Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Isolering av Fidelity Varianter av RNA-virus och karakterisering av virus mutationsfrekvensen

doi: 10.3791/2953 Published: June 16, 2011

Summary

Den nuvarande artikeln beskrivs de steg som krävs för att isolera och karakterisera RNA-polymeras trohet varianter av RNA-virus och hur man använder data mutationsfrekvensen bekräfta trohet förändringar i vävnadskultur.

Abstract

RNA-virus använder RNA-beroende RNA-polymeras att replikera sina genom. Den inneboende höga felprocenten av dessa enzymer är en stor bidragande orsak till uppkomsten av extrema befolkningstäthet som underlättar virus anpassning och utveckling. Ökande bevis visar att den inneboende felfrekvensen, och den resulterande frekvenserna mutation, RNA virus kan moduleras genom subtila aminosyra förändringar av virala polymeraset. Även biokemiska analyser finns för vissa virus-RNA polymeraser som medger kvantitativt mått på införlivandet trohet, här beskriver vi en enkel metod för att mäta mutation frekvenser av RNA-virus som har visat sig vara så noggranna som biokemiska metoder för att identifiera trohet ändra mutationer. Den metod som använder konventionell virologiska och sekvensering tekniker som kan utföras i de flesta biologiska laboratorier. Baserat på vår erfarenhet med ett antal olika virus har vi identifierat de viktiga steg som måste optimeras för att öka sannolikheten att isolera trohet varianter och generera data av statistisk signifikans. Den isolering och karaktärisering av trohet ändra mutationer kan ge nya insikter i polymeras struktur och funktion 1-3. Dessutom kan dessa trohet varianter vara användbara redskap i kännetecknar mekanismer virus anpassning och utveckling 4-7.

Protocol

1. Bestämma området för mutagena koncentrationer som är minimalt giftigt för celler

Syftet med denna övning är att avgöra vad olika mutagena koncentrationer kan användas vid en infektion utan överdrifter celltoxicitet. I huvudsak kommer du vill återskapa de förhållanden som kommer att krävas för virusinfektion. För de flesta virus, infektioner varar mellan 2 och 7 dagar. Förbered tillräckligt plattorna provkuvetterna på varje dag. Om icke-häftande celler används, ändra protokollet om detta.

  1. På dagen före försöket, utsäde 7 x 10 5 HeLa celler / brunn i en 6-brunnar som ger en sub-konfluenta (75%) monolager dagen för experimentet. Varje brunn i plattan kommer att behandlas med en annan koncentration av mutagena, vilket möjliggör en rad 6 koncentrationer.
  2. På dagen för experimentet, förbereda mutagent utspädningar i vävnadsodling medium. För HeLa celler använder en rad från 0 till 1000 mikroM för bas-analoger (ribavirin, 5-fluorouracil, 5-azacytidine), 0 till 50 mm för MgCl 2, och 0 till 5 mm för MnCl 2.
  3. Sug mediet från brunnarna och ersätt med 2 ml mutagent-kompletteras medium och återgå till inkubatorn.
  4. Var 24 timmar, väljer du en tallrik av celler att kolla cellviabiliteten. Detta kan göras genom att utföra trypan blå färgning eller med hjälp kommersialiseras fluorescens / luminiscens analyser (t.ex. Promega är CellTiter-Glo ® Luminescent cellernas livskraft test).
  5. För trypan blå utanförskap färgning, lossnar celler från en platta (som behandlats med olika koncentrationer av mutagent) och försiktigt pellet celler genom centrifugering.
  6. Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i PBS (serum kan störa färgning).
  7. Blanda 1 fjädring volym cell i PBS med en volym på 0,4% trypan blå, inkubera i 2 minuter i rumstemperatur.
  8. I en hemacytometer, räkna livskraftiga (ofärgade) och icke livskraftiga (blå färgade celler). Beräkna andelen livskraftiga celler för varje koncentration av mutagener, inklusive obehandlad kontroll. Vi finner att tillstånd som resulterar i mindre än 50% celldöd av infektionen endpoint (när maximal titrar uppnås) är idealiska för isolering av mutagen motstånd.

2. Bestämma den optimala icke giftig mutagent koncentration som måttligt minskar virus titer (ca 0,5-2 log reduktion)

Denna övning syftar till att bestämma koncentrationen av mutagena som kommer att utöva ett starkt selektivt tryck, utan att över-mutagenizing befolkningen. För RNA mutagena, finner vi att detta motsvarar 10,5-2 loggar minskningar virus titer. Vid dessa koncentrationer är varje genomet muterat i minst en eller två positioner. Den mutagen får stöd i generationen av motståndet mutation, som sedan väljs på passagen. Om för många mutationer införs (vid mycket höga mutagent koncentrationer), kommer mutanter med motståndet mutationen själva dödligt mutagenized, vilket hindrar deras isolering.

  1. Seed plattor med celler med samma villkor som för steg 1
  2. På dagen för experimentet, förbereda mutagent utspädningar i vävnadsodling medium. Använd samma serie koncentrationer som fastställts enligt ovan, men inte koncentrationer som resulterade i att över 50% celldöd. Förbered tillräckligt medel för att täcka varje brunn två gånger (4 ml per brunn), vilket möjliggör en förbehandling av celler innan infektion med varje koncentration av mutagen.
  3. Aspirera på medellång och förbehandla celler med mutagena genom inkubering i mutagent-kompletteras medium för 2 timmar. För de flesta celltyper, detta är gott om tid för upptag av mutagen.
  4. Ta bort medium och infektera med virus med låg mångfald av infektion MOI (0,1 eller 0,01) i en minsta volym (200 l för 6-brunnars plattor). Inkubera i 15-60 minuter så att viruset att infektera celler. Rock plåten med jämna mellanrum för att säkerställa att inokulatet täcker cellen monolager.
  5. Aspirera inokulerade viruset och tvätta två gånger med 2 ml PBS för att ta bort så mycket av inokulatet som möjligt.
  6. Lägg till mediet med lämpliga koncentrationer av mutagener till varje brunn och inkubera celler för motsvarande 3-6 replikering cykler.
  7. Harvest virus från varje brunn och bestämma antiviral effekt på virus titer. Detta kan göras genom standard plack analys eller begränsa utspädning (TCID 50). OBS: Kvantifiering av virus genom metoder som mäter bara RNA-syntes kanske inte passar eftersom mutagena effekter inte kan upptäckas. Mutagenized genomet innehåller dödliga mutationer kan fortfarande detekteras med QRT-PCR till exempel, men skulle inte observeras i analyser virus livskraft.
  8. Från den beräknade titrar, fastställa den koncentration av mutagen som reducerar virus titrar (jämfört med obehandlad kontroll infektion) med 10,5-2 stockar som inte heller är mycket giftigt för celler (helst mindre än 50% toxicitet).

