Summary
الخلايا الجذعية البشرية حول الوعاء (الأمنية) هي الخلايا الجذعية فئة جديدة لتجديد الأنسجة العظمية مشابهة للخلايا الجذعية الوسيطة (MSCS). يمكن أن تكون معزولة الأمنية الخاصة من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية (مضان الفرز الخلية تفعيلها) من الأنسجة الدهنية المشتراة خلال إجراءات عملية شفط الدهون قياسي، ثم مجتمعة مع سقالة محرض عظمي لتحقيق تكوين العظام
Abstract
يمكن عزل الخلايا الجذعية البشرية حول الوعاء (الأمنية) في أعداد كافية من الأنسجة لأغراض متعددة من الهيكل العظمي والأنسجة 1-3 الهندسة. الأمنية الخاصة ويبلغ عدد سكانها FACS-فرزها من "pericytes '(CD146 + CD34، CD45-) و" خلايا براني "(CD146-CD34 + CD45-)، كل واحدة منها نحن في تقارير سابقة إلى أن خصائص الخلايا الجذعية الوسيطة. شركات الأمن الخاصة، مثل اللجان الدائمة، قادرة على الخضوع لتفريق المكونة للعظم، وكذلك تفرز السيتوكينات 1،2 الموالية للالمكونة للعظم. في هذا البروتوكول، علينا أن نبرهن على osteogenicity من شركات الأمن الخاصة في النماذج الحيوانية عدة بما في ذلك زرع عضلة الحقيبة في SCID (العوز المناعي المشترك الشديد) الفئران، وهو خلل SCID قبي الماوس وعيب الفخذ قطعي (FSD) في الفئران athymic. يتم استخدام الحقيبة عضلة الفخذ نموذج لتقييم خارج الرحم تكوين العظام. وتتركز عيوب قبي على العظم الجداري وهي standardly 4 ملم وقطرها (الحجم حاسمة) 8. FSDs هي bicortical واستقرت معشريط البولي ايثيلين و 4 K-الأسلاك. وFSD صفها هو أيضا عيب حجم الحرجة، والتي لا تلتئم بشكل ملحوظ في 4 الخاصة بها. في المقابل، إذا تم إضافة الخلايا الجذعية أو عوامل النمو إلى موقع الخلل، يمكن أن يكون موضع تقدير كبير تجديد العظام. الهدف العام المتمثل في xenografting PSC هو للتدليل على قدرة عظمية من هذا نوع من الخلايا في كل من حمل خارج الرحم وorthotopic نماذج تجديد العظام.
Protocol
1. حول الوعاء عزل الخلايا الجذعية
يوصف هذا في التفاصيل في "تنقية من ارتشاح الخلايا الجذعية من الإنسان النسيج الشحمي الأبيض" المتاخمة المادة، من قبل Corselli M. وآخرون.
2. سقالة الخلق
- والسقالات صنعت خصيصا لكل بروتوكول سبق نشرها من بولي (اللبنيك، شارك في حامض الجليكوليك) (PLGA، Burmingham بوليمر) مع طلاء هيدروكسيباتيت 4-6. هي ملفقة الأباتيت المغلفة السقالات PLGA من 85/15 PLGA بواسطة الصب المذيبات وعملية الترشيح الجسيمات. يتم إنشاء السقالات في شكل كروي (2 ملم قطر) لغرس الحقيبة في العضلات، وشكل القرصية (4 مليمتر في القطر) لغرس قبي، أو أسطواني (4 مليمتر في القطر، 6 مم في الطول) للعيوب قطعي الفخذ.
- لفترة وجيزة، PLGA / كلوروفورم حلول مختلطة مع السكروز (بوليمر / نسبة السكروز 5/95، ث / ث) وصبها في قالب قطره تفلون 200-300 ميكرون، لخلق سلبيات حسب الطلبtruct. بعد تجميد تجفيف بين عشية وضحاها، تتم إزالة السقالات من العفن تفلون ومنغمسين في DDH 2 O حل السكروز. يتم تطهيرها السقالات عن طريق الغمر في الايثانول 70٪ لمدة 30 دقيقة، تليها ثلاث يشطف من DDH 2 O.
- لطلاء الأباتيت، يتم إعداد محاكاة حل السوائل (SBF) الجسم عن طريق إذابة بالتسلسل CaCl 2، MgCl2 • 6H 2 O، NaHCO 3، و K 2 هبو 4 • 3H 2 O في DDH 2 O. وخفضت درجة الحموضة إلى 6 حل عن طريق إضافة حمض الهيدروكلوريك 1M لزيادة القابلية للذوبان. تضاف غ 2 SO 4، بوكل، وكلوريد الصوديوم ويتم ضبط درجة الحموضة إلى 6.5 النهائي (SBF 1).
