富达的RNA病毒和病毒的突变频率的表征的变种的分离

Summary

本文介绍了分离和鉴定RNA聚合酶的保真度变体的RNA病毒，以及如何利用基因突变频率的数据，以确认在​​组织培养中的保真度的变化所需的步骤。

Abstract

RNA病毒的RNA依赖的RNA聚合酶复制其基因组。这些酶的本质差错率高是一个大的贡献极端种群的多样性，有利于病毒的适应和进化的一代。越来越多的证据表明，内在的错误率，以及由此产生的RNA病毒的突变频率，可调制微妙的病毒聚合酶的氨基酸变化。虽然生化分析存在一些病毒的RNA聚合酶，允许注册成立的保真度的定量测量，在这里我们描述了一个简单的方法测量的RNA病毒，已被证明是确定高保真改变突变的生化方法的准确突变频率。该方法使用传统的病毒学和测序技术可以在大多数生物实验室进行。我们与许多不同的病毒经验的基础上，我们已经确定，必须进行优化，以增加隔离高保真的变种，并产生统计意义的数据的可能性的关键步骤。高保真改变突变的分离和表征聚合酶的结构和功能^1-3可以提供新的见解。此外，这些高保真的变种可以成为有用的工具表征病毒的适应和^演变 4-7机制。

