Summary
هذا الأسلوب لعزل الخلايا المناعية وظيفية من القلب ويوفر بديلا للأساليب التقليدية للكولاجيناز الهضم ، والذي يسبب تنشيط الخلايا المناعية غير المرغوب فيها ، مما أدى إلى انخفاض في استجابة هذه الخلايا. لدينا وسيلة لعزل الخلايا المناعية وظيفية غلة القلب عن طريق تجنب المشاكل المرتبطة الهضم الأنزيمي.
Abstract
الخلايا المناعية القلب تكتسب الفائدة على الدور الذي تلعبه في تغيير بنية مرضية في العديد من أمراض القلب 1-5 هذه الخلايا المناعية ، والتي تشمل الخلايا البدينة ، وخلايا تي الضامة ؛ تخزين وإطلاق مجموعة متنوعة من الوسطاء بما في ذلك النشطة بيولوجيا والسيتوكينات وقد ثبت البروتياز مثل تريبتاز 6-8 هؤلاء الوسطاء أن اللاعبين الرئيسيين في عملية الأيض المصفوفة خارج الخلية من خلال تفعيل metalloproteinases مصفوفة أو التسبب في تراكم الكولاجين بواسطة وظيفة القلب الليفية "تحوير 9-11 ومع ذلك ، التقنيات المتاحة لعزل الخلايا المناعية والقلب كانت مشكلة لأنها تستخدم كولاجيناز البكتيرية لهضم أنسجة عضلة القلب. هذا الأسلوب يؤدي تنشيط الخلايا المناعية وبالتالي فقدان وظائف. وضعنا على سبيل المثال ، تصبح الخلايا البدينة القلب بشكل ملحوظ أقل استجابة للمركبات التي تسبب تحبب (12). لذلك ، وهي تقنية تسمح للرانه عزل خلايا وظيفية قلبية المناعية التي من شأنها أن تؤدي إلى فهم أفضل لدور هذه الخلايا في أمراض القلب. 13 ، 14
يتطلب هذا الأسلوب في ألفة مع المكان التشريحي للفأر الخنجري الإبطين ، وعملية الرباط المنجلي ، وتأمور القلب. هذه هي معالم هامة لزيادة نجاح العملية وضمان عائدات أعلى من الخلايا المناعية في القلب. ويمكن بعد هذه الخلايا المناعية القلب المعزولة أن تستخدم لتوصيف النمط الظاهري ، وظائف ، والنضج ، وشارك في التجارب مع ثقافة خلايا القلب وغيرها للحصول على فهم أفضل لتفاعلاتها.
Protocol
1. إعداد هانكس "الرصيد محلول الملح (HBSS)
- الأوتوكلاف L 1 كوب الزجاج ، وتخرج 1000 مل اسطوانة ، ويحرك الشريط.
- إعادة الحل مسحوق HBSS تعقيمها في دورق زجاج 1 لتر إلى 900 مل علامة مع الماء المقطر مزدوجة.
- مزيج حل HBSS مع 3.4 غرام من الملح + Hepes الصوديوم وضبط درجة الحموضة إلى قيمة بين 7،35-7،41 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم أو تتركز HCL.
- مرة واحدة قد تحقق المطلوب ، ودرجة الحموضة لا تزال مستقرة ، إضافة 5 غ من ألبومين المصل البقري إلى حل في درجة حرارة الغرفة حتى يذوب تماما الزلال.
- إضافة 10 مل من الماء المقطر والمضادات الحيوية ، antimyotic ، إلى الحل وحتى مضاعفة حجم إجمالي في علامة مل 1000.
- تحريك حل شامل.
- تصفية حل HBSS وفصلها إلى 50 مل أنابيب فالكون لاستخدامها لاحقا. يمكن تجميد أنابيب إضافية واستخدامها في وقت لاحق.
2. محضرات الحيوانن -- إدراج أنبوب القصبة الهوائية
- إعداد الصكوك اللازمة مع الدرج والمادية من أجل إدخال أنبوب القصبة الهوائية (أي ملقط ، مقص ، وأنبوب القصبة الهوائية ، 3-0 مضفر خياطة سوداء صغيرة التنفس الحيوانية ، الخ).