- وقد أعد مجانا SBF (SBF 2) وذلك بإضافة CaCl 2 و K 2 هبو 4 • 3H 2 O في DDH 2 O ويتم تخفيض درجة الحموضة إلى 6 - MG2 + و HCO 3. تضاف بوكل وكلوريد الصوديوم ويتم ضبط درجة الحموضة إلى 6.8 النهائي. جميع الحلول العقيمة التي تمت تصفيتها من خلال membr 0.22 ميكرون PESانو (Nalgene). وذلك مباشرة قبل عملية الطلاء، والتي يتعرض لها المجففة السقالات PLGA إلى تفريغ الحفر توهج بلازما الأرجون (Harrick العلمي) لتحسين الرطوبة والتوحيد الطلاء.
- ثم يتم تحضين السقالات محفورا في SBF 1 لمدة 12 ساعة وتغير إلى MG2 + و HCO 3 - SBF الحرة 2 لآخر 12 ساعة على 37 درجة مئوية مع التحريك لطيف. تغسل السقالات المغلفة مع DDH 2 O لإزالة الأيونات الزائدة ومجفف بالتجميد قبل إجراء المزيد من الدراسات.
3. نموذج الحقيبة العضلات الزرع
- 100 ميكرولتر من تعليق PSC في برنامج تلفزيوني (الفوسفات مخزنة المالحة) يتم إسقاط بلطف على زرع PLGA القائم على كروية مباشرة قبل الغرس. وقد وصفت الخلايا مسبقا من قبل الإدراج lentiviral من luciferase المراسل اليراع، وذلك للسماح في غرس الجسم الحي تتبع آخر. كثافة الخلية هو 2.5 × 10 5 في الزرع.
- وتستخدم SCID (شديدة العوز المناعي المشترك) الفئران في 6 أسابيع من العمر. الحيوانات هي anesthetized عن طريق الاستنشاق وisoflurane premedicated مع البوبرينورفين (بيدفورد مختبرات). بعد إعداد Betadine القياسية، يتم إجراء شقوق الثنائية في hindlimbs (الطولية و2 مم في الطول).
- يتم قطع جيوب في العضلات ذات الرأسين الفخذية بواسطة مواز تشريح حادة في عضلة محور الألياف طويلة. لكل فأر، يتم إدراج زرع PLGA مقرها مع شركات الأمن الخاصة، وخياطة اللفافة التي تغمر العضلات مع Vicryl 5-0 (Ethicon).
- مغلق المقبل على الجلد مع Vicryl 5-0 في نمط تحت البشرة. يتم التعامل مع الحيوانات بعد العمل الجراحي مع البوبرينورفين لمدة 48 ساعة و TMP / SMX (ميثوبريم / سلفاميثوكسازول؛ Qualitest) لمدة 10 أيام.
4. نموذج العيب قبي الزرع
- بعد التخدير isoflurane من الفئران SCID (12-14 أسابيع من العمر)، يتم قص الشعر والجلد تطهيرها مع betadine لكل بروتوكول.
- يتم إجراء شق الجلد 8 ملم على طول الدرز السهمي منتصف القبة من الماوس. المقبل، وcalvتتم إزالة بلطف ارييل سمحاق بواسطة Q-طرف تطبيق.
- المقبل، وذلك باستخدام الماس المغلفة بت منقب في تدريبات عالية السرعة الأسنان، ويتم إنشاء العظم الجداري 4 ملم عيب. العيب هو سمك كامل - ولكن الحرص على عدم إصابة الأم الجافية الكامنة.
- يوضع بعد ذلك على الطلب PLGA القائم على زرع مع شركات الأمن الخاصة engrafted برفق في موقع الخلل. كثافة الخلية هو 2.5 × 10 5 في الزرع. أخيرا، وخياطة الجلد مع Vicryl 6-0. يتم التعامل مع الحيوانات بعد العمل الجراحي مع البوبرينورفين لمدة 48 ساعة و TMP / SMX لمدة 10 أيام.
5. على فخذي نموذج العيب القطاعي الزرع
- الفئران Athymic (12-14 أسابيع من العمر) هي تحت تخدير استنشاق isoflurane. عظم الفخذ هو نقيت وأعد لكل بروتوكول قياسي مع betadine (الشكل 1).
- يتم إجراء شق 27-30 ملم طولية على الجانب الأمامي من الفخذ. ثم يتعرض للجسم الفخذ عن طريق الفصل بين خطوط الطول المتسعةeralis العضلة ذات الرأسين وعضلات الفخذ (الشكل 2).