Protocol

1。确定的范围，是微创细胞毒性诱变剂浓度这次演习的目的是要确定什么样的诱变剂的浓度范围，可没有多余的细胞毒性的感染过程中使用。从本质上讲，你将要重现，将病毒感染所需的条件。对于大多数病毒，感染去年2至7天。准备足够的板，在每一天的样品细胞。如果使用非贴壁细胞，相应地修改协议。 前一天的实验中，种子7 × 10 5的HeLa细胞/在6孔板，实现融合子（75％）单层实验当天。用不同浓度的诱变剂，每孔的钢板将被视为允许6浓度范围。 在实验的日子，准备在组织培养基中的诱变剂稀释。对于HeLa细胞，用一系列0到1000μM基类似物（病毒唑，5 -氟脲嘧啶，5 -氮胞苷），MgCl 2的 0至50毫米，和MnCl 2 0至5毫米。 从水井吸中期和更换2毫升诱变培养基中，并返回到孵化器。 每24小时，使用一盘细胞检查细胞活力。这可以通过台盼蓝染色或使用商品化的荧光/发光检测（如Promega公司的CellTiter – GLO ®发光细胞活性测定）。 台盼蓝拒染法，从一板（不同浓度的诱变剂处理），并轻轻颗粒细胞离心分离细胞。 丢弃上清液用PBS悬浮细胞（血清可以干扰与染色）。 1体积的0.4％台盼蓝为2分钟，在室温下孵育，混合细胞悬液，用PBS 1卷。 在hemacytometer，可行的（未染色）和非可行的细胞（蓝染）计数。计算的活细胞，每个浓度的诱变剂，包括未经处理的对照的百分比。我们发现，低于50％的感染端点的细胞死亡（时达到最高滴度）的结果是理想的诱变电阻的隔离条件。 2。确定了最佳的无毒诱变剂浓度，适度降低病毒滴度（约减少0.5-2日志） 这次演习旨在确定诱变剂的浓度，将对无过mutagenizing人口很强的选择性压力，。对于RNA的诱变，我们发现，与此相对应10.5-2日志在降低病毒滴度。这些浓度，每一个基因组变异至少有一个或两个位置。诱变剂，可帮助在抗突变，然后将超过通过选定的一代。如果引入太多的突变（诱变剂的浓度非常高），抗突变的突变体轴承本身是致命的诱变，妨碍他们隔离。 与使用相同的条件下，作为第1步细胞种子板在实验的日子，准备在组织培养基中的诱变剂稀释。使用的浓度相同的范围内确定，但排除导致浓度在50％以上的细胞死亡。准备足够的中等覆盖每口井的两倍（4毫升每口井），从而感染细胞前的预处理，每个浓度的诱变。 吸与诱变剂的诱变剂，辅以2个小时的中等孵化中期和预处理细胞。对于大多数类型的细胞，这是诱变剂吸收充足的时间。 取出介质和病毒感染低的多重感染的MOI中体积最小（0.1或0.01）（200μL6孔板）。孵育15-60分钟，以使病毒感染细胞。摇滚定期板，以确保接种覆盖单层细胞。 吸接种病毒，并用2 ml PBS洗两次，尽可能删除的接种。 添加诱变剂的适当的浓度相当于3-6复制周期为每口井，并培育细胞的培养基。 收获病毒从每口井，确定病毒滴度的抗病毒效果。这是可以做到的标准斑块检测或限制稀释（TCID 50） 。注：病毒定量检测技术措施只有RNA的合成，可能不适合，因为可能无法检测到的诱变效应。例如含有致死突变诱变基因组的可能仍然是QRT – PCR检测，但不会在观察病毒的可行性分析。 从计算的滴度，确定10.5-2日志，也是不高毒性细胞（理想情况下，低于50％的毒性）诱变剂的浓度，降低病毒滴度（比未经处理的控制感染）。 3。分离和确定fication的诱变剂抗药性的变种在上面定义的最佳诱变剂的浓度执行人口大通道和整个系列通过检查病毒滴度。作为对照，通过增长没有任何诱变中的病毒。作为另一个控制，监视潜在的缺陷干扰颗粒（DI）的出现，通过在每个步骤（unpassaged控制）的诱变剂的情况下执行新的感染。 感染，种子25厘米的前一天2烧瓶中，用1.5 × 10 6 HeLa细胞（可用于其他烧瓶大小）来获取子汇合单层翌日。 在感染的一天，预处理细胞2小时，用含有每个诱变剂的最佳浓度，在第2条中确定的中期。 取出介质，并在一个教学语言1或最大的教学语言，这并不导致缺陷干预“（DI）粒子形成，正在研究的病毒感染，体积最小的细胞。 感染后30-60分钟，吸接种，并用PBS洗两次，然后在适当的浓度与诱变剂补充新鲜培养基添加。 孵育时间确定的期限内第1和2，对应在这些条件下的最大病毒滴度。收获的子代病毒。 滴度病毒在每个段落和重复的前3个步骤。 在第几段，诱变剂处理的样品的病毒滴度应相应下降，相比原来的病毒滴度和控制（未处理和unpassaged）病毒滴度。如果诱变剂的病毒滴度传样品回升未经处理的对照相同的水平，人口可能含有诱变剂的抗药性变异。最多可能需要20或30通道，虽然我们之间的5年和15通道隔离大部分我们的高保真变种。 一旦对于一个给定的通过一系列的病毒滴度为未经处理的对照滴度达到相同的幅度，包括从同一通道数量的未经处理的对照样品中提取的RNA。可用于RNA提取试剂盒或Trizol法提取。 使用放大利息病毒聚合酶或复制酶基因的引物进行RT – PCR检测。