Summary
Deze studie beschrijft een methode die de snelle en duidelijke diagnose van plantaardige virusziekten in ongeveer een halve dag maakt door gebruik te maken van een combinatie van microgolf-geassisteerde fabriek monstervoorbereiding voor transmissie-elektronenmicroscopie en negatieve kleuring methoden.
Abstract
Onderzoek van ultrastructurele veranderingen geïnduceerd door virussen zijn vaak nodig om duidelijk virale ziekten bij planten. Bij conventionele monstervoorbereiding voor transmissie elektronenmicroscopie (TEM) onderzoeken kan bijvoorbeeld enkele dagen 1,2 en zijn daarom niet geschikt voor een snelle diagnose van plantaardige virusziekten. Magnetron fixatie kan worden gebruikt om drastische vermindering monstervoorbereiding tijd voor TEM onderzoek met gelijke ultrastructurele resultaten waargenomen na conventioneel monstervoorbereiding 3-5. Verschillende maat magnetrons beschikbaar die kunnen worden gebruikt voor de succesvolle bevestiging en verankering van biologische monsters voor TEM onderzoek 5-8. In deze studie demonstreren op Tobacco Mosaic Virus (TMV) geïnfecteerd Nicotiana tabacum planten die het mogelijk is ultrastructurele veranderingen in bladeren diagnose in een halve dag met microgolf-geassisteerde monstervoorbereiding voor TEM. Wij hebben besloten om deze studie met een in de handel verkrijgbare magnetron-toestel als hij presteert monstervoorbereiding bijna volledig automatisch 5 in tegenstelling tot de andere beschikbare apparaten waar vele stappen nog handmatig 6-8 worden uitgevoerd en dus meer tijd en arbeidsintensief. Zoals monstervoorbereiding is uitgevoerd volautomatisch negatieve kleuring van virale deeltjes in het sap van de resterende TMV-geïnfecteerde bladeren en de volgende onderzoek van de ultrastructuur en grootte kunnen worden uitgevoerd tijdens fixatie en inbedding.
Protocol
Microgolf-geassisteerde monstervoorbereiding
- Voor de start van monstervoorbereiding moet men de automatische magnetron weefselprocessor voor elektronenmicroscopie (EM AMW Leica, Leica Microsystems, Wenen, Oostenrijk) met volgende protocollen (tabel 1) microgolf-geassisteerde monstervoorbereiding voor TEM:
Tabel 1. Protocol voor monstervoorbereiding met behulp van microgolf bestraling. De verschillende kolommen (van links naar rechts):- Vial nummer (Vial nr.) Geeft de volgorde waarin de flacon wordt geladen in de carrousel van de processor.
- Stap van het feitelijke proces.
- Reagentia in de vaatjes.
- Duur van de feitelijke stap.
- Maximumtemperatuur die wordt bereikt in het flesje voor het microgolfbestraling uitgeschakeld.
- Microgolfbestraling instelling: Continue = snelle temperatuur behouase, die de ingestelde temperatuur; Slope = zacht temperatuurstijging, eindtemperatuur bereikt aan het einde; Pulsed = snelle temperatuurstijging, stroom uitgeschakeld totdat de temperatuur daalde 5 ° C, macht hervat op temperatuur te bereiken.
- Maximumvermogen van de microgolfbestraling.
- Vers de oplossingen te bereiden voor de verschillende stappen in de monstervoorbereiding protocol (voor Agar 100 epoxyhars zie 1.7), te vullen in de daarvoor flesjes met de ingestelde protocol (Tabel 1) de flesjes laden op de carrousel, vervolgens de carrousel in de magnetron weefsel processor, en tenslotte plaatst u de eerste flacon in de mono-modus kamer.
- Knip kleine delen van bladeren (1 mm 2) van Nicotiana tabacum besmet met tabak mozaïek virus (TMV) met een scheermes op een boetseerwas plaat in een daling van 3% glutaaraldehyde (Agar Scientific Ltd, Stansted, Engeland) in 60 mM Sørensen fosfaatbuffer (pH 7,2) bij kamertemperatuurdoor temperatuurschommelingen.
