elmas bıçak boyutuna ayarlanması gerekebilir) elde edilir mümkün olduğu kadar yaprak malzeme içeren genişlikte 200μm 1mm.
- 45 ° (örn. Diyatomelere Ultra 45, Gröpl, Tulln, Avusturya) bir bıçak açıda bir elmas bıçak kullanarak; bir ultramicrotome (Leica Microsystems örneğin Reichert Leica ULTRACUT S) ile Bölüm bloğu. Kısım kalınlığı yaklaşık 70 ila 90 nm olacak şekilde ayarlanmalıdır ve kesme hızı 1 mm / s civarında olmalıdır. Bir formvar (Agar Bilimsel Ltd) kaplı bakır veya nikel 200 kare mesh ızgara ile birden çok bölüm toplayınız.
- Kısmen 2-ücretsiz CO oluşturmak için NaOH ile dolu bir petri 5 dakika; kurşun sitrat (42ml çift distile su ve 8ml 1N NaOH içinde çözülmüş 1.1 g kurşun sitrat Agar Bilimsel Ltd) ile ızgara üzerinde bölümler Post-leke çevre ve 15 mil için% 1 uranil asetat (Agar Scientific Ltd) ile nutes oda sıcaklığında damıtılmış su içinde çözülmüştür. Her post-boyama adım arasında 1 dakika için damıtılmış su ile ızgaraları yıkayın. Hava bir ızgara kutusuna ızgaraları kurutun.
- Bir transmisyon elektron mikroskobu (örneğin Philips CM10 TEM, FEI, Eindhoven, Hollanda) ile bölümleri inceleyin.
3. Negatif boyama
- TMV ile enfekte yaprak malzeme 100mg hakkında ve 60mm Søfrensen fosfat tamponu (pH 7.2) 100μl bir mikroskop lamı üzerine bir jilet ile 2 dakika boyunca malzeme homojenize ham sap hazırlamak Hasat.
- 4 ya da daha çok kuyucuk (alternatif olarak parafilm bir parça üzerinde homojenat aktarmak mümkündür) bir teflon kaplı mikroskop slaytı iyi ilk üzerine çıkan Homojenat 20uL aktarın.
- Damla ve incu dönük formvar (Agar Bilimsel Ltd) kaplamalı yüzü Homojenat üstüne formvar kaplı ızgara yerleştirin5 dakika boyunca kesmek.
- 200μl 60mm Sørensen fosfat tampon maddesi (pH 7.2) ve iki damla üzerinde ızgara yerleştirerek ızgara 2 dakika için 2 defa yıkanır.
- Bir taze hazırlanmış% 2 fosfotungstik asit (Agar Scientific Ltd) 60mm Sørensen fosfat tampon maddesi (pH 6.5) içinde çözelti ile 1 dakika için ızgara inkübe edin.
- Izgara çıkarın ve bir ızgara kutusuna kurumaya bırakın.
- Bir transmisyon elektron mikroskobu (; FEI, Eindhoven, Hollanda örneğin Philips CM10 TEM) ile ızgara inceleyin. 21000X veya daha yüksek bir primer büyütmede transmisyon elektron mikroskobu ile rastgele seçilen olumsuz lekeli virionlar en az 10 görüntü (en az 10 veya daha fazla virionlar her görüntü üzerinde görünür olmalıdır) atın. Bakım tüm görüntüler de aynı büyütme olduğunu alınmalıdır.
4. Görüntü analizi
- Alınan mikrografları, üzerinde en azından 100 rasgele seçilmiş tek bir virüs partiküllerinin uzunluğu ve genişliği ölçülürherhangi bir görüntü analizi bilgisayar yazılımı kullanarak olumsuz lekeli örnekleri partikül analizi aracı veya Optimas ile [örneğin Hücre D (Olympus, Yaşam ve Malzeme Bilimleri Europe GmbH, Hamburg, Almanya) 6.5.1-(Medya Sibernetik Inc, Bethesda, Maryland, USA)].
- Negatif boyama yöntemleri ve TEM ile görselleştirilmiş virüs partiküllerinin bir ortalama uzunluk ve genişlik elde etmek için ortalama ve standart sapma hesaplanır.
- Açıkça virüs hastalıkları belirlemek için, literatürde bilinen virüs hastalıkları tarafından uyarılan virüsler ve yapısal değişikliklerin bir uzunluk boyutlarına sahip ve yapısal özellikleri (2.5 de elde edilmiştir) karşılaştırın.