在第二个步骤，整个基因组（至少编码区）应测序研究耐药表型是否映射到其他病毒的基因以及。基地模拟诱变剂，如病毒唑，病毒和细胞功能的影响等方面，这一点尤为重要。在这种情况下的变异可耐这些其它抗病毒药活动之一，并不会是一个高保真的变种。 净化使用PCR纯化试剂盒和序列获得的抗诱变剂，人口共识序列的RT – PCR产物。包括背景测序错误控制（见讨论）。 序列比对软件和病毒的一致序列作为参考使用，对齐序列。确定新的点突变，特别注意任何通过病毒滴度达到正常水平，只出现在诱变处理人口。如果这种突变是不存在的，在前面的段落，而不是从相同的通道数（指示细胞培养传代适应）未经处理的对照目前的，那么这种突变是可能负责的，至少部分，诱变阻力。不要依赖所谓基地序列（序列的纯文字版）和校准软件单独。少数人可能已经错过峰对齐软件检查的色谱图。占总人口的20-30％的突变体仍然会显示为一个高峰，但太小，被确定为“N”标准序列分析。 4。一旦突变已经确定，分离或产生变异和耐药表型确认几个RNA的诱变接下来，提出确定突变的变种是孤立的，以确认其链接到的耐药表型。至关重要的是，涉嫌改变高保真的突变是在遗传背景干净的研究（即不提出额外的突变基因组中的其他地方）。在最好的情况，存在的传染性cDNA克隆，将允许在现场指挥在一个干净的遗传背景的突变抗诱变变异的股票代。在这种情况下，第4节是没有必要的。但是，如果一个cDNA克隆是不可用，隔离可以通过斑块纯化病毒所述，。可能需要一个以上的一轮斑块净化隔离在一个干净的，遗传背景的变种。 斑块检测的诱变耐药突变的分离。 为了分离鉴定突变，执行琼脂糖（0.5％至1％，最终WT /卷），在6孔板覆盖下的一个标准斑块检测。准备系列稀释的病毒，基于股票滴度，DILutions，将产生10和50以及分隔斑块之间。 当斑清晰可见（通常为2至5天感染后，病毒），标志着斑块板的位置，并使用一个P200移液器过滤嘴，轻轻地投身通过琼脂糖被覆盖的提示小心，不要打跑和移位叠加的位置（这将导致交叉污染，个别斑）。 小心地抬起覆盖的一角和转让琼脂糖插件中包含在一个含有250μL介质和涡的小指尖端。不要担心，如果被删除，提示不包含琼脂糖，许多RNA病毒，许多RNA病毒的平均斑块包含10 5病毒和足够的金额将被转移斑块表面接触笔尖简单。 拿起10％诱变剂治疗斑块。根据测序确定突变的色谱，估计约为人口的百分比，包含所需的突变。目的是孤立的突变三个或四个斑块。这些突变也将进行额外的，不必要的突变，稍后将通过测序鉴定。 从这些样本中提取的RNA（但节省一半的样本作出更大的病毒的股票），并执行的RT – PCR产物，将允许整个基因组的测序。 ，平均RNA病毒将包含两个方面的共识序列突变差异，因此，序列3或4斑块一次纯化病毒包含所需的突变，没有任何额外的突变，以确定隔离。 一旦确定，所有下游的研究，这种病毒的一个较大的股票，使用上面获得的牌匾纯化样品来感染更多的细胞，如8×10的6 HeLa细胞在T75烧瓶烧瓶.. 确认赋予确定的突变诱变剂的敏感性/抗性。 使用隔离或新生成的克隆和野生型控制在类似条件下编写的病毒，在第2条中的重复实验中使用的诱变剂浓度范围内，或集中在抗突变产生。 使用几种不同的RNA诱变条件（病毒唑，5 -氟脲嘧啶，5 -氮胞苷，增加镁离子，锰2 +）。聚合酶变异，如果是一个以上的诱变耐，那么它更有可能的是这种变异是高保真。另外，它是可能的，抗突变为一个单一的诱变条件具体化，特别是因为这些化合物的一些影响RNA病毒，通过一些机制 8 。 5。检查复制率由于富达改变突变，最常见的地图聚合酶，它是相同的聚合酶突变可能将大大改变复制动力学和重要的是要确定在复制的相似之处和差异，将允许更好的突变频率差异比较下面执行。要做到这一点，至少有两个免费的方法研究复制 – 检查病毒生产和另一个检查RNA的合成。 一步病毒生长动力学前一天的实验，种子以及所需的板，每一个时间点进行测试板。每个突变体和野生型病毒，可​​以考虑使用一式三份井。 在一天的实验，去除培养基，每种病毒感染MOI为10井，以确保每一个细胞同时感染。 30-60分钟，在37 ° C。 岩石板，每10分钟，以避免干燥的细胞单层。清除病毒，并用2 ml PBS洗两次。重要的是尽可能去除的接种。更换生长培养基。 随着时间= 0，收获病毒感染从一个板块。返回板的孵化器和收获病毒在跨越一个复制周期（如3H，5H，7H，9H，12H，24小时）的定期。 滴度病毒，收获，在每个时间点（如斑块的检测，TCID50，FFU的检测）和滴度随时间的生长曲线图。 RNA的合成反应动力学 RNA的合成反应动力学可以监视使用下面的方法之一。如果可能，应使用相同的样本，以确定一个步骤的生长动力学的用于测量RNA水平。 QRT – PCR。此过程提供了在一个大的范围内复制的高度量化措施，从几个基因副本> 10，根据检测的灵敏度。