- بمجرد أن يتم تخدير الفئران تماما مع كوكتيل الكيتامين / زيلازين في نسبة 2 إلى 1 زيلازين الكيتامين ، حلق البطن والصدر ، والحنجرة من الفئران. للتأكد من أنه تم التوصل إلى حالة تخدير عميق ، قرصة اصبع الفأر والاختيار للانسحاب من دواسة أطرافهم. تأكد من الفئران هو تخدير بعمق قبل اتخاذ جميع الشقوق.
- مكان الفأر مع رئيسها الذي أثير حول قطع المجلس الذي يميل بزاوية 30 درجة
- جعل شق الجلد من منتصف البطن إلى أسفل الفك السفلي. بعيدا تشريح عضلات المثلث الأمامي من الرقبة لفضح القصبة الهوائية.
- 3-0 وضع مضفر خياطة سوداء تحت القصبة الهوائية.
- إجراء شق في القصبة الهوائية بين الحلقات الغضروفية anد إدراج أنبوب القصبة الهوائية. ربط الخيط بإحكام لتأمين أنبوب القصبة الهوائية إلى القصبة الهوائية.
- توصيل أنبوب القصبة الهوائية لجهاز التنفس الصناعي الحيوانات الصغيرة.
3. إعداد أداة لعزل الخلايا المناعية
- تحضير صينية مع الأدوات اللازمة لإجراء زنزانة انفرادية المناعي (أي ملقط ، مقص ، HBSS ، قلص لينة تفلون قياس 24 باكستر داخل الأوعية الدموية خلال إبرة سريعة القسطرة)
- إعداد two المحاقن 10cc ، ملء أحد المحاقن مع HBSS على عرضه العازلة في كيس التامور والاحتياطي الآخر لالشفط الخلايا التي تحتوي على HBSS.
3.2.1. تقليل تفلون غيض من داخل الأوعية قياس باكستر 24 خلال إبرة سريعة القسطرة (الطول 1.6) بنسبة 2 / 1 إلى 3 / 4 من طوله الأصلي لإجراء العزل.
- كل مكان الحقن ، ومخازن ، وفارغة 15 مل أنبوب فالكون (للاحتفاظ السوائل المستخرجة بمجرد الانتهاء من الإجراء) على الجليد.
- جعل شق خط الوسط في جدار البطن (على طول الخط ألبا) حتى تصل إلى عملية الخنجري.
- بدءا قليلا أفقيا لعملية الخنجري ، وجعل الشقوق بين البلدين من خلال القفص الصدري استمرار بزاوية نحو الإبطين. يجب الحرص على عدم خرم الرئتين والقلب ، أو بيريكارديوم.
- مرة واحدة في شقوق على جانبي القص كاملة ، بعيدا تشريح الحجاب الحاجز السفلي من أضلاعه ، وقطع الأطراف إلى الإنسي.
ملاحظة : كن على علم من أي وقت مضى حيث يتصل بيريكارديوم الحجاب الحاجز والقص لتجنب الضرر. استخدام الرباط المنجلي كمعلم لاحظ حيث يتم إرفاق تأمور على الجانب الآخر من الحاجز. أيضا ، إذا تم خفض تأمور ، يتم فقدان القدرة على عزل الخلايا.
- رفع بلطف جانب واحد من القفص الصدري لكشف التجويف الصدري والقلب (التي لا تزال مغلفة بيريكارديوم).
- أخذ حقنة مليئة HBSS وايجاد نقطة في كيس التامور تقريبا إلى نصف الطريق بين القص والقلب (ويفضل أكثر من منقاري الذيلية) ، وإدراج غيض من تفلون تقصير السريعة سواء عن طريق القسطرة طبقات بيريكارديوم.