- لتحقيق أقصى قدر من الاتساق في تجديد العظام، وتتم إزالة تماما السمحاق المغطي الخلل الفخذ مع قطعة مقطوعة الفخذ.
- يتم وضعها على السطح الأمامي من عظم الفخذ صفيحة البولي ايثيلين (الطول، و 4 ملم طول و 23 ملم؛؛ العرض، 4 ملم). لوحة تحتوي على ست حفر ما قبل حفر لاستيعاب 0.9 مم قطر الخيوط أسلاك كيرشنر (زيمر). أخذ لوحة كقالب، يتم حفر 6 الخيوط أسلاك كيرشنر خلال لوحة والقشور على حد سواء (الشكل 3).
- المقبل، مع شفرة المنشار تتأرجح الصغيرة (سترايكر، MI)، ويتم إنشاء 6 ملم منتصف جدلي عيب. يتم التعامل مع العيوب ثم قطعي من قبل ادراج يزرع PLGA القائم والتي كانت محملة الخلايا حسب بروتوكول (الشكل 4).
- يتم إغلاق عضلة المغطي وفآسيا مع خيوط 4-0 امتصاص Vicryl لتأمين زرع في مكان، وخياطة الجلد.
6. في التقييمات فيفو
- وتجرى عمليات التقييم الشعاعي بطريقة طولية من قبل كل من XR عالية الدقة وعالية الدقة μCT (الصغرى التصوير المقطعي) تحليل. لتحليل μCT (Skyscan 1172F)، يتم فحص الصور بدرجة وضوح 19،73 ميكرومتر (100 كيلو فولت و 100 مللي أمبير مصدر إشعاع، وذلك باستخدام 0.5 مم الألومنيوم فلتر). ويتم تحليل الصور باستخدام DataViewer، ريكون، CTAn، والبرمجيات CTVol.
- ويتم أيضا تصوير تلألؤ بيولوجي بطريقة تسلسلية لتقييم خلية engraftment، والسلامة، والانتشار واحدة غير والهجرة من موقع الزرع. أن يتم التصوير التألق الحيوي باستخدام جهاز IVIS الثاني لومينا (الفرجار علوم الحياة). وكميا باستخدام ضوء مخرجات البرامج الحية صورة (Xenogen). ويسجل إجمالي الناتج ضوء الفوتونات في / 2 / متر مربع / سم ستيراديان.
- يتم إجراء التحليل النسيجي والقياس النسيجي بعد الوفاة. البقع الروتينية المستخدمة تشمل ثلاثي الألوان ماسون، وزرقة الأنيلين، صentachrome، والأحمر Picrosirius. يتم إجراء تحليل القياس النسيجي بسهولة مع أزرق الأنيلين أو البقع pentachrome، والذي يظهر عظماني الأزرق الداكن والأصفر، على التوالي. وتحسب بكسل في مجال تعمل بالطاقة العالية باستخدام أداة العصا السحرية في أدوبي فوتوشوب.
7. ممثل النتائج
لأن كلا من العيوب قبي والفخذ حاسمة الحجم، ينبغي أن لا يتوقع الشفاء كبيرة من دون علاج مع عوامل النمو أو الخلايا الجذعية الخارجية.
من حيث المناورات الجراحية، ينبغي أن تشريح العضلات تكون الحقيبة على طول طائرات لفافي، وبالتالي يجب أن يكون واجه النزف ضئيلا للغاية. حتى لو تم تنفيذ نموذج الحقيبة العضلات على الصعيد الثنائي، وينبغي أن الفأر أن نمشي مع سهولة في اليوم التالي للجراحة 1. لقبي عيب، واجه النزف ولكن يمكن أن تكون غارقة مع * نصيحة. ينبغي الحرص الشديد على عدم إصابة الأم الجافية الأساسية - حيث سيؤدي ذلك إلى التدخلمع العلاج العادي. لنموذج FSD، والحرص على عدم إيذاء الأوعية الدموية الرئيسية حتى لا تسبب النزيف أو العصب الفخذي لمنع الضرر العصبي. يتم حفر أسلاك كيرشنر مع ضغط لطيف حتى لا تتلف العظام القشرية في هذه العملية.
الشكل 1. قبل الجراحة استعدادا لعيب القطاعي فخذي (FSD) في الجرذان Athymic. الفئران الذكور (12-14 أسابيع من العمر) هي تحت تخدير استنشاق isoflurane. عظم الفخذ هو نقيت وهيأهم لكل بروتوكول قياسي مع betadine.
