Bruk av menneskelige perivaskulær stamceller for Bone Regeneration

Summary

Humane perivaskulær stamceller (PSCs) er en roman stamcelle klasse for skjelettlidelser vev regenerering ligner stamceller (MSCS). PSCs kan bli isolert av FACS (fluorescens aktivert celle sortering) fra fettvev anskaffet i løpet av standard fettsuging prosedyrer, da kombinert med et osteoinduktivt stillas for å oppnå beindannelse

Abstract

Humane perivaskulær stamceller (PSCs) kan bli isolert i tilstrekkelig antall fra flere vev for anvendelse av skjelettet tissue engineering ^1-3. PSCs er en FACS-sortert befolkning av «pericytes '(CD146 + CD34-CD45-) og' adventitial celler '(CD146-CD34 + CD45-), som hver vi tidligere har rapportert å ha egenskaper stamceller. PSCs, som MSCS, er i stand til å gjennomgå osteogenic differensiering, samt skiller pro-osteogenic cytokiner ^1,2. I denne protokollen, demonstrerer vi osteogenicity av PSCs i flere dyremodeller deriblant en muskel pose implantasjon i SCID (alvorlig kombinert immunsvikt) mus, en SCID mus calvarial defekt og en femur segment defekte (FSD) i athymic rotter. Låret muskelen posen modellen brukes til å vurdere ektopisk beindannelse. Calvarial defekter er sentrert på issebeinet og er standardly 4 mm i diameter (kritisk størrelse) ^8. FSDs er bicortical og er stabilisert meden polyetylen bar og K-ledninger ^4. Den FSD beskrives er også en kritisk størrelse feil, som ikke vesentlig leges på egen hånd ^4. I motsetning, dersom stamceller eller vekstfaktorer legges til mangelen, kan betydelig bein gjenfødelse bli verdsatt. Det overordnede målet for PSC xenografting er å demonstrere osteogenic evnen til denne celletypen i både ektopiske og orthotopic bein regenerering modeller.

Protocol

1. Perivaskulær Stem Cell Isolation

Dette er beskrevet i detaljer i den tilstøtende artikkelen "Rensing av perivaskulær stamceller fra menneskelige hvitt fettvev", av M. Corselli et al.

2. Stillas Creation

1. Stillasene er skreddersydd per tidligere utgitt protokoll fra poly (melkesyre-co-glykolsyre) (PLGA, Burmingham Polymer) med hydroksyapatitt belegg ^4-6. Apatitt-belagte PLGA Stillasene er fremstille fra 85/15 PLGA av løsemiddel støping og partikler renseprosess. Stillasene er opprettet i en sfærisk form (2-mm diameter) for muskel posen implantasjon, en discoid form (4 mm i diameter) for calvarial implantering, eller sylindrisk (4 mm i diameter, 6 mm i lengde) for femorale segmenter mangler.
2. Kort, PLGA / kloroform løsninger blandet med sukrose (polymer / sukrose forholdet 5/95, w / w) er støpt inn i en 200-300-mikrometer diameter Teflon mold til å lage skreddersydde construct. Etter frysetørking over natten, er stillasene fjernet fra Teflon mugg og fordypet i DDH ₂ O å oppløse sukrose. Stillasene er desinfiseres ved nedsenkning i 70% etanol i 30 min, etterfulgt av tre skyllinger av DDH ₂ O.
3. For apatitt belegg, er en simulert kroppsvæske (SBF) løsning utarbeidet av sekvensielt løse _to CaCl, MgCl2 • 6H ₂ O, ₃ NaHCO, og K ₂ HPO ₄ • 3H ₂ O i DDH ₂ O. Løsning pH senkes til 6 ved å legge 1M saltsyre for å øke løseligheten. Na ₂ SO _4, KCl, og NaCl er lagt til og den endelige pH er justert til 6,5 (SBF 1).
4. Mg 2 + og HCO ₃ - gratis SBF (SBF 2) er utarbeidet ved å legge CaCl ₂ og K ₂ HPO ₄ • 3H ₂ O i DDH ₂ O og pH senkes til 6. KCl og NaCl er lagt til og den endelige pH er justert til 6,8. Alle løsninger er steril filtrert gjennom et 0,22 mikrometer PES membrAne (Nalgene). Umiddelbart før belegget prosessen, er de tørkede PLGA stillasene utsettes for glød utslipp argon plasma etsing (harrick Scientific) for å bedre fukting og belegg ensartethet.
5. Etset Stillasene er så inkubert i SBF en i 12 timer og endret til Mg 2 + og HCO ₃ - gratis SBF 2 for ytterligere 12 timer ved 37 ° C under milde omrøring. Belagte Stillasene er vasket med DDH ₂ O for å fjerne overflødig ioner og lyofilisert før videre studier.