- Breng de gedeelten met fijne pincet onmiddellijk in de aangewezen manden met een maaswijdte van ongeveer 200 urn. Stapel de manden op elkaar en steek ze in de mono-modus kamer. Wees voorzichtig dat de monsters constant bedekt met Fixatief tijdens het laden en stapelen van de pakketten, zodat ze niet uitdrogen.
- Start de eerder geprogrammeerde microgolf-geassisteerde monstervoorbereiding protocol voor fixatie, dehydratie en infiltratie.
- Terwijl monstervoorbereiding wordt automatisch uitgevoerd door de magnetron weefsel processor verder met negatieve kleuring met het resterende plantmateriaal zoals beschreven in paragraaf 3 (negatieve kleuring).
- Vers bereid Agar 100 epoxyhars door mengen van de volgende componenten beschreven: fill 24g Agar 100, 16g dodecenylbarnsteenzuuranhydride en 10 g methyl Nadic anhydride (over alle geschikte Agar Scientific Ltd, Stansted, Engeland) in een plastic beker, hitte aan40 ° C en meng het. Voeg 1,2 g van benzyl dimethylamine en meng. Vul Agar 100 epoxyhars in de aangewezen polymerisatie vormt net voor de monstervoorbereiding protocol afloopt (bijvoorbeeld tijdens stap 22 in tabel 1).
- Nadat het protocol is voltooid (na stap 22 in tabel 1) laat de gestapelde manden met het geïnfiltreerde monsters van de mono-modus in de laatste kamer flacon van de carrousel. Verwijder de carrousel uit de magnetron apparaat, on-stacken de manden en laad ze met behulp van fijne pincet in de daarvoor bestemde polymerisatie vormen. Wees voorzichtig dat de monsters altijd bedekt met Agar 100 epoxyhars tijdens ontstapelen en laden zodat ze niet uitdrogen.
- Stapel de polymerisatie vormen bovenop elkaar. Wees voorzichtig dat de monsters altijd bedekt met Agar 100 epoxyhars bij het stapelen en laden zodat ze niet uitdrogen.
- Verwijder eerder gebruikte flacons uit de carrousel van de magnetron tissue processor, dit met de gestapelde manden en plaats de carrousel in de magnetron weefsel processor.
- Start de eerder geprogrammeerde polymerisatie-protocol (tabel 1).
- Terwijl polymerisatie wordt uitgevoerd automatisch door de magnetron weefsel processor, onderzoeken negatief gekleurde netten met een transmissie-elektronenmicroscoop [bijv. Philips CM10 TEM, FEI (voorheen Philips), Eindhoven, Nederland] en voer beeldanalyse zoals beschreven in paragraaf 3 en 4 ( negatieve kleuring en beeldanalyse).
- Na het protocol is voltooid verwijdert de polymerisatie vormen van de monovalente kamer stacken de polymerisatie vormen en verwijder het gepolymeriseerde blokken met de monsters. Ze zijn nu klaar om te worden coupes met een microtoom.
2. Trimmen en snijden
- Plaats een of meer blokken in afzonderlijke sample houders voor ultradunne snijden met het monster op de top steken ongeveer 1 cm uit de houder.
- Trim het blok met een specimen trimmer voor TEM (bijv. Leica Reichert Ultratrim; Leica Microsystems), zodat een blok gezicht van Max. 1mm in lengte en 200 urn in breedte die zoveel mogelijk bladmateriaal bereikt (blok gezicht grootte eventueel moet worden aangepast aan de grootte van de diamant mes) bevat.
- Gedeelte blok met een ultramicrotoom (bijv. Reichert Leica Ultracut S; Leica Microsystems) met een diamantmes op een mes hoek van 45 ° (bv. Diatome Ultra 45, Gröpl, Tulln, Oostenrijk). Snijdikte worden ingesteld op ongeveer 70 tot 90 nm en de snijsnelheid moet ongeveer 1 mm / s. Neem meerdere secties met een formvar (Agar Scientific Ltd) gecoat koper of nikkel 200 vierkante roosters.
