Summary
この記事では、マウスやラットの基本的な剖検を実施するための手順、および基本的な器官の集合体、ならびに、組織学的微生物学的、およびPCR評価のためのより多くの困難なサンプルの種類を説明します。
Abstract
動物のコロニーに感染性病原体の診断や発見を支援するために安楽死させた動物から収集された複数のサンプルの種類があります。さらに組織学的処理のための組織の適切な回収方法は、試験結果の品質に影響を与える可能性があります。この記事では、心臓の同定、肝臓、肺、腎臓、脾臓、ならびにそれらの臓器を収集する方法など、基本的な肉眼的検査の実施を説明します。さらに、より困難な組織/サンプル収集技術の4つが実証されています。組織が適切に適切に修正すると、徹底的な組織学的評価を可能にする組織の内部のための固定剤で膨らまする必要があるとして、肺のコレクションと血流が特に困難な場合があります。この記事では、24時間以内に組織の最適な固定を達成するために、固定液で肺を除去し、それを膨らませるステップ法による手順を示しています。組織が柔らかく、容易に破損しているように脳のコレクションは、同様に挑戦することができます。この記事では、組織への最小限のダメージで頭蓋骨から脳を公開し、削除するステップ法による手順を示しています。腸間膜リンパ節では、腸管系ウイルスは、それらが糞便中に流されているよりもリンパ節に長く持続するように多くの共通の感染性病原体を検出するための良いサンプルタイプです。この記事では、検索して無菌的に腸間膜リンパ節を除去する工程の手順により、ステップを示しています。最後に、気道の感染性病原体の同定は、細菌培養や鼻のPCR検査および/または剖検時に採取気管支流体吸引によって行うことができる。この手順では、取得して、細菌培養とPCR検査のために呼吸吸引サンプルを準備について説明します。
Protocol
1。剖検のための準備
- 任意の総剖検（肉眼的剖検）の重要な部分は、動物の歴史と調査結果の説明です。
- あなたの組織病理スライドを読んで獣医病理学者は、動物を見ていない可能性がありますし、背景情報の入力に依存しています。
- 正確には、動物を安楽死させる前にあなたが見るものを説明します。たとえば、"雌マウス、ケージの5の一つ、C57BL/6N、ヘッドが右に傾いて"または"茶色の雄ラット、系統不明、尾の近くで、背部に斑点状の脱毛があると、動物がスクラッチされヘッド"。
- わかりやすい、明確な、客観的な言語を使用してください。レベル間のカットオフが明瞭に区分されている場合など、"軽度""中程度"、そして"厳しい"などの修飾子は役に立つかもしれません。食品や家庭のオブジェクトの観点で物事を説明することは一般には推奨されません。
- 動物、調査結果、または臓器を計量し、測定することはしばしば有用です。あなたにとって"大きな脾臓は"別の観察者には通常の脾臓かもしれません。脾臓は3センチメートルXの1.5センチメートルを測定するということは、より客観的な情報を提供します。
- Photodocumentationは非常に貴重なものです。
- 生きた動物、潜在的に感染死体、またはそのようなホルマリンなどの化学薬品を取り扱うために必要なすべての関連職業上の健康と個人用保護具を守ってください。
2。総死後の場所と、心臓の検査、肺、肝臓、腎臓、および脾臓
- 前の動物の安楽死に必要な物資を集める。最低限、これは解剖ボードまたは類似の作業面、鉗子、はさみ、容器のラベル、固定剤、および任意のメディアやコレクションチューブ/潜在的に必要とされることコップを含める必要があります。
- 簡単に言えば状態、行動、および動物の動きを評価する。呼吸パターン（例えば、急速な、浅い）だけでなく、歩行能力および歩行（例えば、旋回、跛行、震え）を観察し、記録する。
- 常にAVMAガイドラインに従い、あなたの機関で標準的な手順に従って動物を安楽死させる。
- 皮膚やコートの異常、衰弱、または脱水のための動物の体の状態を評価する。あらゆる人工的な操作、インプラント、または瘢痕手術をメモしておきます。
- すべての外部開口部を（耳、目、鼻、肛門、生殖器の開口部、および口腔内）を調べます。解剖範囲の使用は、よく観察することをお勧めします。
- 背側横臥位で安楽死させたマウスやラットの死体は、クリーンな解剖ボードまたは類似の作業面に置きます。