设计引物和探针，包括一个高度保守的基因组区域的一个小片段（<200 bp的）。 </l我> Northern blot分析。虽然低于QRT – PCR定量，这项技术允许目视确认，复制的结果，在全长基因组并没有显着的链终止聚合酶基因突变的结果发生。 记者基因的表达。如果一个cDNA克隆，表达报告基因（如荧光素酶）是可用的，那么这可能被用来作为替代研究复制能力。然而，重组病毒不应该被用于其他应用程序（如突变频率测定）选择性压力，因为这种病毒不会是相同的，尤其是因为这些病毒有一种倾向，删除插入的记者基因。 6。测量突变频率这是一个关键的一步确认，确定聚合酶突变抗诱变改变复制的保真度。重要的是要注意的是这里的突变测量频率不突变率 。必须要确定利率，非常小心的复制动力学测量（RNA的合成和复制​​周期的长度）。然而，突变频率的因素，只要通过历史和复制动力学监测，提供重现性好，复制的定量措施保真度。突变频率可以决定在可行的病毒的数量（斑块克隆或限制稀释），或在总病毒的数量（病毒的股票或上清液）。要确定突变频率，准备从后面的通道（如通过2或超越）储存的天花病毒。重要的是，病毒的数量已扩大其遗传多样性更接近一个突变选择平衡。 可行的病毒人口的突变频率这种方法虽然比较费力，给多少突变的平均保留复制能力的基因组上的信息。但是，应该指出，将出现更高的健身变种的偏见和健身较低，可行的变种，不容易斑块，例如，可能不会被发现。因此，它也允许更好的措施的代名词（DS）和非同义（DN），可用于探索无论是正面的选择是对人口的核苷酸替换。然而，将被量化，因为较少的突变，需要大量的序列进行统计分析。这种技术依赖于个别病毒隔离，要么斑块净化或限制稀释，如上面所述。作为一个起点，我们建议48个人的“克隆”的野生型病毒和抗诱变变异隔离。以这种方式分离每个克隆的人口预计进行的创始人基因组提出的任何突变。 RNA的量目前在孤立的斑块或限制稀释，一般通过RT – PCR扩增足够。如果有必要，很短的扩增上最小的细胞数（如24孔板格式）（不到一个复制周期）可以用来获得更多的RNA，但是，最低放大应该执行，以避免新的基因突变的积累。请注意，每个克隆和人口相比必须接受相同数量的复制周期。 孤立的斑块净化或限制稀释24到48个病毒克隆。 从孤立的无性系种群中提取核糖核酸 RT – PCR技术扩增片段，覆盖了每个样品3KB。最好是盖的结构蛋白区域，这往往要忍受比非结构基因的保守区域更为可行的突变。 净化的PCR产物，序列，并进行基因突变分析（第7条）。 病毒总人口的突变频率虽然第二种方法的优点是即使是低的健身变种将被包括在测序，允许更广泛的突变谱。但是，它可能不是理想的系统发育分析，假设可行的病毒的人群（如DN / DS值），并确定最相关的突变，因为（改变RNA的结构，停止密码子，戏剧性的氨基酸的变化）没有被完全确定的致命性的变化在分析中，将保留。不过，这种技术允许研究人员获得的最显着性的数据时，有一个缺乏一个在体外生化分析确认保真的改动。这种技术依赖于RT – PCR检测病毒颗粒的总RNA，包括低健身或致死突变，不会产生斑块的基因组的扩增。通过这种方法获得的突变频率可以比斑块或有限稀释克隆更高的10倍。 从病毒粒子总人口中提取核糖核酸 RT – PCR仪一个800至1200财政年度核苷酸，是已知的容忍突变和遗传变异（如结构蛋白）的基因编码序列的一部分地区。较大碎片不会容易插入到克隆载体如TopoTA和转化会产生数量不足。虽然更小的片段，甚至更好，基因组测序的覆盖面可能会太少，获得统计学意义。至少有800 bp的片段允许用两个引物序列覆盖率，是一个很好的妥协之间的序列覆盖率最大化，最大限度地降低测序成本。我们发现，70和100之间的序列覆盖800个核苷酸地区，可重复确认我们已经在实验室中研究的变种改变保真度。请注意，其他的向量/克隆方法，可以使用具有同等效率。 使用商业套件或按标准提取DNA /沉淀净化RT – PCR产物。 如果您使用的RT – PCR酶不产生出挑，履行加入1微米（ATP）和Taq DNA聚合酶的10分钟扩展以下TopoTA克隆制造商的说明对于每一个病毒的人口进行研究，选择了96个殖民地，有一个积极插入XGal涂层板蓝/白筛选确定。最初，测试，为每个不同区域的基因组中克隆的插入的存在，琼脂糖凝胶或单菌落PCR质粒大小检查，以确认蓝/白筛选的有效性。使用片段大小和上述条件，我们达到90％阳性 1毫升LB培养基中生长在液体中的肉汤各殖民地在一夜之间在96孔细菌培养板第二天，准备在96孔板格式minipreps。 序列中的每盘有足够的引物（例如用于RT – PCR引物，或TopoTA M13引物），以获得克隆段最大的覆盖范围。执行突变分析（第7条）。 7。序列分析每个人口和适当的校准软件使用参考或一致序列进行序列分析。我们建议Lasergene或Sequencher，可以很容易地识别单核苷酸多态性方面达成共识。 