- مرة واحدة القسطرة في مكانها ، والمضي قدما بلطف ملء الفراغ مع تأموري 2-3 مل من HBBS العازلة. ستعرف على الفور إذا تم وضعها بشكل صحيح القسطرة عندما تلاحظ المساحة تأموري التوسع. إذا لم يشهد تعبئة والانسحاب وإعادة عملية قسطرة سريعة.
- عندما يملأ الكيس التأموري ، يأخذ حقنة أخرى 10 سم ومكان الطرف الخلفي في تأمور الشفط وتبدأ المخزن المؤقت. ويمكن استخدام فتحة دخول نفسه أو يمكن أن تنشأ آخر. تأكد من وجود طرف لا يأتي قريبا جدا من جدران كيس التامور مع توفير الشفط ، وخاصة على الجانب السفلي من القلب. وهذا يمكن أن يؤدي إلى ثقب كيس التامور وفقدان الخلايا التي تحتوي على خليةس.
- بينما الشفط المنطقة العازلة ، يمكن نقل معلومات سرية حول القسطرة داخل كيس التامور من أجل جمع العازلة قدر الإمكان.
ملاحظة : إذا كنت في ذلك المسيل للدموع قليلا تأمور وجعل ثقب في الجزء العلوي من القلب أكبر من ثقب الأصلي ، لا داعي للذعر. ما دام لا يزال يحيط بما فيه الكفاية تأمور القلب يمكنك القيام اخرى لا تزال على غسل القلب ولكن مع أقل كمية العازلة. لجمع مبلغ الأمثل للخلايا ، وهناك حاجة إلى 3-4 يغسل إضافية.
- مكان المخزن في استخراج أنابيب فالكون التي تم وضعها على الجليد.
- إزالة القلب والرئتين ، و / أو أي نوع من الأنسجة الأخرى إذا دعت الحاجة لمزيد من الدراسات. بعد مجموعة من الخلايا المناعية والأنسجة الأخرى ، يجب أن تكون الفئران بسرعة والموت الرحيم إنسانية.
- الطرد المركزي لجمع عينات من الخلايا المناعية لمدة 10 دقيقة في 200G في 4 درجات مئوية. دائما الأنابيب على الجليد عندما لا تكون قيد الاستعمال.
- إزالة وإعادة تشكيل طاف بيليه في 1 مل من الاحتياطي Hyclone أو HBSS.
ملاحظة : من المهم لحساب عدد الخلايا المناعية التي تم الحصول عليها من كل القلب بعد إجراء زنزانة انفرادية المناعي.
5. ممثل النتائج :
يتم تقديم مثال على عزل الخلايا البدينة القلب حصلت مع هذه التقنية والملون باللون الأزرق وطولويدين safranin O / الزرقاء alcian في الأرقام و2A 2B ، على التوالي. كما يمكن أن يرى في الشكل 3 ، سارية القلب ، والحفاظ على قدرتها على إطلاق الهستامين بعد العلاج مع تفعيل المعروفة مثل مجمع 48/80 و ف الجوهر كما هو موضح في مورغان وآخرون 9 المؤامرات مبعثر الممثل من التدفق الخلوي لخلايا CD4 + و وتعرض خلايا CD8 + في أرقام 4 و 5 على التوالي. ويتم تحديد المزيد من اللمفاويات التائية وphenotyped باعتبارها الخلية من سكان هذه التقنية.
ق ق = "jove_content"> 
الشكل البياني للتدفق 1. القلب من الخلايا المناعية إجراء العزل.
هي ملطخة الرقم 2 صور ممثل النسيجي للخلايا البدينة القلب على النحو التالي : (أ) مع الأزرق طولويدين و (ب) هي safranin O / الزرقاء alcian.
الشكل 3. دراسة وظيفية من الخلايا البدينة القلب معزولة عن المنطقة وتحفيز عضلة القلب epicardial مع مجمع 48/80 (10μg/mL) و ف مادة (10μM).
الشكل 4. الممثل المؤامرات مبعثر التدفق الخلوي لخلايا CD4 + معزولة المسمى مع ف مادة (1:100 مخففأيون).