- はさみを使用して、腹部内臓、唾液と包皮/陰核腺、頸部および腋窩リンパ節を露出させる、肌を反映し、腹壁を切開、肛門から顎に皮膚のventrumの全長を切開する。徹底的に肺の全葉を調査するのに十分なスペースを開くには、胸骨の上部に、全体で一つの次に、横方向に胸郭の両側最大2カットすることにより、胸部内臓を公開して調べることが胸郭をカット。
- 筋骨格系の構造の外観を調べる。
- 異常のためのすべての器官を評価する。具体的には胸腔内、心臓と肺を見つけ、識別する。特に腹腔内、肝臓、腎臓および脾臓を見つけ、識別する。任意の色の変更、サイズの違い、および行方不明またはmislocated器官に注意してください。表面の一貫性、任意の追加の組織（例えば、質量）、流体のポケット、または腹部/胸部の空洞内の流体の存在に注意してください。
- 肥厚した壁、質量、および/または出血のための特別な注意を払って、コンテンツ、またはコンテンツの不足のための消化管を観察。異常のための実質をチェックするためにメスまたはカミソリの刃を持つ腎臓（左縦断面、正中線上で右クロスセクション、、しかし、オフセンター）を切開する。リンパ節腫大および/または大衆のための腸間膜を確認してください。
- 詰まり、流体ポケット、出血やその他の異常がないか調べ、泌尿生殖器系を調べる。
3。心臓、肝臓、腎臓、および組織病理学のための脾臓の死後のコレクション
- （NBF）緩衝ホルマリン10％の適当な量の中性で満たされた適切なサイズは、ラベル付き容器（s）を収集する。組織に固定液の20:1の比率を得るために10％NBFの量を調整します。
- きれいな解剖ボードまたは類似の作業台の上に背側横臥位でマウスまたはラットの死体を置き、目的の組織を公開。
- 鉗子やハサミを使って死体からの組織を削除します。
- 組織は密接に脂肪と不必要な結合組織を除去するようにトリミングする必要があります。組織は、血液のクリーンでなければなりません;必要に応じてリンスする（または生理）生理食塩水）通常の使用。組織を洗浄するために蒸留水や水道水を使用しないでください。
- 10％のNBFのコンテナに組織を置きます。
- 10％のNBFの適切な量で満たされたラベルが付いた容器（S）、適切なサイズを収集します。組織に固定液の20:1の比率を得るために10％NBFの量を調整します。
- きれいな解剖ボードまたは類似の作業台の上に背側横臥位で、マウスやラットの死体を置きます。
- 気管、心臓、肺を公開。
- ハサミとピンセットを使用すると、腹側胸部と頸部の領域を覆う皮膚と筋肉を取り除く。
- ハサミやピンセットを使用して、肺の全葉を徹底的に調べるのに十分広いスペースを開くには、2横方向に胸郭のそれぞれの側までカットして、鎖骨の近くに全体で一つを行うことによって心臓や肺を露出胸郭を削除します。
- 気管を覆うものを含め、胸骨と肋骨から顎に伸びる首の筋肉を切り取る。
- 胸郭の前縁の下にはさみを挿入し、気管を覆う骨のセクションを削除するには、2カット、どちらかの側に1つを、行う。
- ピンセットで顎の近くに気管をつかみ、鉗子の上に置かれたはさみで気管を介して完全にカット
- そっと胸の組織のセット全体がなるまでハサミで腹側組織の接続をsnipping、鉗子を用いて気管の上方に引っ張る（気管、肺、そして心臓、これは時々"摘む"と呼ばれる）身体から削除されています。
- 肺は、作業面に平らに置きます。
- 緩くタイト引っ張らないように注意しながら気管周囲に縫合材料または台所ひもの部分を結ぶ。
- 固定液と注射器を記入し、気管に入るのに十分に小さい針を取り付けます。マウスの場合、26ゲージの針を1ミリリットルまたは3ミリリットル注射器がうまく動作します。ラットの場合は、18ゲージの注射器で5ミリリットル注射器がうまく動作します。
- 気管の開口部に針を挿入し、針の周囲の気管を保持するために鉗子を使用する。徐々に固定液で肺をいっぱいに開始する。
- 完全に膨張するまで肺を埋める。オーバーまたはしないでくださいunderinflate。完全に肺を膨らませるために必要な固定液の量は年齢、系統、および動物の健康状態によって異なります。
- 以上のインフレは、浸透性および肺組織から発泡液によって検出される。
- Underinflationはすべての領域でフラット、フルではない表示されて肺から検出される。
- 気管から針を外します。
