Summary
Denna studie beskriver en metod som möjliggör snabb och tydlig diagnos av växtsjukdomar virus i ungefär en halv dag genom att använda en kombination av mikrovågor assisterad anläggningar provberedning för transmissionselektronmikroskopi och negativa metoder färgning.
Abstract
Undersökningar av ultrastrukturella förändringar inducerade av virus är ofta nödvändigt att tydligt identifiera virussjukdomar hos växter. Med konventionell provberedning för transmissionselektronmikroskopi (TEM) sådana undersökningar kan ta flera dagar 1,2 och är därför inte lämpade för en snabb diagnos av växtsjukdomar virus. Mikrovågsugn fixering kan användas för att drastiskt minska tiden provberedning för TEM undersökningar med liknande ultrastrukturella resultat som observerades efter konventionellt provberedning 3-5. Många olika skräddarsydda mikrovågsanordningar är för närvarande tillgängliga som kan användas för framgångsrik fixering och inbäddning av biologiska prover för TEM undersökningar 5-8. I denna studie visar vi på tobak (TMV) infekterade Nicotiana tabacum växter som det är möjligt att diagnostisera ultrastrukturella förändringar i löv i ungefär en halv dag med mikrovågsassisterad provberedning för TEM. Vi har valt att utföra denna studie med en kommersiellt tillgänglig mikrovågsugn enheten som den utför provberedning nästan helt automatiskt 5 i motsats till de andra tillgängliga anordningar där många steg fortfarande måste utföras manuellt 6-8 och är därför mer tid och arbete tidskrävande. Eftersom provberedning utförs helt automatiskt negativ färgning av virala partiklar i saven av de återstående TMV-infekterade blad och följande undersökningar av ultrastruktur och storlek kan utföras under fixering och inbäddning.
Protocol
Mikrovågsassisterad provberedning
- Innan starten av provberedning måste man programmera den automatiska processorn mikrovågsugn vävnad för elektronmikroskopi (Leica EM AMW, Leica Microsystems, Wien, Österrike) med följande protokoll (tabell 1) för mikrovågsassisterad provberedning för TEM:
Tabell 1. Protokoll för provberedning med mikrovågsstrålning. De olika kolumnerna visar (från vänster till höger):- Injektionsflaska nummer (injektionsflaska nr.) Representerar den ordning i vilken flaskan laddas i karusellen av processorn.
- Steg för själva processen.
- Reagens i injektionsflaskor.
- Varaktighet av den faktiska steget.
- Maximal temperatur som nås i ampullen innan mikrovågsbestrålningen är avstängd.
- Mikrovågsbestrålning inställning: Kontinuerlig = snabb temperatur steg omase, hålla den inställda temperaturen, Lutning = mild temperaturhöjning, sluttemperaturen uppnåtts i slutet, Pulserande = Snabb temperaturökning, kraft avstängd tills temperaturen sjunkit 5 ° C, makt återupptas för att nå temperaturen.
- Maximal effekt av mikrovågsbestrålning.
- Nyligen förbereda lösningar för de olika stegen som beskrivs i provberedningen protokollet (för Agar 100 epoxiharts se 1,7), fyll dem till de utsedda flaskorna enligt den programmerade protokollet (tabell 1), ladda flaskorna på karusellen, sedan in karusell i mikrovågsugn vävnad processor och ladda slutligen den första flaskan i mono-läge kammare.
- Klipp ut små delar av blad (1 mm 2) från Nicotiana tabacum infekterad med tobak (TMV) med ett rakblad på en modell vax platta i en minskning på 3% glutaraldehyd (Agar Scientific Ltd, Stansted, England) i 60 mM Sørensen fosfatbuffert (pH 7,2) vid rumstemperaturratur.
- Överför avsnitten med fina pincett omedelbart till de utsedda korgar med en maskstorlek på ca 200 pm. Stapla korgarna ovanpå varandra och infoga dem i mono-läge kammare. Försiktighet måste iakttagas att proven ständigt täckta med fixeringslösning under lastning och stapling av korgarna så att de inte torkar ut.
- Starta den tidigare programmerade mikrovågsassisterad protokoll provberedning för fixering, dehydrering och infiltration.
- Medan provberedning utförs automatiskt av mikrovågor vävnadsprocessor fortsätta med negativ färgning med resterande växtmaterial som beskrivs i avsnitt 3 (negativ färgning).