将使用相应的软件（如Lasergene或Sequencher）的序列。 放弃质量差序列（坏的基本通话，太多的“N的长度太短）。确定这是覆盖所有序列的核苷酸范围。由于基因组的不同地区都会或多或少容忍突变，进行比较的原因至关重要的是，同一区域的完全覆盖每个序列的克隆分析保留。因此，如果几个顺序反应执行每克隆一序列为一个给定的克隆失败，丢弃的克隆分析（所有序列）。 识别和计数参考株不同的SNP。 计算突变频率除以总数的核苷酸序列（无性系的X地区序列的长度数量）的总数确定的SNPs。提出这个数字，平均每10K NT测序突变数量呈现更加人性化，然后离开每核苷酸。例如，对于野生型人口中的表1，第55 mutations/121，978 X万总核苷酸= 4.51每10,000个核苷酸突变测序。 如果相同的SNP的克隆的大量出现，目前这两个值，包括或排除这些重复的突变。一般来说，从同质父（斑块净化或感染性克隆）和病毒传代，只有在细胞培养中的几次人口，积极选择并没有施加其影响足以引起相同的SNP和基因突变的积累频率测量值这种方法更好地体现正面或净化选择影响最小的聚合酶的错误频率。 确定突变的分布。设为克隆数的排名名单在每一个人口，目前0，1，2，3等..在该地区的突变测序。 成对距离比较计算病毒种群的多样性。从清洗和手动编辑序列准备对齐，包括参考区域。有几个对齐方案可供选择：CLUSTALW / X（ http://www.clustal.org/ ），肌肉（ http://www.drive5.com/muscle/ ），Ebiox公司为Mac用户（ http://www。 ebioinformatics.org / / Ebiox公司 ）等，确保您的序列是相同的长度，如果有必要的作物。这是建议的序列的开始，是一个编码的密码子，以方便后分析。我们建议保持FASTA格式，这是很容易读取的大多数软件中的所有路线。 <li>来执行成对的距离分析，计算出所有可能属于同一人群的序列之间的两两比较。然后，可以在比较中发现的平均突变计算表明人口的异质性。 可以很容易获得的代名词（DS）和非同义内的人口（DN）的值。我们找到有用的MEGA软件（http://www.megasoftware.net/）和用户友好的这种分析。 为了获得选择的方向，我们举两个可能性，尽管它们不是唯一可能的。 1）获取DN和DS之间的比例。值大于1的意思是积极的选择。值低于1意味着净化选择。 2）使用Datamonkey的网络服务器（ http://www.datamonkey.org/） 。 FASTA格式上传您的路线，并与斯坦福线性加速器中心模块进行分析。这会给你一个DN / DS估计。 进行统计分析。根据数据的数量和序列数，可用于各种测试。一些研究依赖于卡方测试的总人数与总人数的共识，所有克隆相结合，9个核苷酸突变。其他的研究已经进行了Fisher的精确检验，介绍与序列的突变序列没有突变10数目计算。如果有足够的突变数据产生，我们建议进行排名，如曼惠特尼美国和检验，要做到这一点，目前在每个RNA测序的基因突变的数量排名每种病毒的人口数量的克隆。曼惠特尼然后将测试在人口的突变分布差异。出于这个原因，我们建议至少有800个碱基对排序，以增加寻找与多个基因突变克隆的可能性。这个测试是可靠的，但需要较大的样本量。另一方面，它不要求对所比较的两个人群，相同的样本大小（例如，从表1中的样品是 n 1 = 148 和 N 2 = 84 ）。 8。代表性的成果： 剂量的诱变细胞活力和病毒的生存能力浓度依赖效应， 如图1所示，在这个例子中，我们发现，病毒通过在100微米AZC目标10.5-2日志降低病毒滴度，但HeLa细胞存活率病毒感染所需的2天期间不会受到负面影响。这导致病毒序列通过100微米AZC浓度选择的试点实验，选择诱变阻力。图2显示了初始滴度减少，诱变剂的耐药表型的出现。在中诱变剂的前几段，致死突变的积累，发生在病毒滴度显着下降。渐渐地，抗诱变剂的变种出现，它的出现恰逢回归没有从未经处理的对照不同的病毒滴度。在这个阶段，一个病毒的人口大比例呈现耐药变异。此病毒的人口测序揭示了氨基酸的改变（S）负责。一旦确定，隔离或新生成的，诱变，抗病毒可能比野生型不同RNA的诱变“（基地不同的结构类似物，例如）的敏感，图3显示了一种RNA诱变剂抗柯萨奇B3病毒滴度高于野生型存在病毒唑，5 -氟尿嘧啶，和5 -氮胞苷，MgCl 2的高和MnCl 2。广泛的抗诱变的RNA复制的保真度增加的一个重要指标。验证的保真度变异的复制动力学是野生型病毒类似，将有助于突变频率比较图4描绘了一步增长的高保真的变体动力学与野生型相比。如果复制率和最终滴度不相似，那么步骤应该采取比较的病毒类似规模的人口，经历了轮复制相同数量。 RNA的合成率和复制的保真度之间的联系没有得到很好的特点，特别是在体内。