3. Isolering och identifieringklassificering av mutagena resistenta varianter

Utför stora passager befolkningens storlek i den optimala mutagena koncentration definieras ovan och kontrollera viruset titer över passagen serien. Som en kontroll, passage virus i tillväxt medium utan någon mutagen. Som en annan kontroll för att övervaka potentiella uppkomsten av defekta störande partiklar (DI), utför färska infektioner i frånvaro av mutagen vid varje passage steg (unpassaged kontroll).

  1. På dagen innan infektionen, utsäde 25 cm 2 kolvar med 1,5 x 10 6 HeLa celler (andra kolv storlekar kan användas) för att få sub-konfluenta monolager följande dag.
  2. På dagen av infektionen, förbehandla celler för 2 timmar med medium som innehåller den optimala koncentrationen av varje mutagent bestämts enligt punkt 2.
  3. Ta bort medium och infektera celler med en minsta volym på ett MOI 1 eller den största MOI som inte leder till defekta störande (DI) partikelbildning för viruset som studeras.
  4. Efter 30-60 minuter av infektion, aspirera inokulat och tvätta två gånger med PBS och tillsätt sedan färsk mediet kompletteras med mutagent vid lämpliga koncentrationer.
  5. Inkubera under den tid som bestäms i avsnitt 1 och 2 som motsvarar maximal virus titer under dessa förhållanden. Harvest avkomman viruset.
  6. Titer virus vid varje passage och upprepa tre föregående stegen.
  7. Under de första avsnitten, bör virus titrar av mutagener behandlade prover släppa detta, jämfört med den ursprungliga viruset titer och kontroll (obehandlat och unpassaged) virus titer. Om virus titrar av mutagener passerats prover klättra tillbaka till samma nivåer som den obehandlade kontroll innehåller befolkningen sannolikt en mutagen resistent variant. Upp till 20 eller 30 passager kan behövas, även om vi isolerade delen av vår trohet varianter mellan 5 och 15 stycken.
  8. När virus titrar för ett givet stycke serie når samma storleksordning som den obehandlade kontroll titrar, extrahera RNA från alla prover inklusive obehandlad kontrollgrupp från samma passage nummer. RNA-extraktion kit eller Trizol utvinning kan användas.
  9. Utför RT-PCR med hjälp av primers som förstärker polymeras eller replicase gener av virus av intresse. I ett andra steg bör hela arvsmassan (minst kodande regioner) ska sekvenseras att undersöka om motståndet fenotyper kartan för att andra virus gener också. Detta är särskilt viktigt för bas analoga mutagena, såsom ribavirin, vilket påverkar andra aspekter av virus och cellernas funktion. I detta fall variant kan vara resistenta mot en av dessa andra antivirala aktiviteter och kommer inte att vara en trohet variant.
  10. Rena RT-PCR-produkter med en PCR-rening kit och sekvens för att erhålla mutagena resistenta sekvens befolkningen konsensus. Inkludera bakgrund reglage för sekvensering fel (se diskussion).
  11. Med hjälp av en programvara sekvens anpassning och viruset konsensus sekvens som en referens, anpassa sekvenser. Identifiera nya punktmutationer, med särskild uppmärksamhet på något som verkar uteslutande i den behandlade mutagent befolkningen vid passage där viruset titrar når normala nivåer. Om denna mutation inte finns i tidigare passager och inte i obehandlade kontroller från samma passagen nummer (som anger anpassning till cellodling passage), då denna mutation är sannolikt ansvarig, åtminstone delvis, mutagena motstånd. Lita inte på basen kallade sekvens (textversionen av sekvensen) och anpassning programvara ensam. Kontrollera kromatogram för minoriteters toppar som kan ha missats av anpassning programvara. En mutant som representerar 20-30% av den totala befolkningen kommer fortfarande att visas som en topp, men för små för att identifieras som ett "N" av standard sekvensanalys.

4. När en mutation har identifierats, isolera eller generera variant och bekräfta Fenotypisk resistens mot flera RNA mutagena

Därefter är den variant som presenterar de identifierade mutationen isolerade för att bekräfta sin koppling till motståndet fenotyp. Det är viktigt att mutationen misstänkt för att ändra trohet studeras i en genetiskt ren bakgrund (det vill säga inte presentera ytterligare mutationer på andra ställen i genomet). I bästa läget finns en smittsam cDNA klon som skulle möjliggöra skapandet av ett lager av den mutagena resistenta varianten av plats riktad mutagenes på en ren genetisk bakgrund. I detta fall är avsnitt 4 inte nödvändigt. Men om ett cDNA klon inte är tillgänglig, kan isolering göras genom plack rening av viruset, som beskrivs nedan. Mer än en omgång av plack rening kan krävas för att isolera variant på en ren, genetisk bakgrund.

  1. Isolering av mutagena resistenta mutanter av plack-analysen.
    1. Att isolera identifierade mutant, göra en vanlig plack analys i agaros (0,5 till 1% sista WT / vol) overlay i 6-brunnars plattor. Förbered spädningar av viruset, baserat på lager titrar, till DILutions som kommer att ge mellan 10 och 50 väl avskilt plack.
    2. När plack syns tydligt (vanligtvis 2 till 5 dagar efter infektion, beroende på virus), markera placeringen av plack på plattorna och använder en P200 pipett med filter spets, försiktigt doppa spetsen genom agarosen overlay försiktigt så att inte lossa och flytta overlay position (vilket skulle resultera i korskontaminering av enskilda plack).
    3. Lyft försiktigt spetsen av överlägget och överföra agaros plugin i spetsen för en Eppendorf innehåller 250 l av medium och skaka. Oroa dig inte om spetsen som avlägsnas inte innehåller agaros, för många RNA virus, innehåller i genomsnitt plakett för många RNA virus 10 5 virus och en tillräcklig mängd kommer att överföras helt enkelt genom att trycka på tips till ytan av plack.
    4. Plocka upp till 10 plattor per mutagen behandling. Beroende på kromatogram av sekvensering som identifierade mutationen, uppskatta ungefär hur stor andel av befolkningen som innehåller den önskade mutation. Målet är att isolera tre eller fyra plattor med mutationen. Några av dessa mutanter kommer också att ytterligare oönskade mutationer, som senare kommer att identifieras med sekvensering.
    5. Utdrag RNA från dessa prover (men spara hälften av provet för att göra ett större lager av virus) och utföra RT-PCR som kommer att möjliggöra sekvensering av hela genomet. I genomsnitt kommer RNA-virus innehålla upp till två mutationsstatus skillnader i förhållande till den konsensus som sekvens, alltså, sekvens 3 eller 4 plack renat virus åt gången för att identifiera de isolera som innehåller de önskade mutationen utan ytterligare mutationer.
    6. När detta har skett, göra en större lager av detta virus för alla nedströms studier med hjälp av plack renade provet som erhållits ovan för att infektera en större flaska av celler, t ex 8x10 6 HeLa celler i en T75 kolv ..
  2. Bekräfta mutagen känslighet / motstånd som är knutna till de identifierade mutationen.
    1. Med hjälp av isolerade eller nyligen genererade klon, och en vild typ kontroll virus beredd på liknande villkor, upprepa experimenten i avsnitt 2 med antingen ett komplett utbud av mutagent koncentrationer, eller den koncentration där motståndet mutation skapades.
    2. Använda flera olika RNA mutagena förhållanden (ribavirin, 5-fluorouracil, 5-azacytidine ökade Mg 2 +, Mn 2 +). Om polymeras variant är resistent mot mer än ett slags mutagent, så är det mer troligt att denna variant är hög trohet. Alternativt är det möjligt att ett motstånd mutation är specifik för en enda mutagena tillstånd, särskilt eftersom vissa av dessa ämnen påverkar RNA virus via ett antal mekanismer 8.