- Post-vlekken op de secties op de grid met lood citraat (Agar Scientific Ltd 1.1g loodcitraat opgelost in 42ml dubbel gedestilleerd water en 8 ml 1N NaOH) gedurende 5 minuten in een petrischaal gedeeltelijk gevuld met NaOH tot een CO 2-vrije creëren milieu en voor 15 kmMINUTEN met 1% uranylacetaat (Agar Scientific Ltd) opgelost in gedestilleerd water bij kamertemperatuur. Was de roosters met gedestilleerd water gedurende 1 minuut tussen elke post-kleuring stap. Lucht drogen de roosters in een raster doos.
- Onderzoek secties met een transmissie-elektronenmicroscoop (bijv. Philips CM10 TEM, FEI, Eindhoven, Nederland).
3. Negatieve kleuring
- Oogst ongeveer 100 mg van TMV geïnfecteerde plantmateriaal en bereiden ruwe sap door homogeniseren het materiaal gedurende 2 minuten met een scheermes op een microscoopglaasje in 100 ui 60 mM Søfrensen fosfaat buffer (pH 7,2).
- Breng 20 pl van de resulterende homogenaat op het eerste putje van een met teflon bekleed microscoopglaasje met 4 of meer holtes (alternatief is het ook mogelijk om het homogenaat brengen op een stuk parafilm).
- Plaats een formvar gecoat rooster bovenop het homogenaat met formvar (Agar Scientific Ltd) beklede zijde naar de druppel en incubate het 5 minuten.
- Was de rooster 2 maal gedurende 2 minuten door het plaatsen van het rooster bovenop twee druppels 200 ui 60 mM Sørensen fosfaat buffer (pH 7,2).
- Incubeer het rooster gedurende 1 minuut met een vers bereide 2% fosfowolfraamzuur (Agar Scientific Ltd) oplossing in 60 mM Sørensen fosfaatbuffer (pH 6,5).
- Verwijder het rooster en laat het aan de lucht drogen in een raster doos.
- Onderzoek de rooster met een transmissie-elektronenmicroscoop (bijv. Philips CM10 TEM, FEI, Eindhoven, Nederland). Neem ten minste 10 beelden van willekeurig gekozen negatief gekleurde virions (ten minste 10 of meer virions zichtbaar moet zijn op elke afbeelding) de transmissie-elektronenmicroscoop op een lagere vergroting van 21000X of hoger. Er moet voor worden gezorgd dat alle afbeeldingen dezelfde vergroting hebben.
4. Beeldanalyse
- Meet de lengte en breedte van ten minste 100 willekeurig gekozen enkel virus deeltjes op de microfoto genomende negatief gekleurde monsters met behulp van een beeldanalyse computer software [bijv. Cell D (Olympus, Life en Material Science Europe GmbH, Hamburg, Duitsland) met het deeltje analyse-instrument of Optimas 6.5.1-(Media Cybernetica Inc, Bethesda, Maryland, USA)].
- Bereken gemiddelde en standaardafwijking om een gemiddelde lengte en breedte van de virusdeeltjes gevisualiseerd door negatieve kleuring methoden en TEM bereiken.
- Vergelijk lengte en ultrastructurele kenmerken (verkregen in 2.5) met afmetingen van virussen en ultrastructurele veranderingen veroorzaakt door virusziekten in de literatuur bekend om duidelijk de virusziekten.