الشكل 2. الجراحية التعرض للفخذي القطاعي خلق (FSD) عيب. يتم إجراء شق طولي 27-30 مم على الجانب الأمامي من الفخذ. ثم يتعرض الجانب الوحشي للجسم الفخذ عن طريق الفصل بين الوحشية المتسعةوالعضلة ذات الرأسين عضلات الفخذ.
الشكل 3. لتثبيت عظمة الفخذ القطاعي خلق (FSD) عيب. يتم وضعها على السطح الأمامي من عظم الفخذ صفيحة البولي ايثيلين (الطول، و 4 ملم طول و 23 ملم؛؛ العرض، 4 ملم). لوحة تحتوي على ست حفر ما قبل حفر لاستيعاب 0.9 مم قطر الخيوط أسلاك كيرشنر. أخذ لوحة كقالب، يتم حفر 6 الخيوط أسلاك كيرشنر خلال لوحة والقشور على حد سواء. المقبل، ويتم إنشاء 6 ملم منتصف جدلي عيب. مرة واحدة يتم تنفيذ هذا، يتم إدراج مباشرة على السقالة حسب المقاس الذي يناسب بالضبط موقع الخلل (لا يظهر).
الشكل 4. مثال من العيب قبي ما بعد الجراحة. يتم إنشاء 4 مم، عيب قبي دائرية في عظم الجداري الحق في الفئران athymic. المصورة هنا هو موقع الخلل مزروع معالأمنية الخاصة في 8 أسابيع بعد العملية الجراحية. لاحظ وجود عظام جديدة داخل موقع الخلل.
Discussion
يوصف جيدا عزلة الأمنية الخاصة 1-3 في مكان آخر، بما في ذلك منشور [جوف] المقدمة على حدة تتناول على وجه التحديد بروتوكولات العزلة PSC والأساليب. غرض محدد من هذه المقالة لوصف وشرح 3 بروتوكولات لتطبيق PSC في الجسم الحي لتكوين العظام / تجديد. عضلة الماوس SCID الحقيبة هو نموذج الشائع وصفها للخارج الرحم تكوين العظام البشرية 7. وجود اختلافات مهمة بين النماذج (العيب) خارج الرحم وorthotopic عن العظام، بما في ذلك التفاعل نظير الصماوي مع خلايا العظام المكونة للمضيف 8، فضلا عن وفرة من العوامل المكونة للعظم الإشارات موجودة في المكروية خلل الهيكل العظمي. وتعرض اثنين من العيوب هنا، وdefect8 قبي وعيب قطعي الفخذ 4. كلاهما موثقة جيدا إلى أن تكون حاسمة الحجم (أي لن تلتئم من تلقاء نفسها).
الاختلافات المثيرة للاهتمام وجود عيوب بين قبي والفخذ. أولا،الخلية: التفاعل بين الخلية الأمنية الخاصة xenografted والخلايا الذاتية هي مختلفة جدا. من حيث وجود خلل قبي، الأمنية التفاعل مع الأم الجافية الأساسية (الطبقة الخارجية للسحايا)، فضلا عن تلك الخلايا بانية العظم والخلايا سمحاقي يقيد موقع الخلل. الأهم من ذلك، التفاعل بين الخلايا المزروعة وبانيات المحيطة 8، أو الخلايا المزروعة ودورا وراء (ليفي وآخرون، تحت الطبع) ذات أهمية حاسمة لالخلايا الجذعية العادية توسط تكون العظم والمضي قدما. من حيث خلل في القطعة الفخذ (FSD)، ويتعرض الأمنية xenografted إلى زنزانة مختلفة جدا، والبيئة خلوى. على سبيل المثال، ويتكون الموقع من FSD الجذعية وخلايا اللحمة المتوسطة المرافق له، وكذلك في بطانة، السمحاق وبانيات العظام الطويلة. نظريا، كل خلية لديها رد فعل الخاصة به إلى الإصابة، وبعضهم قد يكون خلية: التفاعلات الخلية مع xenografts PSC.