较慢的复制率可能会导致在一个下降的突变频率更高的保真度，虽然这不是一个绝对的规则，如在图4所示。上述参数确定后，富达变种和野生型的人群的突变频率可以相比，获得遗传确认改变复制的保真度。图5显示了一个野生型和高逼真度变异的序列比对，确定点突变。的突变都计算在内，根据每个克隆的基因突变（表1）数量排名，并作为％人口的平均突变频率代表，每10,000个核苷酸序列，如图6。 <p clasS =“jove_content”> 图1。确定最佳的条件来选择RNA的诱变性：保留具有中等（1-2日志病毒滴度下降 ）HeLa 细胞的细胞活力，表示浓度与利巴韦林治疗，在教学语言，并与野生型柯萨奇B3病毒感染为0.01。感染后48小时内，子代病毒收获和TCID 50测定滴度。台盼蓝染色确定，是尚存在48小时内处理的细胞的百分比，表示X轴下方。结果表明，浓度为100和200μM病毒滴度不影响细胞活力，减少1-2日志。 图2。适中浓度的RNA诱变存在的串行通道选择诱变抗性种群 。，在这个数字中，基孔肯雅病毒在HeLa细胞传代50微米利巴韦林（灰色长条）的存在。控制通道进行病毒唑的情况下（黑网吧）。每一个通道后，病毒的后代进行了量化经典BHK细胞斑块检测。诱变效应是显而易见的，在第一通道（P0开始人口相比，P1和P2），经处理后的病毒滴度下降2日志。渐渐地，滴度返回到正常水平（未经处理）。通过5诱变处理人口相比，未经处理的观察无显着差异，表明已选定抗药性的变种。事实上，人口的共识测序鉴定独特的人口接受利巴韦林治疗病毒突变。 图3。广泛耐药确认RNA不同结构的诱变 。在这里显示，高保真A372V柯萨奇B3病毒的变种，最初是在第3节中描述的屏幕隔离产生感染性克隆，并检测其不同浓度的相对灵敏度不同的RNA诱变剂（利巴韦林，5 – 氟脲嘧啶，5 – 氮胞苷）。 HeLa细胞治疗与利巴韦林表示浓度，并与野生型柯萨奇B3病毒感染MOI为0.01。感染后48小时内，子代病毒收获和TCID 50测定滴度。这里展示的是野生型（实线）和A372V变异（虚线）作为诱变剂浓度的功能滴度。 A372V一贯滴度高于所有的测试条件下的野生型。 图4。复制率和保真度的变种 ，要确定病毒的生产的一步生长动力学，HeLa细胞在MOI = 10感染，无论是野生型（实线），高保真变种A372V（长破折号）或复制缺陷的变种Cx64 （短柯萨奇B3病毒的破折号）。在时间点指出，病毒的后代，从细胞和冻融上清和收获滴定TCID 50。 A372V保真度增加，不配合，在组织培养中观察到的复制缺陷。变种Cx64提出了一个复​​制过程中的动力学的重大延误，最高达到1000倍，比野生型病毒的滴度。 图5。对齐TopoTA克隆序列，每个病毒的数量 ，使用第7条，RT – PCR产物克隆获得每个序列中所描述的方法可能源于一个单一的，独特的基因组病毒总人口内，因此，进行独特的基因突变。该图显示了一个典型的路线，清理质量低劣的序列和单核苷酸多态性的可视化。总的SNPs（这个数字10）在人口都计算在内，并指出，出现在每个克隆的单核苷酸多态性的数目。例如，强调了克隆酒吧，包含2个独特的基因突变，而其他8个克隆中包含一个单一的，独特的基因突变。这个数据是用来编译表1。要查看这个数字更大的版本， 请点击这里。 图6。图形表示病毒的人群中的突变频率， 更容易解释。，序列和统计分析得到的数值数据可以表示为一个图表，或直方图（如图所示）。 A372V病毒产生比野生型较少的突变，并呈现显着降低的突变频率（*，P <0.01）。 Cx64的变种，复制滴度，压力比野生型低1000倍经济需求测试相同的突变频率（NS，不显着），显示复制速度和保真度没有必然的联系。该病毒是否股票相同的基孔肯雅病毒（CHIKV）人口提供类似的突变频率， 或 10 5倍稀释，用于RNA提取。 突变分布进行统计分析总结。 注：对于每个克隆，至关重要的是，相同的基因组区域（序列的长度）覆盖。在这种情况下，859％克隆核苷酸。这是统计分析的关键。另一方面，用于统计分析的秩和测试不要求的样本大小是相同的，研究人员是免费的，比较不同样本大小的人口。因此，野生型的142个克隆，可以比较的84个克隆的A372V。 ＃克隆与N基因突变 野生型 A372V 7突变 0 0 6突变 0 0 5突变 0 0 4突变 0 0 3突变 1 0 2突变 6 2 1突变 40 14 0突变 95 68 共有突变 55 18 总的克隆测序 142 84 总核苷酸测序 121978 72156 Mutations/10 4新台币 4.51 2.49 表1。突变分布进行统计分析的简要说明：对于每个克隆，至关重要的是，覆盖相同的基因组区域（序列的长度）。在这种情况下，859％克隆核苷酸。这是统计分析的关键。另一方面，用于统计分析的秩和测试不要求的样本大小是相同的，研究人员是免费的，比较不同样本大小的人口。因此，野生型的142个克隆，可以比较的84个克隆的A372V。