5. Kontrollera replikering priser

Eftersom fidelity-ändring mutationer oftast karta till polymeras, är det möjligt att samma polymeras mutation avsevärt kommer att förändra replikering kinetik och det är viktigt att fastställa likheter och skillnader i replikering som kommer att möjliggöra en bättre jämförelse av skillnader i mutation frekvenser görs nedan. För att göra det undersöker replikering av minst två kostnadsfria metoder - en som undersöker viruset produktion och en annan som undersöker RNA-syntes.

  1. Ett steg virus tillväxt kinetik
    1. På dagen före försöket, utsäde 6-brunnars plattor som behövs, en tallrik per tidpunkt som ska testas. Överväg att använda tre exemplar brunnar för varje mutant och vildtypsvirus.
    2. På dagen för experimentet, ta bort medium och infektera brunnar med varje virus vid en MOI på 10 för att säkerställa att varje cell samtidigt är infekterad. Inkubera 30-60 minuter vid 37 ° C.
    3. Rock plattorna var 10 minuter för att undvika uttorkning av cellen monolager. Ta bort virus och tvätta två gånger med 2 ml PBS. Det är viktigt att ta bort så mycket av inokulatet som möjligt. Ersätt med tillväxt medium.
    4. Efter infektion vid tiden = 0, skörd viruset från en tallrik. Återgå plattorna till inkubatorn och skörda de virus med jämna mellanrum som sträcker sig över en enda replikering cykel (t.ex. för 3H, 5H, 7h, 9h, 12h, 24h).
    5. Titer virus, skördas vid varje tidpunkt (t ex plack analys, TCID50, FFU assay), och plotta tillväxtkurvor för titer mot tiden.
  2. Kinetiken av RNA-syntes
    Kinetiken för RNA-syntesen kan övervakas med hjälp av en av de metoder som anges nedan. Om möjligt bör samma prover som användes för att bestämma ett steg tillväxt kinetik användas för att mäta RNA-nivåer.
    1. QRT-PCR. Detta förfarande ger mycket kvantitativa åtgärder föröka sig över ett stort område, från några få genomet kopiorna till> 10 10, beroende på hur känslig analysen. Design primers och prober som täcker ett litet fragment (<200 bp) av ett starkt konservativa genomisk regionen. Northern blot analys. Även mindre kvantitativa än QRT-PCR, medger denna teknik visuell bekräftelse på att replikering resulterar i full längd genom och att inga betydande kedjeavbrott uppstår som en följd av polymeras mutation.
    2. Redovisning av en reporter gen. Om ett cDNA klon som uttrycker en reporter gen (t.ex. luciferas) är tillgängligt, då detta kan användas som ett surrogat för att undersöka replikationsförmåga. Bör dock rekombinant virus inte användas för andra tillämpningar (t.ex. bestämning av mutation frekvens) sedan selektionstryck som agerar på detta virus inte kommer att vara samma, i synnerhet eftersom dessa virus har en tendens att ta bort de infogade reporter genen.

6. Mät mutation frekvenser

Detta är ett kritiskt steg i att bekräfta att de identifierade polymeras mutation ger resistens mot mutagent förändrar replikering trohet. Det är viktigt att notera att mutationen frekvenserna mäts här är inte mutationen priser. För att bestämma priser, en mycket noggrann mätning av replikering kinetik (mängden RNA syntetiseras och längd replikationscykeln) måste vägas in Mätning mutation frekvenser dock så länge som passage historia och kinetik replikering följs, ger reproducerbara, kvantitativa mått på replikering trohet. Mutation frekvenser kan bestämmas antingen i livskraftiga virus befolkningen (plack kloner eller begränsa utspädning) eller i den totala virus befolkningen (virus lager eller supernatanten). För att avgöra mutation frekvenser, förbereda viruslagren från en senare passage (t.ex. passage 2 eller längre). Det är viktigt att viruset befolkningen har haft tid att expandera sin genetiska mångfald närmare en mutation urval jämvikt.