5. Temsilcisi sonuçları:
Gibi mikrodalga destekli numune hazırlama tipik TMV indüklenen ultrastrüktürel değişiklikler sonra paralel biçimde hizalanmış virionlar içeren geniş alanlar enfekte Nicotian arasında sitoplazmada transmisyon elektron mikroskobu ile gözlenebilirbir tabacum hücreleri (Şekil 1A). Ayrıca TMV ile enfekte olan ham sap TMV parçacıklar negatif boyanma sonra kıvrımlı, çubuk şeklindeki yapılar (Şekil 1B) olarak gözlenebilir bırakır. 100 virüs partiküllerinin Görüntü analizi uzunluk ve genişlik olarak 17nm olarak 280 nm (Şekil 2) TMV bir ortalama boyutu ortaya çıkardı. TMV ile enfekte olmuş hücrelerine Bu çalışmada gözlenen virionlar ebadında bir ince yapı TMV parçacıkların tütün ve boyut aralığı içinde TMV bağlı ince yapı özelliklerine uygun olarak, daha önce literatürde bildirilen 9-15 olduğu tespit edilmiştir.
TMV ile enfekte yaprak hücreleri ve virionlar Şekil 1. Transmisyon elektron mikroskop. A) Görüntü Nicotiana tabacum mikrodalga destekli bitki numune hazırlama sonrası TMV ile enfekte mezofil yaprak hücrelerinin ince yapısı gösterir. Sitoplazmada biriken paralel hizalanmış virionlar geniş alana dikkat.C nişasta = kloroplast (St), M = Mitokondri, N = nükleus, V = vakuol, Bar = 2μm. B) Görüntü enfekte yaprakların sap negatif boyanma tespit edildi virionlar gösterir.
Şekil 2. Virionlar nispi büyüklüğü. Uzunluğu ve negatif boyanma onlar elektron mikroskobu göründüğü gibi enfekte yaprakların sap sonra TMV-parçacıkların genişliği Göreli dağılımı. (Uzunluk / genişlik ortalama ± standart sapma) değerleri ortalamaları 100 virionlar hesaplandı.
Discussion
TEM için Mikrodalga destekli bitki numune hazırlama birkaç saat 3,4,16 içinde hızlı ve güvenilir ultrastrüktürel verilerini sağlamak için kanıtlanmıştır. Bu çalışmada kullanılan yöntem ile elde organelleri ve membranlar ince yapısal korunması örnek fiksasyon muazzam bir azalma avantajı ile 5,15 konvansiyonel ve cryofixed örnekleri benzer ve yaklaşık 2 saat 3 gün veya daha uzun zaman almasi. Bu, literatürde mevcut TEM için hızlı numune hazırlama protokol temsil eder. Bu çalışmada açıklanan yöntemi TMV bağlı ultrastrüktürel değişiklikler ve viral ajan kendisini açık ve hızlı kimlik izin negatif boyama yöntemleri ile TEM için mikrodalga destekli bitki numune hazırlama birleştirdi. TMV indüklenen ultrastrüktürel değişiklikler transmisyon elektrik fiksasyon başlangıcından sonra yaklaşık 4 saat içinde, kırpma kesit ve post-boyama sonra incelenmiştir olabilirtron mikroskop. Tam otomatik numune hazırlama modunun kullanılması viral ajan boyutu ve genişliğini belirlemek için geçici olarak negatif boyama yapmak için araştırmacı bırakılmış. Böylece, bu yöntem bitki fitopatolojinin tarım ve bilimsel deneyler ileride kullanmak için büyük önem taşımaktadır yaklaşık yarım gün bitki virüs hastalıklarının net ve hızlı tanı sağlar sonucuna varabiliriz. Bu yöntem, aynı zamanda, insan ve hayvan hastalıklarının hızlı teşhis için kullanılabilir gibi tıp ve veteriner patoloji, gelecekteki kullanım için büyük bir potansiyele sahiptir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, Avusturya Bilim Fonu'nun (FWF P20619 ve BZ için P22988) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glutaraldehyde | Agar Scientific | R1312 | |
| Osmium tetroxide | Agar Scientific | R1022 | |
| Agar 100 resin | Agar Scientific | R1043 | |
| Dodecenyl succinic anhydride | Agar Scientific | R1051 | |
| Methyl nadic anhydride | Agar Scientific | R1081 | |
| Benzyl dimethylamine | Agar Scientific | R1060 | |
| Lead citrate | Agar Scientific | R1210 | |
| Uranyl acetate | Agar Scientific | R1260A | |
| Phosphotungstic acid | Agar Scientific | R1213 | |
| Formvar | Agar Scientific | R1202 | |
| Leica EM AMW | Leica Microsystems | ||
| Leica (Reichert) Ultratrim | Leica Microsystems | Newer model is available | |
| Leica (Reichert) Ultracut S | Leica Microsystems | Newer model is available | |
| Diatome Ultra 45 | Gröpl | ||
| Philips CM10 TEM | FEI | Newer model is available | |
| Cell D | Olympus Corporation | ||
| Optimas 6.5.1 | Media Cybernetics Inc. | Newer version is available |
References
- Bozzola, J. J., Russell, D. Electron Microscopy. , Jones and Barlett Publishers. Boston. (1999).