الشكل 5. الممثل التدفق الخلوي من عزل خلايا CD8 + المسمى مع ف مادة (1:100 التخفيف).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا الأسلوب من عزل الخلايا المناعية القلب تمكن من تحليل وظيفتها ، النمط الظاهري ، والنضج دون تفعيل غير المرغوب فيها التي تحدث عادة خلال التقليدية الأنزيمية الهضم تقنية العزل. متوسط العدد الكلي للخلايا التي تم الحصول عليها مع هذا الأسلوب هو حوالي 400،000 في قلب فأر ، وتلطيخ التفاضلية والتحليل الخلوي تدفق هذه الخلايا يشير السكان مختلطة من اللمفاويات التائية (~ 70 ٪) ، الضامة (~ 12 ٪) والخلايا البدينة مع استخدام هذه التقنية. (~ 12 ٪) 13 ، 14 ولذلك ، هناك حاجة إلى طرق تنقية لفصل مزيد من القلب السكان الخلايا المناعية. ويمكن استخدام الخلايا المناعية معزولة لتطبيقات متعددة بما في ذلك الدراسات الفنية ، والتدفق الخلوي ، immunofluroescence ، وشارك في التجارب الثقافة. مع مزيد من التنقية والتجريب ، وهذه الخلايا المنعزلة توفر أداة مفيدة لفهم دور الجهاز المناعي في عملية إعادة تشكيل القلب.
الحمار = "jove_step"> سلامة الحيوان :
وتم إيواء الجرذان تحت ظروف بيئية قياسية والحفاظ على طعام الفئران والتجارية والاستفادة من المياه بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية. جميع الدراسات التي تتفق مع المبادئ الواردة في المعاهد الوطنية للصحة دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وتمت الموافقة من قبل جامعة ولاية كارولينا الجنوبية رعاية الحيوان المؤسسة واللجنة الاستخدام. وقد تأثر التخدير عند نقطة نهاية التجريبي كوكتيل الكيتامين / زيلازين على نسبة 2 إلى 1 زيلازين الكيتامين. هذا هو إجراء nonsurvival ، الذي يجيز استخدام أدوات غير معقمة. بعد عزل الخلايا المناعية وغيرها من الأنسجة المرجوة ، كانت الفئران بسرعة والموت الرحيم معاملة إنسانية وفقا لأمريكا الرابطة الطبية البيطرية التوجيهي على القتل الرحيم للقوارض (مثل استنزاف والتفكك عنق الرحم ، أو جرعة زائدة من مخدر).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل شركة ميرك UNCF - زمالة دراسات عليا بحوث العلوم أطروحة (JLM) ، القومي للقلب والرئة والدم المعهد منح RO1 - HL - 62228 (JSJ) وRO1 - HL - 073990 (JSJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks’ Balanced Salt | Sigma-Aldrich | H4891 | One bottle makes 1 L of Hanks’ Balance Salt Solution. Reconstitute Hanks’ Balance Salt Solution as a part of the procedure. |
| Antibiotic- Antimyotic | GIBCO, by Life Technologies | 15240-062 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A3912 | |
| 250 mL Nalogene Filter Bottle | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 157-0020 | |
| 12 N HCL | Fisher Scientific | CAS 7647-01-0 | For 6 N, add equal volumes of HCL to deionized water. |
| 10 N NaOH | Fisher Scientific | SC267 | For 5 N, add equal volumes of NaOH to deionized water. |
| Double Distilled Water | |||
| Table of Specific Equipment: | |||
| 3-O Suture Silk Braided | Ethicon Inc. | SA64H | |
| Small Animal Ventilator | CWE, Inc. | SAR-830 | Set breathing rate to 40.5 breaths per min. |
| Bevel 18 gauge needle | BD Biosciences | 305199 | Trim needle by 1/2 to 3/4 of its original length for use as a tracheal tube. |
| Teflon Tip (with needle removed) of 24-gauge Baxter quick-cath catheter | Baxter Internationl Inc. | 2N111 | Reduce the Teflon Tip length by 1/2 to 3/4. |
| 10 cc syringe | Fisher Scientific | 14-823-16B | |
| 15 mL Falcon Tubes | BD Biosciences | 352097 | |
| Sorvall RT6000B Refrigerated Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-377 | Remember to pre-cool and keep at 4°C. |
| Hyclone | Thermo Fisher Scientific, Inc. | S300030.02 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | HS-LB-1483 | |
References
- Brower, G. L., Chancey, A. L., Thanigaraj, S., Matsubara, B. B., Janicki, J. S. Cause and effect relationship between myocardial mast cell number and matrix metalloproteinase activity. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 283, H518-H525 (2002).