- Nyligen förbereda Agar 100 epoxiharts genom att blanda följande komponenter som beskrivs: fyllning 24g Agar 100, 16g dodecenyl bärnstenssyraanhydrid, och 10 g metyl nadinsyraanhydrid (för alla komponenter ser Agar Scientific Ltd, Stansted, England) i en plast cup, värme det40 ° C och blanda den väl. Lägg 1,2 g av bensyldimetylamin och blanda väl. Fyll Agar 100 epoxiharts till det bestämda polymerisation bildar strax före provberedning protokollet upphör (t.ex. under steg 22 i tabell 1).
- Efter protokollet är klar (efter steg 22 i tabell 1) frigör de staplade korgarna innehåller de infiltrerade proverna från mono-läge kammaren till den sista flaskan av karusellen. Ta karusellen från mikrovågsugnen enheten unstack korgarna och ladda dem med fina pincett i de angivna polymerisa former. Man måste vara försiktig att proven alltid är täckta med Agar 100 epoxiharts under nedtagning och lastning så att de inte torkar ut.
- Stapla polymerisa formerna ovanpå varandra. Man måste vara försiktig att proven alltid är täckta med Agar 100 epoxiharts under stapling och lastning så att de inte torkar ut.
- Ta bort tidigare använda flaskor från karusellen i mikrovågsugn Tissue-processor, ladda den med de staplade korgarna och sätt karusellen i mikrovågsugn vävnaden processorn.
- Starta den tidigare programmerade polymerisa protokoll (tabell 1).
- Medan polymerisation sker automatiskt av mikrovågor vävnadsprocessor undersöka negativt färgade galler med ett transmissionselektronmikroskop [t.ex. Philips CM10 TEM, FEI (tidigare Philips), Eindhoven, Nederländerna] och utföra bildanalys som beskrivs i avsnitt 3 och 4 ( negativ färgning och bildanalys).
- Efter protokollet är klar avlägsna polymerisa formerna från mono-mod kammare, unstack polymerisations formerna och avlägsna de polymeriserade blocken innehåller proven. De är nu redo att sektioneras med en mikrotom.
2. Trimning och sektionering
- Sätt ett eller flera block i separata provhållare för ultratunna sektionering med provet på toppen fastnar ungefär 1 cm ur hållaren.
- Trimma blocket med ett prov trimmer för TEM (t.ex. Leica Reichert Ultratrim, Leica Microsystems) så att ett block ansikte max. 1 mm i längd och 200 pm i bredd som innehåller lika mycket bladmaterial som möjligt uppnås (blockera ansikte storlek kan behöva anpassas till storleken på diamantkniv).
- Sektion blocket med en ultramikrotom (t.ex. Reichert Leica Ultracut S, Leica Microsystems) med hjälp av en diamant kniv på en kniv vinkel av 45 ° (t.ex. Diatome Ultra 45, Gröpl, Tulln, Österrike). Snittjockleken bör justeras till ca 70 till 90 nm och skärhastigheten vara omkring 1 mm / sek. Plocka upp flera sektioner med Formvar (Agar Scientific Ltd) belagd koppar eller nickel 200 fyrkantsmaskor nätet.
- Post-fläck sektionerna på gallret med blycitrat (Agar Scientific Ltd, 1,1 g blycitrat upplöst i 42ml dubbeldestillerat vatten och 8 ml 1 N NaOH) under 5 minuter i en petriskål delvis fyllda med NaOH för att skapa en CO 2-fri miljön och 15 kmnuter med 1% uranylacetat (Agar Scientific Ltd) löst i destillerat vatten vid rumstemperatur. Tvätta gallren med destillerat vatten under 1 minut mellan varje efter färgning steg. Lufttorka gallren i ett rutnät låda.
- Undersök avsnitt med ett transmissionselektronmikroskop (t.ex. Philips CM10 TEM, FEI, Eindhoven, Nederländerna).
3. Negativ färgning
- Skörd om 100 mg av TMV-infekterade blad materialet och förbereda råa sav genom homogenisering av materialet i 2 minuter med ett rakblad på ett objektglas i 100 pl av 60 mM Søfrensen fosfatbuffert (pH 7,2).
- Överför 20 | il av den resulterande homogenatet på den första brunnen i en teflonbelagd objektglas med 4 eller flera brunnar (alternativt är det också möjligt att överföra homogenatet på en bit parafilm).
- Placera en Formvar belagd rutnät ovanpå homogenatet med Formvar (Agar Scientific Ltd) belagda sidan vänd mot droppen och incuBATE det i 5 minuter.
- Tvätta gallret 2 gånger under 2 minuter vardera genom att placera gallret på toppen av två droppar 200 pl 60 mM Sørensen fosfatbuffert (pH 7,2).
- Inkubera gallret under 1 minut med en nyberedd 2% fosforvolframsyra (Agar Scientific Ltd) lösning i 60 mM Sørensen fosfatbuffert (pH 6,5).