Discussion

细胞株的选择。诱变作为RNA碱基类似物的疗效相关，他们通过不同类型^的细胞11的相对摄取。通常病毒通过使用的细胞系，如果被证明是难治性诱变剂吸收或过于敏感（高细胞毒性），它可能需要使用另一个细胞系，以满足这些要求，仍然是宽松的病毒复制。一旦诱变阻力变异是孤立的，其余的表征，可以在原有的首选细胞株。 HeLa细胞在我们的经验，很容易采取诱变; BHK细胞需要多达10倍浓度较高和Vero细胞难治性诱变剂吸收。

选择在试图孤立高保真变种诱变处理，成功的可能性增加，如果使用一个以上的诱变诱变剂。基地模拟诱变不同的结构，在复制过程中的基因组中被错误地将主要在一个特定子集，在随后的复制周期的基因突变诱导的结果：利巴韦林治疗有^利于 GtoA和CtoU过渡突变12; 5 -氮胞苷也有类似的偏见，与此外CtoG和GtoC颠^13; 5 -氟尿嘧啶优先诱导AtoG和UtoC转换^14。另外，较高浓度的Mg ^{2 +的}或Mn ^{2 +}可以补充介质，以提高整体RNA病毒的基因突变频率无^上述 12所描述的偏见。根据病毒的密码子序列，密码子的变化，需要生成一个高保真的变种，这些条件将有利于比别人出现这种变异。对于更高的保真度的脊髓灰质炎病毒G64S和柯萨奇病毒A372V，利巴韦林治疗最容易选择的变种，因为在密码子网站的要求AtoG过渡与主要由这三氮唑核苷产生的突变。

教学语言与人口规模 ，病毒学，组织培养感染的协议特别注意感染复数（MOI），以避免缺陷干扰颗粒（低MOI）的积累，促进病毒之间的重组（高MOI），例子。要选择通过串口传代出现的事件，它也是重要的考虑病毒的人口规模。由于最初在低频存在耐药突变，最好是从一个通道传输尽可能大的人口规模^{（10 5 -10} 6病毒，例如），以避免失去在每个通过这些新兴的变种。扩大井或烧瓶的大小（感染细胞的数量），可能有助于减少在教学语言的增加，如果这种担心。另一方面，低MOI感染病毒的敏感性诱变正在测试的实验，是为了增加在实验中发生的复制周期和更高的健身基因组，以避免救援诱变基因组，通过互补，在共同感染的细胞。这是很重要的，因为第一轮的复制过程中产生的后代基因组的突变不会立即检测。这些诱变的RNA大多数仍然会被包装成病毒颗粒。这是目前在这些基因组的致死突变会导致中止复制周期，减少病毒滴度在感染下一轮。这可能是必要允许致死突变的一个显着的效果观察前几轮积累的突变。最后，如​​果在通过一系列的诱变剂存在，病毒滴度继续下降，直至灭绝，那么研究者应​​尽量传代病毒在逐渐增加（从一个非常低的的浓度开始）诱变的金额。

分离和RNA的RNA的抗诱变人口的抗诱变剂从克隆的一代。RNA的诱变引入多个随机突变每个基因组，但电阻的选择只会丰富（和修复共识序列）抗突变。为了确定这种基因突变，我们序列的诱变抗性种群人口的共识，而不是个别的病毒。因此，单一的随机突变，诱变创建序列中没有检测到，只有在达成共识的变化，下面的选择，结果发现突变。根据我们的经验，我们只能识别一个或两个这样的共识序列的变化。一旦获得诱变抗性种群和抗突变是确定的，这是必要的，产生这种变异的更纯粹的股票。上面，我们描述了一个空斑纯化过程。另外，如果感兴趣的病毒不容易识别斑块，所需的变异可能purifIED通过有限稀释。这种做法实质上是一种TCID _50，低于50％的水井受到感染该病毒的股票是稀释在96孔板格式。使用这种稀释，采取上述相同的方法是，在隔离多达10个人的变种，并确认它们的DNA序列。如前所述，在最好的情况下，一种传染性病毒株的cDNA克隆可用。变种的隔离，因此没有必要。在我们的经验，保真度的变异是单一的氨基酸替代的结果，因此可以使用简单的商业化的突变试剂盒，如Quikchange（安捷伦）。一个次要的选项，使用密切相关的病毒株的cDNA克隆。但是，如果使用的是一个相关的应变，我们强烈建议使用这种方法和病毒分离（如斑块净化），因为我们发现，同样的保真度改变两个密切相关的病毒突变不一定会具有相同的效果。