5. Representatieve resultaten:
Na microgolf-geassisteerde monstervoorbereiding typische TMV geïnduceerde ultrastructurele veranderingen zoals grote gebieden met virions uitgelijnd in parallelle vorm kon worden waargenomen bij de transmissie-elektronenmicroscoop in de cytosol van geïnfecteerde Nicotianeen tabacum cellen (figuur 1A). Bovendien, in het ruwe sap van TMV geïnfecteerde bladeren TMV deeltjes worden waargenomen als flexuous staafvormige structuren na negatieve kleuring (figuur 1B). Beeldanalyse van 100 virusdeeltjes bleek een gemiddelde grootte voor TMV van 280 nm lang en 17nm in breedte (fig. 2). In de ultrastructuur TMV geïnfecteerde cellen en de grootte van virions in dit onderzoek bleken in overeenstemming met TMV geïnduceerde ultrastructurele eigenschappen in tabak en het groottebereik van TMV deeltjes eerder gerapporteerd in de literatuur 9-15.
Figuur 1. Transmissie electronenmicroscopie van TMV geïnfecteerde bladcellen en virions. A) Het beeld toont de ultrastructuur van TMV-geïnfecteerde bladmoes blad cellen van Nicotiana tabacum na microgolf-geassisteerde fabriek monstervoorbereiding. Merk de grote hoeveelheid evenwijdig virions die opgebouwd in de cytosol.C = chloroplast met zetmeel (St), M = mitochondrion, N = kern, V = vacuole, Bar = 2 um. B) Afbeelding toont virionen die door negatieve kleuring waargenomen in het sap van geïnfecteerde bladeren.
Figuur 2. Relatieve omvang van virionen. Relatieve verdeling van lengte en breedte van TMV-deeltjes na negatieve kleuring van het sap geïnfecteerde bladeren zoals zij in de elektronenmicroscoop. Gemiddelde waarden (gemiddelde lengte / breedte ± standaardafwijking) werden berekend van 100 virions.
Discussion
Microgolf-geassisteerde fabriek monstervoorbereiding voor TEM is bewezen dat een snelle en betrouwbare ultrastructurele gegevens te verstrekken binnen een paar uur 3,4,16. De fijne structuur behoud van organellen en membranen bereikt met de werkwijze die in deze studie was vergelijkbaar met conventionele en cryofixed samples 5,15 met het voordeel van een drastische reductie in monster fixatie en inbedden tijd van 3 dagen of langer tot ongeveer 2 uur. Dit de snelste monstervoorbereiding protocol voor TEM beschikbaar in de literatuur. De methode van dit onderzoek combimagnetron geassisteerde installatie monstervoorbereiding voor TEM met negatieve kleuring methoden die een duidelijke en snelle identificatie van TMV geïnduceerde ultrastructurele veranderingen en viraal middel zelf toegestaan. TMV geïnduceerde ultrastructurele veranderingen zouden kunnen worden onderzocht na het trimmen, snijden en na kleuring in ongeveer 4 uur na het begin van fixatie in de transmissie electron microscoop. De volledig automatisch prepareren mode bevrijd de onderzoeker negatieve kleuring voeren tussentijds om de grootte en breedte van de virale agens bepalen. Zo kunnen we concluderen dat deze methode een duidelijke en snelle diagnose van ziekten in planten virus halve dag die van groot belang is voor toekomstig gebruik in de landbouw en wetenschappelijke experimenten in plant fytopathologie maakt. Aangezien deze methode ook kan worden gebruikt voor de snelle diagnose van ziekten van mens en dier heeft een groot potentieel voor toekomstige toepassing in medische en veterinaire pathologie.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Oostenrijkse Science Fonds (FWF, P20619 en P22988 aan BZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glutaraldehyde | Agar Scientific | R1312 | |
| Osmium tetroxide | Agar Scientific | R1022 | |
| Agar 100 resin | Agar Scientific | R1043 | |
| Dodecenyl succinic anhydride | Agar Scientific | R1051 | |
| Methyl nadic anhydride | Agar Scientific | R1081 | |
| Benzyl dimethylamine | Agar Scientific | R1060 | |
| Lead citrate | Agar Scientific | R1210 | |
| Uranyl acetate | Agar Scientific | R1260A | |
| Phosphotungstic acid | Agar Scientific | R1213 | |
| Formvar | Agar Scientific | R1202 | |
| Leica EM AMW | Leica Microsystems | ||
| Leica (Reichert) Ultratrim | Leica Microsystems | Newer model is available | |
| Leica (Reichert) Ultracut S | Leica Microsystems | Newer model is available | |
| Diatome Ultra 45 | Gröpl | ||
| Philips CM10 TEM | FEI | Newer model is available | |
| Cell D | Olympus Corporation | ||
| Optimas 6.5.1 | Media Cybernetics Inc. | Newer version is available |
References
- Bozzola, J. J., Russell, D. Electron Microscopy. , Jones and Barlett Publishers. Boston. (1999).