  1. Mutation frekvenser av livskraftiga virus population
    Detta tillvägagångssätt, även om mer mödosamt, ger information om hur många mutationer som finns på de genomsnittliga genomet som behåller replikering kompetens. Noteras bör dock att en bias för högre fitness varianter kommer att inträffa och lägre fitness, livskraftig varianter som inte lätt plack, till exempel inte kan upptäckas. Som sådan, tillåter det också bättre mått på synonym (DS) och icke-synonyma (DN) nukleotid byten som kan användas för att undersöka om positiv selektion agerar på befolkningen. Men eftersom färre mutationer kommer att kvantifieras, kommer ett större antal sekvenser behövas för statistisk analys. Denna teknik bygger på isolering av enskilda virus genom att antingen plack rening eller begränsa utspädning, enligt ovan. Som utgångspunkt rekommenderar vi isolering av 48 individuella "kloner" av vildtypsvirus och mutagena resistenta varianten. Varje klonat population isoleras på detta sätt förväntas bära vilken mutation grundare arvsmassan presenteras. Mängden RNA som finns i isolerade plack eller begränsa utspädningen väl i allmänhet räcker för amplifiering med RT-PCR. Vid behov kan en kort förstärkning (mindre än en replikation cykel) på ett minsta antal celler (t ex 24 brunnar-format) kan användas för att få mer RNA, men bör minst förstärkning utföras för att undvika ansamling av nya mutationer. Observera att varje klon och befolkning att jämföra måste genomgå samma antal replikering cykler.
    1. Isolera från 24 till 48 virus kloner av plack rening eller begränsa utspädning.
    2. Utdrag RNA från den isolerade klonat populationer
    3. RT-PCR förstärka ett fragment som täcker upp till 3KB för varje prov. Det är bäst att täcka de strukturella proteinet regionen, vilket tenderar att tolerera mer livskraftiga mutationer än mer konserverade regioner av icke-strukturella gener.
    4. Rena PCR-produkter, ordning och utföra mutation analys (avsnitt 7).
  2. Mutation frekvenser av totalt virus befolkningen
    Även en fördel med den här andra metoden är att även låg kondition varianter kommer att ingå i sekvensering, som möjliggör en bredare bild av det spektrum av mutationer. Men det kanske inte idealisk för fylogenetiska analyser som tar livskraftiga virus populationer (t.ex. DN / dS värden) och identifiering av de mest relevanta mutationer, eftersom dödliga förändringar (förändrad RNA struktur, stopp kodon, dramatiska aminosyra förändringar) kan inte helt identifieras och skulle behållas i analysen. Trots det denna teknik tillåter forskaren att få de mest statistiskt signifikanta uppgifter för att bekräfta ändring av trohet när det finns en brist på en in vitro biokemisk analys. Denna teknik bygger på RT-PCR-amplifiering av totalt virionens RNA, inklusive arvsmassa med låg kondition eller letala mutationer som inte kommer att producera plack. Mutationen frekvenser erhålls genom denna metod kan vara 10-faldigt högre än av plack eller begränsa utspädning kloning.
    1. Utdrag RNA från den totala virionens befolkningen
    2. RT-PCR förstärfy en 800 till 1200 nukleotid region från en del av arvsmassans kodande sekvens som är känt för att tolerera mutationer och har en genetiskt betingad varians (t.ex. strukturella proteiner). Större fragment kan inte sättas lätt i kloning vektorer som TopoTA och kommer att producera tillräckligt många transformants. Även mindre fragment är ännu bättre, kan täckningen av genomet sekvenserat vara för lite för att få statistisk signifikans. En skärva av minst 800 bp tillåter sekvens täckning med två primers och är en bra kompromiss mellan att maximera sekvens täckning och minimera sekvensering kostnader. Vi finner att mellan 70 och 100 sekvenser som täcker ett 800 nukleotid region reproducerbart bekräftar den förändrade trohet av de varianter som vi studerat i labbet. Observera att andra vektor / kloning metoder kan användas med samma effektivitet.
    3. Rena RT-PCR-produkten med ett kommersiellt kit eller med vanlig DNA-extraktion / nederbörd.
    4. Om RT-PCR enzymer du inte producerar ett överhäng, göra en 10 minuters förlängning genom att tillsätta 1 mikroM ATP och Taq-polymeras
    5. TopoTA klon enligt tillverkarens anvisningar
    6. För varje virus population som skall studeras, välj 96 kolonier, som kan anses ha ett positivt sätt med blå / vit screening på XGal plåt. Inledningsvis testa förekomsten av insatser för varje enskild genomet region skall klonas, för att bekräfta giltigheten av blå / vit screening av plasmid storlek screening på agarosgeler eller enstaka koloni PCR. Med hjälp av fragment storlek och villkor enligt ovan, får vi 90% positiva
    7. Öka varje koloni i flytande buljong över natten i 1 ml LB medium i 96 bra bakteriekultur plattor
    8. Nästa dag förbereder minipreps i 96-bra-format.
    9. Sekvens varje platta med tillräckligt primers (primers används för RT-PCR till exempel, eller TopoTA M13 primers) för att få maximal täckning av klonade segmentet. Utför mutation analys (avsnitt 7).

7. Sekvensanalys

Genomför sekvensen analyseras med hjälp av en referens eller konsensus sekvens för varje population och lämplig justering mjukvara. Vi rekommenderar Lasergene eller Sequencher som lätt kan identifiera SNP i förhållande till konsensus.