- 縫合材料や肺の固定からの逆流を防ぐために、気管の周囲の文字列を締めます。
- 組織の比率におおよそ20時01固定液を使用して固定液に膨張した肺を置きます。
5。脳の死後のコレクション
- 10％のNBFの適切な量で満たされたラベルが付いた容器（S）、適切なサイズを収集します。組織に固定液の20:1の比率を得るために10％NBFの量を調整します。
- きれいな解剖ボードまたは類似の作業面上に腹側横臥位で安楽死させたマウスやラットの死体を置きます。
- ハサミやピンセットを使用して、頭蓋冠を覆う皮膚と筋肉を取り除く。
- はさみを使用すると、枝肉から完全に頭を削除する。
- 大後頭孔、頭蓋骨が脊柱管に開いた開口部に底刃インサートの小さなはさみを使用して、そして維持するはさみのヒントは上向きに指された、直接バックアップと頭蓋の正中線を介して切削開始。
- 鉗子を使用して、脳を露出頭蓋冠の両半分をバックに反映。
1。可能な場合、頭蓋骨にはまだ間に固定液にさらされる脳を置きます。これは、これが必要な場合組織は、頭蓋骨から取り外す前に会社になることをできるようになります。多くの病理医は、セクションがまだ頭蓋骨の間に脳から切断されていることを好む。
- その重力は、組織が頭蓋骨から落ちるのを助けるように穏やかに頭蓋骨を反転させる。
- 曲がったピンセットを使用して、慎重に大脳の下や小脳に向かって移動し、脳の外側の縁に沿って、嗅覚葉から始まる脳の下に鉗子をスライドさせます。優しく鉗子で任意の結合組織や頭蓋骨から落ちてくるから脳を抑制する神経をつまみます。
- 固定液に組織のおおよその20:1の比率を使用して固定液に脳を置きます。
6。腸間膜リンパ節（MLN）の死後のコレクション
- PCR分析のための組織採取は無菌操作を使用して実行する必要があります。炎は、滅菌オートクレーブまたは同等の滅菌器具を使用する必要があります。
- 滅菌エッペンドルフチューブと滅菌済みのハサミとピンセットを組み立てます。
- きれいな解剖ボードまたは類似の作業台の上に背側横臥位で安楽死させたマウスやラットの死体を置きます。
- 滅菌はさみとピンセットを使用すると、陰部からの胸郭のベースに腹側腹壁を切開する、皮膚と筋肉の両方を削除し、腸を露出させる。
- MLNは、盲腸のすぐ隣に、大腸に沿って腸間膜組織における腹腔内に配置されています。
- MLNを検索するには、まず腸の大規模な、コンマ状のセクションである盲腸を見つけます。コロンは盲腸から延びており、それは多くの場合、糞の存在によって識別できます。 MLNは、盲腸に隣接して大腸に沿って腸間膜に位置しています。それは白い腸間膜組織における組織の黄色、卵形または球形の小さなしこりとして同定され、しばしば周囲の腸間膜と脂肪よりも質感でわずかに厚く、硬くなりますできます。方位に必要として、解剖学の教科書を使用してください。
- 無菌操作と滅菌器具を使用して情報を識別で標識したエッペンドルフチューブにMLNと場所を削除します。
7。呼吸吸引の死後のコレクション
- 必要な電源を組み立てる - 滅菌ピペット、滅菌済みのハサミとピンセット、気道を介してフラッシュする無菌溶液、およびクリーンな解剖ボードまたは類似の作業面を。
- 解剖ボード上の背側横臥位で安楽死させたマウスやラットの死体を置く。
- ラットにおける気管支吸引液の場合は、気管を通って気道にアクセスする。ラット、気管を介して、または鼻咽道経由でアクセスのいずれかの鼻の吸引のため。マウスの気管支や鼻の吸引液の場合は、鼻咽道を通じて、気道にアクセスします。
- 鼻と気管支の両方吸引が必要な場合は、まず気管支吸引を行います。新しい滅菌ピペットを用いて鼻の吸引を行います。
- 気管アクセス（ラットの推奨方法）：
- 離れて皮下組織を公開するために子宮頸部の領域から肌を反映している。
- 唾液腺と気管を露出する頸部の筋肉組織を削除します。
- 滅菌器具を使用して、内腔へのアクセスを許可するために気管を切開する。 （7.7のステップに進む）コレクション全体に無菌状態を維持する。
- 鼻咽道へのアクセス（鼻吸引、気管支吸引、気管の小さいサイズのためにマウスのための推奨方法）：
- この手順は、鼻腔吸引液および気管支吸引の両方に対して実行されることがあります。
- 火炎滅菌またはオートクレーブ滅菌器具を使用して、顎（あご）の関節の断絶と鼻咽道を公開、離れて上顎から下顎を反映している。 （7.7のステップに進む）コレクション全体に無菌状態を維持する。