- Ta bort gallret och låt den lufttorka i ett rutnät låda.
- Undersök nätet med ett transmissionselektronmikroskop (t.ex. Philips CM10 TEM, FEI, Eindhoven, Nederländerna). Ta minst 10 bilder av slumpvis utvalda negativt färgade virioner (minst 10 eller fler virioner ska visas på varje bild) med transmissionselektronmikroskop vid en primär förstoring av 21000X eller högre. Försiktighet måste iakttas så att alla bilderna har samma förstoring.
4. Bildanalys
- Mät längd och bredd av minst 100 slumpmässigt utvalda enstaka viruspartiklar på mikrofotografier tagna frånde negativt färgade prover genom att använda någon bild programvara analys dator [t.ex. Cell D (Olympus, liv och materialvetenskap Europe GmbH, Hamburg, Tyskland) med partikeln analysverktyg eller Optimas 6.5.1-(Media Cybernetics Inc., Bethesda, Maryland, USA)].
- Beräkna medelvärden och standardavvikelser för att uppnå en genomsnittlig längd och bredd av viruspartiklarna visualiserade genom negativ färgning metoder och TEM.
- Jämför längd och ultrastrukturella funktioner (som erhållits i 2,5) med storlekar av virus och ultrastrukturella förändringar inducerade av virussjukdomar kända i litteraturen för att tydligt identifiera de virussjukdomar.
5. Representativa resultat:
Efter mikrovågsassisterad typiska provberedning TMV-inducerade ultrastrukturella förändringar, såsom stora områden innehållande virioner inriktade i parallell form kunde observeras med transmissionselektronmikroskop i cytosolen av infekterade NIKOTINen tabacum celler (Fig. 1A). Dessutom, i den råa sav av TMV-infekterade blad TMV partiklar kan observeras som SLINGRANDE, stavformade strukturer efter negativ färgning (Fig. 1B). Bildanalys av 100 viruspartiklar visade en genomsnittlig storlek för TMV av 280 nm i längd och 17nm i bredd (figur 2). Ultrastrukturen i TMV-infekterade celler och storleken på virioner observerades i denna studie befanns vara i överensstämmelse med TMV-inducerade ultrastrukturella egenskaper i tobak och storleksområdet TMV partiklar som tidigare rapporterats i litteraturen 9-15.
Figur 1. Transmission elektronmikrofotografier av TMV-infekterade blad celler och virioner. A) Bilden visar ultrastruktur av TMV-infekterade celler mesophyll blad av Nicotiana tabacum efter mikrovågsassisterad växt provberedning. Notera det stora området av parallella inriktade virioner som ackumulerats i cytosolen.C = kloroplast med stärkelse (St), M = mitokondrier, N = kärna, V = vakuol, Bar = 2 fim. B) Bilden visar virioner som upptäcks av negativ färgning i SAP för infekterade blad.
Figur 2. Relativ storlek virioner. Relativ fördelning av längd och bredd av TMV-partiklar efter negativ färgning saven av infekterade blad som de dök upp i elektronmikroskop. Medelvärden (medelvärde längd / bredd ± standardavvikelse) beräknades från 100 virioner.
Discussion
Mikrovågsassisterad anläggning provberedning för TEM har visat sig leverera snabba och tillförlitliga ultrastrukturella uppgifter inom några timmar 3,4,16. Den fina strukturella bevara organeller och membran uppnås med den metod som används i denna studie liknade konventionella och cryofixed prover 5,15 med fördelen av en massiv minskning av prov fixering och bädda tid från 3 dagar eller längre till ca 2 timmar. Detta är den snabbaste protokoll provberedning för TEM närvarande finns i litteraturen. Den metod som beskrivs i denna studie kombinerad mikrovågsassisterad beredning växtprov för TEM med negativ färgning metoder som möjliggjorde en klar och snabb identifiering av TMV-inducerade ultrastrukturella förändringar och den virala medlet självt. TMV inducerade ultrastrukturella förändringar kunde undersökas efter trimning, snittning och efter färgning inom ca 4 timmar efter början av fixering i transmissionen elektroniskaTron mikroskop. Använda helt automatiskt läge provberedning befriade forskaren att genomföra negativ färgning under tiden för att bestämma storleken och bredden av den virala medlet. Vi kan alltså konstatera att denna metod ger en tydlig och snabb diagnos av växtsjukdomar virus i ungefär en halv dag som är av stor betydelse för framtida användning inom jordbruket och vetenskapliga experiment i anläggningen Phytopathology. Eftersom denna metod skulle också kunna användas för snabb diagnos av djur och människors sjukdomar har en stor potential för framtida tillämpning i medicinsk och veterinär patologi.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av den österrikiska Science Fund (FWF, P20619 och P22988 till BZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glutaraldehyde | Agar Scientific | R1312 | |
| Osmium tetroxide | Agar Scientific | R1022 | |
| Agar 100 resin | Agar Scientific | R1043 | |
| Dodecenyl succinic anhydride | Agar Scientific | R1051 | |
| Methyl nadic anhydride | Agar Scientific | R1081 | |
| Benzyl dimethylamine | Agar Scientific | R1060 | |
| Lead citrate | Agar Scientific | R1210 | |
| Uranyl acetate | Agar Scientific | R1260A | |
| Phosphotungstic acid | Agar Scientific | R1213 | |
| Formvar | Agar Scientific | R1202 | |
| Leica EM AMW | Leica Microsystems | ||
| Leica (Reichert) Ultratrim | Leica Microsystems | Newer model is available | |
| Leica (Reichert) Ultracut S | Leica Microsystems | Newer model is available | |
| Diatome Ultra 45 | Gröpl | ||
| Philips CM10 TEM | FEI | Newer model is available | |
| Cell D | Olympus Corporation | ||
| Optimas 6.5.1 | Media Cybernetics Inc. | Newer version is available |
References
- Bozzola, J. J., Russell, D. Electron Microscopy. , Jones and Barlett Publishers. Boston. (1999).