  1. Rikta in sekvenser med hjälp av lämplig programvara (t.ex. Lasergene eller Sequencher).
  2. Kassera dålig kvalitet sekvenser (dålig bas ringer, alltför många "N: s eller för kort i längd). Identifiera nukleotid område som omfattas av alla sekvenser. Eftersom olika regioner av genomet kommer mer eller mindre tolerera mutationer, för jämförelsens skull är det viktigt att samma region helt täckt för varje sekvenserat klon sparas för analys. Således, om flera sekvensen reaktioner sker per klon, och en sekvens misslyckas för en given klon, kasta klon (alla sekvenser) från analysen.
  3. Identifiera och räkna SNP som skiljer sig från referens stam.
  4. Beräkna mutationsfrekvensen genom att dividera det totala antalet SNP identifieras av det totala antalet nukleotider sekvenserat (antal kloner x längd regionen sekvenserade). Presentera detta nummer som genomsnittligt antal mutationer per 10K nt sekvenserat gör att antalet mer användarvänlig sedan lämna det som per nukleotid. Till exempel för den vilda typen befolkningen i tabell 1, 55 mutations/121, 978 totalt nukleotider X 10 tusen = 4,51 mutationer per 10.000 nukleotider kartlagt.
  5. Om samma SNP visas på ett stort antal kloner, presentera två värden som inkludera eller exkludera dessa upprepade mutationer. Generellt för ett virus population framställs av en homogen förälder (av plack rening eller från en smittsam klon) och passerats bara ett par gånger i cellkultur, har positiv selektion utövas inte dess effekter tillräckligt för att orsaka ansamling av samma SNP och mutationer frekvens värden som uppmätts på detta sätt bättre spegla fel frekvens polymeras med minimala effekter av positiv eller rening val.
  6. Bestäm mutation distribution. Gör en rangordnad förteckning över antalet kloner i varje population som presenterar 0, 1, 2, 3, etc. .. mutationer i regionen sekvenserat.
  7. Beräkna virala befolkningen mångfald genom parvisa avstånd jämförelse. Från den rengjorda och redigeras manuellt sekvenser förbereda en anpassning inklusive referensnummer regionen. Det finns flera anpassning program som finns tillgängliga: clustalw / X ( http://www.clustal.org/ ), muskler ( http://www.drive5.com/muscle/ ), EbioX för Mac-användare ( http://www. ebioinformatics.org / ebiox / ), etc. Se till att alla dina sekvenser är lika långa, beskära om det behövs. Det rekommenderas att i början av sekvenser är en kodning kodon att underlätta bakre analys. Vi föreslår att hålla alla de anpassningar i Fasta-format, som lätt kan läsas av de flesta program finns tillgängliga.
  8. Värden för synonym (DS) och icke-synonyma (DN) i befolkningen kan lätt erhållas. Vi finner MEGA programvara (http://www.megasoftware.net/) användbar och användarvänlig för denna typ av analys.
  9. För att få välja riktning vi ger två möjligheter även om de inte de enda möjliga. 1) Skaffa förhållandet mellan DN och DS. Värden större än 1 betyder positiv selektion. Värden lägre än 1 betyder renande urval. 2) Använd Datamonkey webbserver ( http://www.datamonkey.org/ ). Ladda upp dina anpassningar i Fasta-format och analysera dem med SLAC modulen. Detta ger dig en uppskattning av DN / DS.
  10. Utföra statistiska analyser. Beroende på mängden data och antalet sekvenser, kan en mängd olika tester användas. Vissa studier har förlitat sig på Chi square test av totala antalet mutationer kontra totalt antal konsensus nukleotider där alla kloner kombineras 9. Andra studier har utförts Fishers exakta test, beräknat på antal sekvenser presentera mutationer kontra antal sekvenser utan mutationer 10. Om tillräckligt mutationsstatus data genereras, rekommenderar vi att utföra en rankad summa test som Mann Whitney U. För att göra detta rang antalet kloner i varje virus population med antal mutationer som finns på respektive RNA-DNA-kod. Av Mann Whitney kommer att testa för skillnader i mutationen distribution av befolkningen. Av denna anledning rekommenderar vi att sekvensering minst 800 baspar, för att öka sannolikheten att hitta kloner med multipla mutationer. Detta test är robust, men kräver större urval. Å andra sidan, det gör det inte kräver samma stickprovsstorlek för de två populationerna som jämförs (t.ex. prover från tabell 1 n 1 = 148 och n 2 = 84).

8. Representativa resultat:

Den dosberoende effekt av mutagener koncentration på cellviabiliteten och virus överlevnad visas i figur 1. I detta exempel har vi funnit att virus passage i 100 mikroM AZC var reducerad hos virus titer av riktade 10,5-2 loggen, men HeLa cellviabiliteten var inte påverkats negativt under de två dagar som krävs för virusinfektion. Detta pilotprojekt ledde till valet av 100 mikroM AZC koncentration för seriell passage av viruset, för att selektera för mutagen motstånd. Figur 2 visar den första minskningen av titer, följt av uppkomsten av en mutagen motstånd fenotyp. Under de första ställen i mutagent, som dödliga mutationer ackumuleras, förekommer en betydande nedgång i virus titer. Gradvis framträder en mutagen-resistent variant en dess uppkomst sammanfaller med en återgång till virus titer inte skiljer sig från obehandlade kontroller. I detta skede presenterar en stor andel av viruset befolkningen motståndet mutation. Sekvensering av detta virus population avslöjar aminosyra förändring (s) ansvarig. När detta har skett, och isolerade eller nyligen genererade kan mutagena-resistent virus vara mindre känsliga än vild typ till olika RNA mutagena (bas analoger av olika struktur, till exempel). Figur 3 visar en RNA-mutagen resistent Coxsackie virus B3 att titrar högre än vildtyp i närvaro av ribavirin, 5-fluorouracil, och 5-azacytidine och hög MgCl 2 och MnCl 2. Brett motstånd mot RNA mutagena är en stark indikator på ökad replikering trohet. Kontrollera att replikering kinetik trohet variant liknar vildtypsvirus kommer stöd i jämförelsen av mutation frekvenser. Figur 4 beskriver en steg-för tillväxt kinetik en hifi-variant jämfört med vild typ. Om replikering priser och slutlig titer inte är lika, då åtgärder bör vidtas för att jämföra virus populationer av liknande storlek, som har genomgått samma antal rundor av replikering. Kopplingen mellan RNA-syntes takt och replikering trohet är inte väl karakteriserade, särskilt i vivo. En långsammare replikering takt kan resultera i ett minskat mutationsfrekvensen (högre fidelity), även om detta inte är en absolut regel, som visas i Figur 4. Med ovanstående parametrar som kan mutationen frekvenser trohet variant och vilda populationer typ jämföras för att få genetisk bekräftelse på förändrade replikering trohet. Figur 5 visar en sekvens anpassning av en vild typ och hi-fi-variant, med punktmutationer identifieras. De mutationer räknas, rangordnade efter antal mutationer per klon (tabell 1), och utgjorde som ett genomsnitt mutationsfrekvensen per invånare, per 10.000 nukleotider ordnat, Figur 6.


Figur 1. Fastställande av optimala förutsättningar att välja för RNA mutagent motstånd:. Bibehållande av hög cellviabiliteten med en måttlig (1-2 log sänkning av virus titer) HeLa celler behandlades med angivna koncentrationer av ribavirin och infekterade med vildtyp Coxsackie virus B3 till ett MOI på 0,01. 48 timmar efter infektion, var avkomma virus skördas och titer bestämdes genom TCID 50. Andelen celler som överlever behandlingen efter 48 timmar, avgörs av Trypan blå färgning, visas under x-axeln. Resultaten visar att koncentrationerna av 100 och 200 mikroM minska virusets titrar med 1-2 log, utan att påverka cellernas livskraft.

Figur 2
Figur 2. Seriell passage i närvaro av måttliga halter av RNA mutagena väljer för mutagen resistenta populationer. I denna figur var Chikungunya virus passerats in HeLa celler i närvaro av 50 mikroM ribavirin (grå staplar). Kontroll passager utfördes i avsaknad av ribavirin (svarta staplar). Efter varje passage, var virus avkommor kvantifieras av klassiska plack analys på BHK celler. Den mutagena effekten är uppenbar under den första passager (P1 och P2 i jämförelse med P0 börjar befolkningen) där behandlat viruset titrar minska med 2 log. Så småningom titrar återgå till det normala (obehandlad) nivåer. Inga signifikanta skillnader kan observeras i passagen 5 mutagent behandlade populationer jämfört med obehandlade, vilket tyder på att resistenta varianter har valts. Faktum är identifierade konsensus sekvensering av befolkningen unika mutationer i viruset befolkningen genomgår ribavirin behandling.