- Brower, G. L., Janicki, J. S. Pharmacologic inhibition of mast cell degranulation prevents left ventricular remodeling induced by chronic volume overload in rats. Journal of Cardiac Failure. 11, 548-556 (2005).
- Chancey, A. L., Brower, G. L., Janicki, J. S. Cardiac mast cell-mediated activation of gelatinase and alteration of ventricular diastolic function. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 282, H2152-H2158 (2002).
- Levick, S. P., Gardner, J. D., Holland, M., Hauer-Jensen, M., Janicki, J. S., Brower, G. L. Protection from adverse myocardial remodeling secondary to chronic volume overload in mast cell deficient rats. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 43, 56-61 (2008).
- Levick, S. P., McLarty, J. L., Murray, D. B., Freeman, R. M., Carver, W. E., Brower, G. L. Cardiac Mast Cells Mediate Left Ventricular Fibrosis in the Hypertensive Rat. Hypertension. 53, 1041-1047 (2009).
- Batista, M. L., Santos, R. V., Cunha, L. M., Mattos, K., Oliveira, E. M., Seelander, M. C. Changes in the pro-inflammatory cytokine production and peritoneal macrophage function in rats with chronic heart failure. Cytokine. 34, 284-290 (2006).
- Galli, S. J., Tsai, M. Mast Cells: Versatile regulator of inflammation, tissue remodeling, host defense and homeostasis. Journal of Dermatological Science. 49, 7-19 (2008).
- Yndestad, A., Holm, A. M., Muller, F., Simonsen, S., Froland, S. S., Gullested, L. Enhanced expression of inflammatory cytokines and activation markers in T-cells from patients with chronic heart failure. Cardiovasc. Res. 60, 141-146 (2003).
- Bozkurt, B., Kribbs, S. B., Clubb, F. J., Michael, L. H., Didenko, V. V., Hornsby, P. J. Pathophysiologically Relevant Concentrations of Tumor Necrosis Factor-ɑ Promote Progressive Left Ventricular Dysfunction and Remodeling in Rats. Circulation. 97, 1382-1391 (1998).
- Frangogiannis, N. G., Lindsey, M. L., Michael, L. H., Youker, K. A., Bressler, R. B., Mendoza, L. H. Resident Cardiac Mast Cells Degranulate and Release Preformed TNF-ɑ, Initiating the Cytokine Cascade in Experimental Canine Myocardial Ischemia/Reperfusion. Circulation. 98, 699-710 (1998).
- Jobe, L. J., Melendez, G. C., Levick, S. P., Du, Y., Brower, G. L., Janicki, J. S. TNF-α inhibition attenuates adverse myocardial remodeling in a rat model of volume overload. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, H1462-H1468 (2009).
- Forman, M. F., Brower, G. L., Janicki, J. S. Spontaneous histamine secretion during isolation of rat cardiac mast cells. Inflammation Research. 53, 453-457 (2004).
- Levick, S. P., Murray, D. B., Janicki, J. S., Brower, G. L. Sympathetic nervous system modulation of inflammation and remodeling in the hypertensive heart. Hypertension. 55, 270-276 (2010).
- Morgan, L., Levick, S., Voloshenyuk, T., Murray, D., Forman, M., Brower, G. A novel technique for isolating functional mast cells from the heart. Inflammation Research. 57, 241-246 (2008).