- Kuo, J. Processing plant tissues for ultrastructural study. Methods in Molecular Biology, Electron Microscopy, Methods and Protocols. Kuo, J. 369, Humana Press. 47-65 (2007).
- Schroeder, J. A., Gelderblom, H. R., Hauroeder, B., Schmetz, C., Milios, J., Hofstaedter, F. Microwave-assisted tissue processing for sameday EM-diagnosis of potential bioterrorism and clinical samples. Micron. 37, 577-590 (2006).
- Webster, P. Microwave-assisted processing and embedding for transmission electron microscopy. Methods in Molecular Biology, Electron Microscopy, Methods and Protocols. Kuo, J. 369, Humana Press. 47-65 (2007).
- Zechmann, B., Zellnig, G. Microwave assisted rapid plant sample preparation for transmission electron microscopy. J. Microsc. 233, 258-268 (2009).
- Lería, F., Marco, R., Medina, F. J. Structural and antigenic preservation of plant samples by microwave-enhanced fixation, using dedicated hardware, minimizing heat-related effects. Micr. Res. Techniq. 65, 86-100 (2004).
- Giberson, R. T., Austin, R. L., Charlesworth, J., Adamson, G., Herrera, G. A. Microwave and digital imaging technology reduce turnaround times for diagnostic electron microscopy. Ultrastruct. Pathol. 27, 187-196 (2003).
- Cavusoglu, I., Minbay, F. Z., Temel, S. G., Noyan, S. Rapid polymerisation with microwave irradiation for transmission electron microscopy. Eur. J. Morph. 39, 313-317 (2001).
- Ermolina, I., Morgana, H., Greena, N. G., Milnerb, J. J., Feldmanc, Y. Dielectric spectroscopy of tobacco mosaic virus. Biochim. Biophys. Acta. 1622, 57-63 (2003).
- Maeda, H. An atomic force microscopy study for the assembly structures of tobacco mosaic virus and their size evaluation. Langmuir. 13, 4150-4161 (1997).
- Milne, R. G. Multiplication of tobacco mosaic virus in tobacco leaf palisade cells. Virology. 28, 527-532 (1966).
- Reunov, A. V., Gnutova, I. V., Lapshina, L. A. Effect of tobacco mosaic virus strains on the ultrastructure of tobacco leaf parenchymal cells. Biol. Bull. 33, 409-415 (2006).
- Sachse, C., Chen, J. Z., Coureux, P. D., Stroupe, M. E., Fändrich, M., Grigorieff, N. High-resolution electron microscopy of helical specimens: a fresh look at tobacco mosaic virus. J. Mol. Biol. 371, 812-835 (2007).
- Smith, M. L., Lindbo, J. A., Dillard-Telm, S., Brosio, P. M., Lasnik, A. B., McCormick, A. A., Nguyen, L. V., Palmer, K. E. Modified tobacco mosaic virus particles as scaffolds for display of protein antigens for vaccine applications. Virology. 348, 475-488 (2006).
- Zechmann, B., Zellnig, G. Rapid TEM diagnosis of plant virus diseases. J. Virol. Meth. 162, 163-169 (2009).
- Giberson, R. T., Demaree, R. S. Jr Microwave processing techniques for electron microscopy: a four-hour protocol. Meth. Molec. Biol. 117, 145-158 (1999).