3. Den Muscle Pouch Model Implantasjon

1. 100 mL av en PSC suspensjon i PBS (fosfat saltløsning) er forsiktig slippes på den sfæriske PLGA-baserte implantat rett før implantasjon. Celler har blitt pre-merket ved lentiviral innsetting av Firefly luciferase, slik tillate in vivo spore innlegget implantasjon. Cell tetthet er 2,5 x 10 ⁵ per implantat.
2. SCID (alvorlig kombinert immunsvikt) mus brukes ved 6 ukers alder. Dyr er anesthetized av isofluran innånding og premedisinerte med buprenorfin (Bedford Labs). Etter standard Betadine forberedelser, er bilaterale snitt i bakbena laget (langsgående og 2 mm i lengde).
3. Lommer er kuttet i biceps femoris musklene ved stump disseksjon parallelt med muskel fiber lang akse. For hver mus er PLGA-baserte implantat med PSCs satt inn, og konseptet overliggende den muskelen er sutureres med 5-0 Vicryl (Ethicon).
4. Huden er neste stengt med 5-0 Vicryl i en subcuticular mønster. Dyr er behandlet postoperativt med buprenorfin i 48 timer og tmp / SMX (Trimetoprim / sulfametoksazol, Qualitest) i 10 dager.

4. Den Calvarial Defekt Model Implantasjon

1. Etter isofluran anestesi av SCID mus (12-14 uker gammel), er håret klippet og huden desinfiseres med Betadine per protokoll.
2. En 8-mm hud innsnitt er gjort langs midten sagittal suturen av musen calvarium. Neste, den calvArial periosteum er forsiktig fjernet av Q-tip program.
3. Deretter bruker diamant-trephine bits i en høyhastighets dental drill, er en 4-mm issebeinet defekt opprettet. Feilen er full tykkelse - men omsorg er tatt for ikke å skade den underliggende dura mater.
4. Den skreddersydde PLGA-baserte implantat med innpodet PSCs deretter plasseres forsiktig i mangelen området. Cell tetthet er 2,5 x 10 ⁵ per implantat. Endelig er huden sys med 6-0 Vicryl. Dyr er behandlet postoperativt med buprenorfin i 48 timer og TMP / SMX i 10 dager.

5. Den Femoral Segmentansvar Defekt Model Implantasjon

1. Athymic rotter (12-14 uker gammel) bedøves etter isofluran innånding. Femur er skrubbet og forberedt per standard protokoll med Betadine (figur 1).
2. En 27-30-mm langsgående snitt er gjort over anterolateralt av femur. Femur skaft blir så eksponert ved å skille vastus lateralis og biceps femoris muskler (figur 2).
3. For å maksimere konsistens av bein gjenfødelse, er periosteum overliggende femoral feilen fjernes helt med den resected femoral segmentet.
4. En polyetylen plate (lengde, 23 mm, bredde 4 mm, høyde, 4 mm) er plassert på anterolateral overflaten av femur. Platen inneholder seks pre-boret hull for å imøtekomme 0,9 mm diameter gjengede Kirschner ledninger (Zimmer). Tar platen som en mal, er seks gjengede Kirschner ledninger boret gjennom platen og begge cortices (figur 3).
5. Neste, med en liten oscillerende sagbladet (Stryker, MI), er en 6-mm mid-diaphyseal defekt opprettet. Segmenter defekter blir deretter behandlet av innsetting av PLGA baserte implantater som har vært lastet med celler som per protokoll (figur 4).
6. Den overliggende muskler og fascia er lukket med 4-0 Vicryl absorberbare suturer å feste implantatet på plass, og huden er sutureres.