Figur 3
Figur 3. Bekräftelse av ett brett motstånd mot RNA mutagena av olika struktur. Visas här var hifi A372V variant av Coxsackie virus B3 som ursprungligen var isolerad i skärmen som beskrivs i avsnitt 3 som genereras från en smittsam klon och testats för dess relativa känslighet för olika koncentrationer av olika RNA mutagena (ribavirin, 5-fluorouracil, 5-azacytidine). HeLa celler behandlades med angivna koncentrationer av ribavirin och infekterade med vildtyp Coxsackie virus B3 till en MOI på 0,01. 48 timmar efter infektion, var avkomma virus skördas och titer bestämdes genom TCID 50. Visas här är titrar av vild typ (heldragna linjer) och A372V variant (streckade linjer) som funktion av mutagen koncentration. A372V titrar genomgående högre än vild typ under alla testade förhållanden.

Figur 4
Figur 4. Replikering priser och trohet varianter. För att bestämma ett steg tillväxt kinetik viruset produktionen, HeLa celler infekterade med MOI = 10 med antingen vildtyp (heldragen linje), high fidelity variant A372V (lång streck) eller replikering bristfällig variant Cx64 (kort streck) av Coxsackie virus B3. Vid tidpunkter anges, virus avkomma har skördats från celler och supernatanter med frys-tö och titered av TCID 50. Trohet ökning A372V inte sammanfaller med en observerbar replikering defekt i vävnadskultur. Varianten Cx64 presenterar en betydande försening replikering kinetik och når maximal titer som är 1000 gånger lägre än vildtypsvirus.

Figur 5
Figur 5. Uppriktning av TopoTA klonade sekvenser från varje virus befolkningen. Hjälp av den metod som beskrivs i avsnitt 7, varje sekvens från klonade RT-PCR-produkten kommer förmodligen från en enda, unik arvsmassa inom den totala viruset befolkningen och skulle alltså bära unika mutationer. Figuren visar en typisk anpassning efter sanering av dålig kvalitet sekvenser och visualisering av SNP. Den totala SNP (10 i denna siffra) inom en befolkning räknas, och antalet SNP som visas för varje klon noteras. Till exempel innehåller den klon understryks av en bar, två unika mutationer medan 8 andra kloner innehålla en enda, unik mutation. Dessa data används för att sammanställa tabell 1. För att se en större version av denna siffra kan du klicka här .

Figur 6
Figur 6. Grafisk representation av mutation frekvenser av virus populationer. För att underlätta tolkning, kan den numeriska data som erhållits från sekvens och statistiska analyser representeras antingen som ett diagram eller histogram (bilden). A372V virus genererar färre mutationer än vild typ och ger en betydligt lägre mutationsfrekvensen (*, p <0,01). Den Cx64 variant, som replikerar att titrar 1000 gånger lägre än vild typ, tryckmedelsingredienser samma mutation frekvens (ns, ej signifikant) vilket tyder på att replikering hastighet och trohet är inte nödvändigtvis kopplade. Samma Chikungunya virus (CHIKV) befolkningen ger liknande mutation frekvenser om viruset lager, eller en 10 5-faldig utspädning, används för RNA-extraktion.

Mutation fördelning sammanfattning för statistisk analys.

OBS: För varje klon är det viktigt att samma genomiska regionen (och längd sekvens) är täckt. I det här fallet 859 nukleotider per klon. Detta är avgörande för statistiska analyser. Å andra sidan, gör rang summa test används för statistisk analys inte kräva att urvalen vara samma, är forskaren fri att jämföra befolkningen med olika urvalsstorlek. Därför kan de 142 kloner av vildtyp jämföras med 84 kloner av A372V.

# Kloner med n mutationer vildtyp A372V
7 mutationer 0 0
6 mutationer 0 0
5 mutationer 0 0
4 mutationer 0 0
3 mutationer 1 0
2 mutationer 6 2
1 mutationer 40 14
0 mutationer 95 68
Totalt mutationer 55 18
Totalt kloner sekvenseras 142 84
Totalt nukleotider sekvenseras 121.978 72.156
Mutations/10 4 nt 4,51 2,49

Tabell 1. . Mutation fördelning sammandrag för statistisk analys OBS: För varje klon är det viktigt att samma genomiska regionen (och längd sekvens) är täckt. I det här fallet 859 nukleotider per klon. Detta är avgörande för statistiska analyser. Å andra sidan, gör rang summa test används för statistisk analys inte kräva att urvalen vara samma, är forskaren fri att jämföra befolkningen med olika urvalsstorlek. Därför kan de 142 kloner av vildtyp jämföras med 84 kloner av A372V.

Discussion

Val av cellinje. Effekten av oädel analoger som RNA mutagena korrelerar med deras relativa upptaget av olika celltyper 11. Om den cellinje som normalt används för att virus passage visar sig vara behandlingsresistenta mot mutagent upptaget eller för känsligt (hög celltoxicitet), kan det vara nödvändigt att använda en annan cellinje som uppfyller dessa krav och är fortfarande tillåtande till virusreplikation. När mutagena motståndet varianten är isolerad, kan resten av karakterisering ska utföras i den ursprungliga, föredrog cellinje. Enligt vår erfarenhet HeLa celler tar lätt upp mutagena ämnen, BHK celler behöver upp till 10-faldigt högre koncentrationer och Vero-celler är terapiresistenta mutagen upptag.

Val av mutagen. I ett försök att isolera trohet varianter av mutagent behandling, sannolikheten för framgång ökar om mer än en typ av mutagena ämnen används. Base analoga mutagena av olika struktur, som felaktigt ingår i kartläggningen vid replikering kommer främst framkalla resultera i en särskild del av mutationer i efterföljande replikering cykler: ribavirin behandling gynnar GtoA och CtoU mutationer övergång 12, 5-azacytidine har en liknande bias, med Tillägget av CtoG och GtoC transversions 13, 5-fluorouracil företrädesvis inducerar AtoG och UTOC övergångar 14. Alternativt + högre koncentrationer av Mg 2 + eller Mn 2 kan kompletteras för mediet att öka den totala mutationsfrekvensen av RNA virus utan fördomar som beskrivs ovan 12. Beroende på viruset "kodon sekvenser och kodon förändringar som krävs för att generera en trohet variant, vissa av dessa villkor kommer att gynna framväxten av denna variant framför andra. För högre trohet polioviruset G64S och Coxsackie virus A372V, ribavirin behandling lättast valts för varianterna eftersom den nödvändiga AtoG övergången vid kodon platsen motsvarade de mutationer främst genereras av denna ribavirin.