富达和复制。RNA的抗诱变剂变种的选择，导致类似野生型^对口 4,12,15与生长特性，在更高和更低的保真度变种的隔离。目前尚不完全清楚，聚合酶的活性率和保真度之间的联系。在体外用纯化的RNA聚合酶的生化研究表明，保真度更高的变种处理速度较慢，而较低的保真度变种往往有更快^的处理1-3,12。在组织文化中，这些差异通常并不明显，这表明，资源的可用性，而不是内在的聚合酶的活性动力学，是限速步骤。如果从野生型没有显着不同的动力学复制的保真度变异，然后比较其基因突变频率可以直接作出。如果复制过程中的动力学的存在非常显着的变化，那么数据应该归帐户动力学差异，例如，通过比较，都发生了相同数量的病毒复制周期。在我们的经验，观察野生型和高逼真度的变体之间虽然在一步生长动力学无显着差异，我们观察到，保真度更高的变种一贯滴度较高（1日志内）与野生型相比略少，但他们核糖核酸（内在同一量级），进一步表明，他们生产的基因组包含更少的突变，因而，更具传染性。

样品制备和测序。对于在这些协议中的所有步骤，当务之急是高保真，校对酶用于PCR和RT – PCR检测，以限制引入额外的突变，因为他们不能从生物学相关的基因突变杰出。这是至关重要的病毒相比人口已准备在相同的条件下（通过历史，组织培养基，温度，RNA提取方法，RT – PCR检测等）也很重要，以确保足够的起始原料获得RNA的提取等，通过RT – PCR产生强烈的乐队是。一个1 / 100稀释的RNA样品也应给予检测RT – PCR检测带，表明样品中含有足够数量的RNA分子，以避免代表性偏差（反复放大相同的基因组）。由于基因突变频率分布，人们所期望的，将获得类似的价值观无论人口规模，提供上述偏见是没有发生。如图6所示，10 ⁵倍稀释病毒存量给人一种不从父母的股票明显不同的基因突变频率。

直到发现TopoTA克隆的最佳条件，确认后，在场的插入，蓝/白筛选殖民地之前测序的PCR。作为一个突变噪声控制（RT – PCR和测序引入突变），从质粒在体外转录RNA病毒基因组相对应的轴承相同的病毒序列和/或克隆和序列RT – PCR产物的克隆PCR产物（BE知道，在体外转录酶的不同有不同的错误率，可能不会给的有用信息的真实背景，在你的程序错误）。一些病毒序列可能有毒细菌，所以重要的是要验证，才决定在地区的病毒基因组测序基因突变频率。在分析所TopoTA获得的序列，请注意，每个克隆应该只包含一个插入/序列。如果双峰观察，表明混合的人口，这是可能的，被选中两个相邻的细菌菌落。它也是可能的，虽然不大可能在细菌复制的突变频率低，在细菌培养的突变质粒的扩增期间推出。在斑块p双峰urified人口，可能代表重叠的斑块，或病毒，即获得一个新的突变或恢复斑块的发展过程中的突变。一致，并决定是否进行计数或不能指望这些突变。

最后，请记住，这里所用的突变频率是相对值。他们是有效的，只有在比较，在相同条件下生长的病毒人口，并在同一区域的测序！他们不应该被视为突变率，或整个基因组的突变频率的绝对值。然而，当条件控制，他们允许重现性好，在突变的分布和频率差异的定量比较。

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
ribavirin	Sigma	R9644-10MG
5-fluorouracil	Sigma	F6627-1G
5-azacytidine	Sigma	A2385-100MG
MgCl2	Sigma	M1028-100ML
MnCl2	Sigma	M1787
Trypan blue	Sigma	T8154-20ML
TopoTA cloning kit	Invitrogen	10351021
Quikchange mutagenesis kit	Agilent	200516	If a cDNA infectious clone is available
96-well miniprep kit	Macherey-nagel	740625
Lasergene, Sequencher	DNAstar, Gene Codes Corporation	www.dnastar.com www.genecodes.com	Or other alignment software