- 滅菌ピペットに液体をサンプリングするのに約1mlを描く。これは通常の生理食塩水かもしれない、リン酸緩衝生理食塩水、またはトリプチケースソイブロス。 （あなたが収集する吸引に応じて、7.8または7.9に進みます。）
- 気管支吸引：
1。無菌的に尾側に向け、気管内腔にピペットを挿入し、ゆっくりと気管支や肺にサンプリング液を注入する。ピペットに気管支や肺からのサンプリング液を撤回し、気管からピペットを取り外します。すべての流体のはピペットに返されます。より多くの流体がテストのために必要とされている場合は繰り返します。
- 鼻吸引：
- 無菌的に頭側方を向いている、鼻咽道（マウス）または気管内腔（ラット）にピペットを挿入し、ゆっくりと鼻腔内にサンプリング液を注入する。
- 鼻腔がピペットの先端と鼻口蓋の接触によって到達、または流体の観察により、キャビティに強制的に、半月板が鼻オリフィス（鼻孔）で、または半透明の経口口蓋を通して見える流体として形成すると見られていることを確認してください。流体は、口から出る考えるべきではない。もしそうなら、再度向きをピペット。
- ピペットに鼻腔からのサンプリング液を撤回し、道や気管からピペットを取り外します。
- 無菌的にテストのために適切なメディアまたは容器にサンプルを移す。
8。代表的な結果
図1マウスの腹部と胸部の臓器。これらの器官は、動物が最初に（臓器のいずれも腹腔内にも存在する他の臓器を公開するために移動されていない）を開いたとき、通常は表示されます。）胸腺、b）の心臓は、c）の肺は、d）はダイアフラム、e）の肝臓、F）小腸、g）の盲腸、h）の膀胱。
図2マウスの腹部および後腹膜臓器。腸と肝臓を持ち上げて（または削除）に移動している場合は、これらの臓器CAnを見られる。）肝臓（参照用）、b）の腸（参照用）、c）の胃、d）の脾臓、E）腎臓、f）は下行結腸、g）を子宮。
図3。雄の生殖器官。これらは大きく、性的に成熟した雄では大きくなる可能性があります。）精嚢と凝固腺、b）の精巣には（マウスとラットで開いたまま鼠径輪を介して陰嚢から腹腔内に押し込ま）、c）の膀胱、 d）の包皮腺、e）の精巣上体。
図4。雌の生殖器官。）非妊娠子宮（マウスやラットが双角の子宮を持っている）b）の卵巣の脂肪パッド、cに埋もれて卵巣、）膀胱、d）の陰核腺（男性の包皮腺に類似） 。
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Discussion
試験終了時のデータ収集は、動物の剖検が必要な場合があります。見られるものも説明し、すべての組織を調べることを忘れないでください。これらの手順は、感染症のサーベイランスのために剖検し、サンプルコレクションを最適化するために主に設計されていますが、ほとんどは簡単に、おそらく手続きのサブセットのみが採用されるような疑いのある病気の事件や流行の焦点を絞った調査をするようになっている。手順の多くはまた、より一般的に、その後の分析のための研究に固有のサンプルの収集と相まって、全体的な形態学的評価の一環として調査研究の終了時に実行される剖検に関連しています。
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Disclosures
著者らは、これらのサービスが商業的に提供されているチャールズリバーの研究室で齧歯類の診断ラボ、すべての従業員です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cutting board | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Cat #36114 | |
| Small scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5910, G204 | 23mm blades, 3.5" length, straight |
| Medium scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6808, G207 | 5" |
| Large scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6826, G65" | 6.25" |