MOI vs befolkningsstorlek. I virologi, protokoll för vävnadsodling infektion särskilt uppmärksamma den mångfald av infektion (MOI), för att undvika ansamling av defekta störande partiklar (lågt MOI) eller att främja rekombination mellan virus (högt MOI), för exempel. För att välja för uppkomsten händelser under seriell passaging är det också viktigt att beakta storleken virus befolkning. Eftersom resistent mutant ursprungligen är på låg frekvens, är det bäst att överföra en så stor befolkningsmängd som möjligt från en passage till nästa (10 5 -10 6 virus, t ex) för att undvika att förlora dessa nya varianter på varje passage. Skala upp storleken på bra eller kolv (antalet infekterade celler) kan hjälpa till att minimera ökningen av MOI om detta är oroande. Å andra sidan, för experiment där känsligheten hos ett virus för att mutagen testas, är lågt MOI infektion utförs för att öka antalet replikering cykler som förekommer i försöket och för att undvika rädda mutagenized genomet av högre fitness arvsmassa genom komplement i co-infekterade celler. Detta är viktigt eftersom de mutationer som genereras på avkomman genomen under den första rundan av replikering inte omedelbart upptäcks. De flesta av dessa mutagenized RNA fortfarande kommer att vara förpackade i virionens. Det är i nästa omgång av infektion som dödliga mutationer som finns i dessa genomet kommer att resultera i en avbruten replikering cykel, och minskning av virus titer. Det kan vara nödvändigt att tillåta flera omgångar av ansamling av mutationer innan en signifikant effekt av dödliga mutagenes observeras. Slutligen, om över passagen serien i närvaro av mutagent, det virus titrar fortsätter att sjunka fram till utrotning, då forskaren ska försöka passaging virus i gradvis ökande mängder av mutagener (från en mycket låg koncentration).

Isolering och generering av RNA mutagena resistent klon från RNA mutagena resistenta befolkningen. RNA mutagena införa flera slumpmässiga mutationer i varje arvsmassa, men valet av motstånd kommer bara att berika (och fixa till konsensus sekvens) motståndet mutation. För att identifiera denna mutation, vi sekvens mutagen resistenta befolkningen (konsensus av befolkningen) och inte enskilda virus. Därför är den enda, slumpmässiga mutationer som skapats av mutagen inte upptäcks i sekvensen, bara de mutationer som leder till konsensus förändringar efter valet finns. Enligt vår erfarenhet vi identifierar endast en eller två sådana ändringar konsensus sekvens. När mutagena resistent befolkningen uppnås och motståndet mutation är identifierad, är det nödvändigt att skapa ett renare lager av denna variant. Ovan beskrev vi en procedur plack rening. Alternativt, om viruset av intresse inte producerar lätt identifierbara plack, kan den önskade variant PurifIED genom att begränsa utspädning. Detta tillvägagångssätt är i huvudsak en TCID 50 i 96-bra format, där viruset beståndet späds ut så att mindre än 50% av brunnarna är smittade. Med hjälp av denna utspädning är samma tillvägagångssätt som ovan vidtas, isolera upp till 10 individuella varianter och bekräftar deras sekvenser. Som nämnts, i bästa fall, är en smittsam cDNA klon av virusstammen finns. Isolering av den variant skulle därför inte vara nödvändigt. Vår erfarenhet är troheten varianter är resultatet av enstaka aminosyrasubstitutioner och därmed kan genereras med hjälp av enkla, kommersialiserade mutagenes kit som QuikChange (Agilent). En sekundär alternativ är att använda ett cDNA klon av en närbesläktad stam. Men om en närstående stam används, rekommenderar vi att du använder både detta och virusisolering (t.ex. plack rening) eftersom vi har funnit att samma trohet ändra mutation på två närbesläktade virus inte nödvändigtvis kommer att ha samma effekt.

Fidelity och replikering. Val av RNA mutagent resistenta varianter har resulterat i isolering av både högre och lägre trohet varianter med tillväxt egenskaper som liknar sina vilda typen motsvarigheter 4,12,15. För närvarande är sambandet mellan räntor polymeras aktivitet och trohet inte helt klarlagda. In vitro biokemiska studier med renade RNA-polymeras har visat att högre trohet varianter har långsammare bearbetning priser, medan lägre trohet varianter tenderar att ha snabbare behandling 1-3,12. I vävnadsodling, dessa skillnader är vanligtvis inte uppenbart, vilket tyder på att tillgången på resurser, snarare än inneboende polymeras kinetik aktivitet, är det hastighetsbegränsande steget. Om trohet varianten replikerar med kinetik som inte avsevärt skiljer sig från vild typ och sedan en jämförelse av deras mutation frekvenser kan direkt göras. Om en mycket betydande förändring i replikering kinetik finns, uppgifterna bör normaliseras ta hänsyn till kinetiska skillnader, till exempel genom att jämföra virus som har genomgått samma antal replikering cykler. Vår erfarenhet är dock inga signifikanta skillnader i ett steg kinetik tillväxt observerades mellan vild typ och hi-fi-varianter, konstaterade vi att högre trohet varianter genomgående titer högre (inom 1 log) jämfört med vildtyp men de gör något mindre RNA (inom i samma storleksordning), vilket antyder vidare att genomen de producerar innehåller färre mutationer och är därmed mer smittsam.

Provberedning och sekvensering. För alla steg i dessa protokoll, är det viktigt att hifi-, korrekturläsning enzymer används för PCR och RT-PCR för att begränsa införa ytterligare mutationer eftersom de inte kan skiljas från biologiskt relevanta mutationer. Det är viktigt att viruset populationerna som skall jämföras har upprättats i samma förhållanden (passagen historia, vävnad odlingsmedium, temperatur, RNA-extraktion metod, RT-PCR-protokoll etc.) Det är också viktigt att se till att tillräckligt utgångsmaterial var erhållas från RNA-extraktion så att en stark band genereras av RT-PCR. En 1 / 100 utspädning av RNA-provet ska också ge en detekterbar RT-PCR-bandet, vilket indikerar att provet innehåller tillräckligt många av RNA-molekyler för att undvika representation bias (förstärker samma arvsmassa upprepade gånger). Eftersom mutationsfrekvensen är en distribution, skulle man förvänta sig att liknande värden kommer att uppnås oberoende av befolkningens storlek, förutsatt att nämnda fördomar inte förekommer. Som figur 6 visar, ger en 10 5-faldig utspädning av ett virus lager en mutation frekvens som inte skiljer sig från föräldrarnas lager.