   6. In vivo evalueringer

   1. Radiografisk Vurderingene er utført på en langsgående måte av både høy oppløsning XR og høy oppløsning μCT (micro computertomografi) analyse. For μCT analyse (Skyscan 1172F), er bilder skannet med en oppløsning på 19.73 mikrometer (100 kV og 100 mA strålekilde, bruk av en 0,5 mm aluminium filter). Bildene er analysert ved hjelp DataViewer, Recon, CTAn, og CTVol programvare.
   2. Bioluminesens avbildning er også gjort i en seriell måte å vurdere celle engraftment, levedyktighet, spredning og inkluderer migrasjon ut av implantasjonsstedet. Bioluminesens avbildning utføres ved hjelp av en IVIS Lumina II enhet (Caliper Life Sciences). Lette utganger er kvantifisert ved hjelp av levende bilde-programvare (Xenogen). Total lysmengde er registrert i fotoner / sekund / sq cm / steradian.
   3. Histologiske og histomorphometric Analysen er utført mortem. Rutinemessige flekker sysselsatte inkluderer Masson sine trichrome, anilin blå, pentachrome, og Picrosirius rød. Histomorphometric analysen utføres enkelt med enten anilin blå eller pentachrome flekker, som osteoid vises mørk blå og gul, henholdsvis. Piksler per kraftig feltet er beregnet ved hjelp av tryllestaven i Adobe Photoshop.

   7. Representative Resultater

   Som både calvarial og femoral defekter er kritisk størrelse, bør ingen signifikant healing kan forventes uten behandling med vekstfaktorer eller eksogene stamceller.

   Når det gjelder kirurgiske manøvrer, bør muskelen posen disseksjon være langs fascial fly og dermed minimal blødning bør oppstått. Selv om muskel posen modellen er utført bilateralt, bør musen være gange med letthet på postoperativ dag en. For calvarial mangelen, er blødning oppstått, men kan bli dynket med en Q-tip. Ekstrem forsiktighet bør utvises for ikke å skade den underliggende dura mater - da dette vil forstyrremed normal healing. For FSD-modellen, er forsiktighet tatt ikke å skade de store blodårene slik at det ikke forårsaker overdreven blødning eller femoral nerve for å hindre nevrologisk skade. Kirschner ledninger bores med lett press for ikke å skade kortikale benet i prosessen.

   
   Figur 1. Preoperativ forberedelse for Femoral Segmentansvar Defekt (FSD) i Athymic Rats. Hannrotter (12-14 uker gammel) bedøves etter isofluran innånding. Femur er skrubbet og preparert per standard protokoll med Betadine.

   
   Figur 2. Kirurgisk eksponering for Femoral Segmentansvar Defekt (FSD) skapelse. Et 27-30 mm langsgående snitt er gjort over anterolateralt av femur. Den laterale aspektet av femoral akselen så eksponert ved å skille vastus lateralisog biceps femoris muskler.

   
   Figur 3. Fiksering for Femoral Segmentansvar Defekt (FSD) skapelse. En polyetylen plate (lengde, 23 mm, bredde 4 mm, høyde, 4 mm) er plassert på anterolateral overflaten av femur. Platen inneholder seks pre-boret hull for å imøtekomme 0,9 mm diameter gjengede Kirschner ledninger. Tar platen som en mal, er seks gjengede Kirschner ledninger boret gjennom platen og begge cortices. Neste, er en 6 mm mid-diaphyseal defekt opprettet. Når dette er utført, er en skreddersydd stillas direkte inn som passer akkurat mangelen området (ikke vist).