| Forceps-Curved | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-8254 (M1/21004) | 4.5", serrated, slight curve |
| Forceps-Microdissecting | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5238 | Hudson-(EWALD) |
| Forceps-Tissue Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS--8160 | Rat tooth |
| Flame sterilizer | Oxford Labware | Bacti-Cinerator #5889-001007 | |
| Scalpel | Cancer Diagnostics, Inc. | Finger Scalpels #60, Cat#FS0060 | |
| Pipettes | VWR international | Pasteur Pipet 5 3/4", Cat#14672-400 | |
| Autoclave bags | Propper Manufacturing Company | Sterilizer Bag Paper Pouches Cat#021002(3100923)E09110 | For Pasteur pipettes |
| Pipette bulb | VWR international | Cat#56310-240 | |
| Eppendorf tubes | Sarstedt Ltd | SafeSeal microtube 2mL, Ref#72.695 | |
| Eppendorf tubes | Argos | 5mL microtube Cat#T20765-C | |
| Syringe | BD Biosciences | 1ml-309602 3 ml-300910 5ml-309603 10mL Cat#309604 20mL Cat#309661 | |
| Needles | BD Biosciences | 26G-309625 18G-305195 | |
| Neutral buffered formalin | VWR international | 20L 10% NBF, Cat#16004-128 | |
| Saline | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Buffered Blood Bank Saline, Cat#23-309-178 | |
| Trypticase soy broth | BD Biosciences | TSB: Dehydrated, Cat#211825 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | HA Buffer, Cat#P3813-10PAK | |
| Formalin cups | VWR international | 4oz Cat#36318-852 8oz Cat#36318-860 16oz Cat#36318-858 | |
| Large formalin cups | OakRidge Products | 32oz container Cat#0432-1100 | |
| Extra large formalin cup | VWR international | HDPE Multipurpose 160oz container Cat#89038-282 | |
| Suture material | Henry Schein | Braided silk surgical suture, Ref#100-5000, M766750 | For mouse lung inflation |
| Twine | Staples | Cat#QUA-46173 | For rat lung inflation |
References
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