- Kuo, J. Processing plant tissues for ultrastructural study. Methods in Molecular Biology, Electron Microscopy, Methods and Protocols. Kuo, J. 369, Humana Press. 47-65 (2007).
- Schroeder, J. A., Gelderblom, H. R., Hauroeder, B., Schmetz, C., Milios, J., Hofstaedter, F. Microwave-assisted tissue processing for sameday EM-diagnosis of potential bioterrorism and clinical samples. Micron. 37, 577-590 (2006).
- Webster, P. Microwave-assisted processing and embedding for transmission electron microscopy. Methods in Molecular Biology, Electron Microscopy, Methods and Protocols. Kuo, J. 369, Humana Press. 47-65 (2007).
- Zechmann, B., Zellnig, G. Microwave assisted rapid plant sample preparation for transmission electron microscopy. J. Microsc. 233, 258-268 (2009).
- Lería, F., Marco, R., Medina, F. J. Structural and antigenic preservation of plant samples by microwave-enhanced fixation, using dedicated hardware, minimizing heat-related effects. Micr. Res. Techniq. 65, 86-100 (2004).
- Giberson, R. T., Austin, R. L., Charlesworth, J., Adamson, G., Herrera, G. A. Microwave and digital imaging technology reduce turnaround times for diagnostic electron microscopy. Ultrastruct. Pathol. 27, 187-196 (2003).
- Cavusoglu, I., Minbay, F. Z., Temel, S. G., Noyan, S. Rapid polymerisation with microwave irradiation for transmission electron microscopy. Eur. J. Morph. 39, 313-317 (2001).
- Ermolina, I., Morgana, H., Greena, N. G., Milnerb, J. J., Feldmanc, Y. Dielectric spectroscopy of tobacco mosaic virus. Biochim. Biophys. Acta. 1622, 57-63 (2003).
- Maeda, H. An atomic force microscopy study for the assembly structures of tobacco mosaic virus and their size evaluation. Langmuir. 13, 4150-4161 (1997).
- Milne, R. G. Multiplication of tobacco mosaic virus in tobacco leaf palisade cells. Virology. 28, 527-532 (1966).
- Reunov, A. V., Gnutova, I. V., Lapshina, L. A. Effect of tobacco mosaic virus strains on the ultrastructure of tobacco leaf parenchymal cells. Biol. Bull. 33, 409-415 (2006).
- Sachse, C., Chen, J. Z., Coureux, P. D., Stroupe, M. E., Fändrich, M., Grigorieff, N. High-resolution electron microscopy of helical specimens: a fresh look at tobacco mosaic virus. J. Mol. Biol. 371, 812-835 (2007).
- Smith, M. L., Lindbo, J. A., Dillard-Telm, S., Brosio, P. M., Lasnik, A. B., McCormick, A. A., Nguyen, L. V., Palmer, K. E. Modified tobacco mosaic virus particles as scaffolds for display of protein antigens for vaccine applications. Virology. 348, 475-488 (2006).
- Zechmann, B., Zellnig, G. Rapid TEM diagnosis of plant virus diseases. J. Virol. Meth. 162, 163-169 (2009).
- Giberson, R. T., Demaree, R. S. Jr Microwave processing techniques for electron microscopy: a four-hour protocol. Meth. Molec. Biol. 117, 145-158 (1999).