- Kuo, J. Processing plant tissues for ultrastructural study. Methods in Molecular Biology, Electron Microscopy, Methods and Protocols. Kuo, J. 369, Humana Press. 47-65 (2007).
- Schroeder, J. A., Gelderblom, H. R., Hauroeder, B., Schmetz, C., Milios, J., Hofstaedter, F. Microwave-assisted tissue processing for sameday EM-diagnosis of potential bioterrorism and clinical samples. Micron. 37, 577-590 (2006).
- Webster, P. Microwave-assisted processing and embedding for transmission electron microscopy. Methods in Molecular Biology, Electron Microscopy, Methods and Protocols. Kuo, J. 369, Humana Press. 47-65 (2007).
- Zechmann, B., Zellnig, G. Microwave assisted rapid plant sample preparation for transmission electron microscopy. J. Microsc. 233, 258-268 (2009).
- Lería, F., Marco, R., Medina, F. J. Structural and antigenic preservation of plant samples by microwave-enhanced fixation, using dedicated hardware, minimizing heat-related effects. Micr. Res. Techniq. 65, 86-100 (2004).
- Giberson, R. T., Austin, R. L., Charlesworth, J., Adamson, G., Herrera, G. A. Microwave and digital imaging technology reduce turnaround times for diagnostic electron microscopy. Ultrastruct. Pathol. 27, 187-196 (2003).
- Cavusoglu, I., Minbay, F. Z., Temel, S. G., Noyan, S. Rapid polymerisation with microwave irradiation for transmission electron microscopy. Eur. J. Morph. 39, 313-317 (2001).
- Ermolina, I., Morgana, H., Greena, N. G., Milnerb, J. J., Feldmanc, Y. Dielectric spectroscopy of tobacco mosaic virus. Biochim. Biophys. Acta. 1622, 57-63 (2003).
- Maeda, H. An atomic force microscopy study for the assembly structures of tobacco mosaic virus and their size evaluation. Langmuir. 13, 4150-4161 (1997).
- Milne, R. G. Multiplication of tobacco mosaic virus in tobacco leaf palisade cells. Virology. 28, 527-532 (1966).
- Reunov, A. V., Gnutova, I. V., Lapshina, L. A. Effect of tobacco mosaic virus strains on the ultrastructure of tobacco leaf parenchymal cells. Biol. Bull. 33, 409-415 (2006).
- Sachse, C., Chen, J. Z., Coureux, P. D., Stroupe, M. E., Fändrich, M., Grigorieff, N. High-resolution electron microscopy of helical specimens: a fresh look at tobacco mosaic virus. J. Mol. Biol. 371, 812-835 (2007).
- Smith, M. L., Lindbo, J. A., Dillard-Telm, S., Brosio, P. M., Lasnik, A. B., McCormick, A. A., Nguyen, L. V., Palmer, K. E. Modified tobacco mosaic virus particles as scaffolds for display of protein antigens for vaccine applications. Virology. 348, 475-488 (2006).
- Zechmann, B., Zellnig, G. Rapid TEM diagnosis of plant virus diseases. J. Virol. Meth. 162, 163-169 (2009).
- Giberson, R. T., Demaree, R. S. Jr Microwave processing techniques for electron microscopy: a four-hour protocol. Meth. Molec. Biol. 117, 145-158 (1999).