فروق واضحة بين وجود غيرها من قبيوالعيوب الفخذ. عظام قبي تشكل في البداية من خلال التعظم الغشائي، في حين أن العظام الطويلة تشكل من خلال وسيط الغضروف (غضروفي التحجر). وعلاوة على ذلك، فإن عملية تعويضية بعد الاصابه أيضا يقلد هذه الأصول التنموية. بعد FSD، ويلاحظ غضروف تشكيل الكالس، في حين لم تتشكل المتوسطة الغضروف داخل الجداري خلل العظام. أخيرا، قد يكون منشأ جنينية من الجمجمة تختلف عن تلك في العظام الطويلة. مشتق من قمة العصبية (mesectoderm)، في حين أن الهيكل العظمي الزائدي هو من اشتقاق الأديم المتوسط مجاور للمحور (9) والغالبية العظمى من الجمجمة (في منطقة الرأس كله بما في ذلك الخلايا المحيطة بالأوعية - - pericytes). ربما كل هذه الاختلافات تؤدي إلى اختلافات كبيرة في مجال إصلاح العظام PSC بوساطة.
استخدام شركات الأمن الخاصة لديها العديد من الفوائد على الخلايا الدهنية المشتقة من انسجة التقليدية (ASCs). الأمنية الخاصة لا تتطلب ثقافة وتمثل سكان خلية تنقية مبادرة الخوذ البيضاءالفصل لا يتضمن الخلايا اللحمية الأخرى التي لا تشارك في - ويمكن أن تنظم حتى سلبا - التمايز المكونة للعظم، مثل الخلايا البطانية 10. في المقابل، على سبيل المثال، تحليلات نسيلي من ASCs تبين أن فقط جزء من السكان قادرون على تمييز تمر المكونة للعظم في المختبر 11. في النهاية، سوف الهيكل العظمي جهود هندسة الأنسجة تتضمن على الارجح الخلايا الجذعية osteocompetent (مثل شركات الأمن الخاصة) مع عوامل النمو الخارجية وسقالة osteoconductive (مثل HA-PLGA المستخدمة في الأساليب الحالية) وذلك لرأب أفضل العيوب الهيكل العظمي.
Disclosures
كيه، شركة بريتيش بتروليوم، وخدمات العملاء والمخترعين من براءات الاختراع حول الوعاء خلية جذعية ذات الصلة المقدمة من جامعة كاليفورنيا. دائرة الاستعلام والأمن. KT، وخدمات العملاء هي مؤسسي Scarless مختبرات شركة التي الباطن حول الوعاء الخلايا الجذعية المتعلقة براءات الاختراع من الحكام جامعة كاليفورنيا. الدكتور شيا سو هو أيضا ضابط من شركة Scarless، مختبرات
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل في وقت مبكر بالحركة CIRM جائزة البحث الثاني TR2-01821، المعاهد الوطنية للصحة / NIDCR (منح R21 DE0177711 وDE01607 RO1)، جامعة كاليفورنيا في اكتشاف جرانت 07-10677، AWJ وRKS يكون T32 تدريب الزمالات الجوائز (5T32DE007296-14)، JNZ لديه زمالة التدريبية CIRM (TG2-01169).
References
- Crisan, M. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3, 01-13 (2008).
- Chen, C. W. Perivascular multi-lineage progenitor cells in human organs: regenerative units, cytokine sources or both. Cytokine Growth Factor Rev. 20, 429-434 (2009).
- Corselli, M., Chen, C. W., Crisan, M., Lazzari, L., Peault, B. Perivascular ancestors of adult multipotent stem cells. Arterioscler. Thromb Vasc. Biol. 30, 1104-1104 (2010).
- Zara, J. Nell-1 enhances bone regeneration in a rat critical sized femoral segmental defect model. Plast. Reconstr. Surg. , Forthcoming (2010).
- James, A. W. Deleterious Effects of Freezing on Osteogenic Differentiation of Human Adipose-Derived Stromal Cells In Vitro and In Vivo. Stem Cells Dev. 20, 427-439 (2011).
- Lee, M., Chen, T. T., Iruela-Arispeb, M. L., Wu, B. M., Dunn, J. C. Y. Modulation of protein delivery from modular polymer scaffolds. Biomaterials. 28, 1862-1870 (2007).
- Aghaloo, T. A study of the role of nell-1 gene modified goat bone marrow stromal cells in promoting new bone formation. Mol. Ther. 15, 1872-1880 (2007).
- Levi, B. Human Adipose-Derived Stromal Cells Stimulate Autogenous Skeletal Repair via Paracrine Hedgehog Signaling with Calvarial Osteoblasts. Stem Cells Dev. 20, 243-257 (2011).
- Leucht, P. Embryonic origin and Hox status determine progenitor cell fate during adult bone regeneration. Development. 135, 2845-2854 (2008).
- Rajashekhar, G. IFATS collection: Adipose stromal cell differentiation is reduced by endothelial cell contact and paracrine communication: role of canonical Wnt signaling. Stem Cells. 26, 2674-2681 (2008).
- Zuk, P. A. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol Cell. 13, 4279-4295 (2002).