   
   Figur 4. Eksempel på Calvarial Defekten Postoperativ. En 4 mm, rundskriv calvarial defekt opprettes i riktig issebeinet i athymic mus. Bildebehandlet er her en defekt område implantert medPSCs på 8 uker postoperative. Legg merke til tilstedeværelsen av nye bein innenfor mangelen nettstedet.

Discussion

Isolering av PSCs er godt beskrevet andre steder ^1-3, inkludert en separat innsendt Jove publikasjon spesielt adressering PSC isolasjon protokoller og metoder. Den spesifikke Hensikten med denne artikkelen er å beskrive og demonstrere 3 protokoller for PSC in vivo søknad for beindannelse / regenerering. Den SCID mus muskel posen er en vanlig beskrevet modell for ektopisk human beindannelse ^7. Viktige forskjeller mellom ektopiske og orthotopic (defekt) modeller for bein, inkludert parakrine interaksjon med vert bendannende celler ⁸ samt en overflod av osteogenic Signalanlegg faktorer er til stede i skjelettet mangelen mikromiljøet. To feil er presentert her, en calvarial defect8 og femoral segmental defekt ^4. Begge er godt dokumentert å være kritisk størrelse (dvs. ikke vil gro på egenhånd).

Interessante forskjeller mellom calvarial og femoral defekter. Førstcelle: celle interaksjon mellom xenografted PSCs og endogene celler er svært forskjellig. I form av en calvarial defekt, PSCs samhandle med den underliggende dura mater (den ytterste laget av hjernehinnene), samt de osteoblaster og periosteal celler circumscribing mangelen nettstedet. Viktigere, samspillet mellom implantert celler og omkringliggende osteoblaster ⁸ eller implanterte celler og underliggende Dura (Levi et al., In press) er kritiske for normal stamcelle mediert Osteogenesis å fortsette. I forhold til femoral segmental defekten (FSD), er xenografted PSCs utsatt for en helt annen celle og cytokin miljø. For eksempel er FSD området består av margen og medfølgende stamceller, samt den endosteum og periosteum og lange ben osteoblaster. Teoretisk har hver celle sin egen reaksjon på skade, og hver kan ha celle: celle interaksjoner med PSC xenografts.

Andre klare forskjeller mellom calvarialog lår feil. De calvarial bein i utgangspunktet danne gjennom intramembranous ossifikasjon, mens den lange bein form gjennom en brusk mellomliggende (endochondral forbening). Videre reparerende prosess etter skade også etterligner disse utviklingsmessige opprinnelse. Post-FSD, blir brusk callus formasjon observert, mens ingen brusk mellomliggende dannes innenfor en issebeinet defekt. Endelig kan embryonale opprinnelse av skallen forskjellig fra den for den lange bein. Flertallet av hodeskallen (inkludert perivaskulær celler - pericytes - i hele hodet regionen) er avledet fra neural crest (mesectoderm), mens appendicular skjelettet er av paraksiale mesoderm derivasjon ^9. Alle disse forskjellene kan resultere i betydelige forskjeller i form av PSC-mediert bein reparasjon.

Bruken av PSCs har flere fordeler fremfor tradisjonelle adipose-deriverte stromale celler (ASCs). PSCs ikke krever kultur og er en renset celle befolkning Which inkluderer ikke andre stromale celler som ikke deltar i - og kan til og med negativt regulere - osteogenic differensiering, for eksempel endotelceller ^10. I kontrast, for eksempel, klonal analyser av ASCs viser at bare en undergruppe er i stand til å gjennomgå osteogenic differensiering in vitro ^11. I siste instans vil skjelettet tissue engineering arbeidet sannsynlig innlemme en osteocompetent stamcelle (som PSCs) med eksogene vekstfaktorer og en osteoconductive stillas (slik som HA-PLGA brukes i dagens metoder) slik at den best helbrede skjelettet mangler.