Fram till optimala förutsättningar för TopoTA kloning finns, bekräftar förekomsten av insatser efter blå / vit screening, av kolonin PCR innan sekvensering. Som en kontroll för mutationsstatus buller (mutationer infördes genom RT-PCR och sekvensering), klona en PCR-produkten från en plasmid med samma virus sekvens och / eller klona och sekvens RT-PCR-produkter för in vitro-transkriberat RNA motsvarande virus arvsmassa (vara medveten om att olika in vitro transkription enzymer har olika felfrekvenser och får inte ge användbar information om den verkliga bakgrunden fel i din förfarande). Vissa virus sekvenser kan vara giftiga för bakterier, så det är viktigt att kontrollera detta innan man beslutar om regionen virala genomet att sekvenseras för mutation frekvens. I att analysera sekvenser erhålls genom TopoTA, observera att varje klon bör bara innehålla en insert / sekvens. Om en dubbel topp observeras, vilket tyder på en blandad befolkning, är det möjligt att två intilliggande kolonier valdes ut. Det är också möjligt, men högst osannolikt med tanke på den låga mutationen frekvenserna i bakterie-replikering, att mutationen introducerades under förstärkning av plasmiden i bakterieodling. I plack purified populationer kan en dubbel topp representerar överlappande plaketter, eller ett virus som förvärvar en ny mutation eller återgå ett mutation under plack utveckling. Var konsekvent och besluta om huruvida man räkna eller inte räkna dessa mutationer.

Slutligen, kom ihåg att mutationen frekvenser som används här är relativa värden. De är giltiga endast jämföra virus populationer vuxit på samma villkor, och planeras under samma region! De bör inte ses som absoluta värden av mutation ränta, eller mutationsfrekvensen av genomet som helhet. Men när förhållandena är kontrollerade, tillåter de reproducerbar, kvantitativa jämförelser av skillnader i mutation distribution och frekvens.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av medel från medicin och hälsa forskningsanslag från staden Paris, det franska nationella ANR-09-JCJC-0118-1 bidrag och ERC Starting Grant RNAvirusPopDivNVax projekt nr. 242.719.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ribavirin Sigma-Aldrich R9644-10MG
5-fluorouracil Sigma-Aldrich F6627-1G
5-azacytidine Sigma-Aldrich A2385-100MG
MgCl2 Sigma-Aldrich M1028-100ML
MnCl2 Sigma-Aldrich M1787
Trypan blue Sigma-Aldrich T8154-20ML
TopoTA cloning kit Invitrogen 10351021
Quikchange mutagenesis kit Agilent Technologies 200516 If a cDNA infectious clone is available
96-well miniprep kit Macherey-Nagel 740625
Lasergene, Sequencher DNASTAR www.dnastar.com www.genecodes.com Or other alignment software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arias, A. Determinants of RNA-dependent RNA polymerase (in)fidelity revealed by kinetic analysis of the polymerase encoded by a foot-and-mouth disease virus mutant with reduced sensitivity to ribavirin. J Virol. 82, 12346-12355 (2008).
  2. Arnold, J. J., Vignuzzi, M., Stone, J. K., Andino, R., Cameron, C. E. Remote site control of an active site fidelity checkpoint in a viral RNA-dependent RNA polymerase. J Biol Chem. 280, 25706-25716 (2005).
  3. Korneeva, V. S., Cameron, C. E. Structure-function relationships of the viral RNA-dependent RNA polymerase: fidelity, replication speed, and initiation mechanism determined by a residue in the ribose-binding pocket. J Biol Chem. 282, 16135-16145 (2007).
  4. Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. A single mutation in poliovirus RNA-dependent RNA polymerase confers resistance to mutagenic nucleotide analogs via increased fidelity. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7289-7294 (2003).
  5. Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. Increased fidelity reduces poliovirus fitness and virulence under selective pressure in mice. PLoS Pathog. 1, e11-e11 (2005).
  6. Vignuzzi, M., Stone, J. K., Arnold, J. J., Cameron, C. E., Andino, R. Quasispecies diversity determines pathogenesis through cooperative interactions in a viral population. Nature. 439, 344-348 (2006).
  7. Vignuzzi, M., Wendt, E., Andino, R. Engineering attenuated virus vaccines by controlling replication fidelity. Nat Med. 14, 154-161 (2008).
  8. Crotty, S., Cameron, C., Andino, R. Ribavirin's antiviral mechanism of action: lethal mutagenesis. J Mol Med. 80, 86-95 (2002).
  9. Coffey, L. L., Vignuzzi, M. Host alternation of chikungunya virus increases fitness while restricting population diversity and adaptability to novel selective pressures. J Virol. 85, 1025-1035 (2011).
  10. Ciota, A. T. Role of the mutant spectrum in adaptation and replication of West Nile virus. J Gen Virol. 88, 865-874 (2007).
  11. Ibarra, K. D., Pfeiffer, J. K. Reduced ribavirin antiviral efficacy via nucleoside transporter-mediated drug resistance. J Virol. 83, 4538-4547 (2009).
  12. Levi, L. I. Fidelity variants of RNA dependent RNA polymerases uncover an indirect, mutagenic activity of amiloride compounds. PLoS Pathog. 6, e1001163-e1001163 (2010).
  13. Sierra, S., Dávila, M., Lowenstein, P. R., Domingo, E. Response of foot-and-mouth disease virus to increased mutagenesis: influence of viral load and fitness in loss of infectivity. J Virol. 74, 8316-8323 (2000).
  14. Ruiz-Jarabo, C. M., Ly, C., Domingo, E., de la Torre, J. C. Lethal mutagenesis of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV). Virology. 308, 37-47 (2003).
  15. Sierra, M. Foot-and-mouth disease virus mutant with decreased sensitivity to ribavirin: implications for error catastrophe. J Virol. 81, 2012-2024 (2007).
Isolering av Fidelity Varianter av RNA-virus och karakterisering av virus mutationsfrekvensen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beaucourt, S., Bordería, A. V., Coffey, L. L., Gnädig, N. F., Sanz-Ramos, M., Beeharry, Y., Vignuzzi, M. Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency. J. Vis. Exp. (52), e2953, doi:10.3791/2953 (2011).More

Beaucourt, S., Bordería, A. V., Coffey, L. L., Gnädig, N. F., Sanz-Ramos, M., Beeharry, Y., Vignuzzi, M. Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency. J. Vis. Exp. (52), e2953, doi:10.3791/2953 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter