Summary
这种隔离的心脏功能的免疫细胞的方法提供了一种替代传统的方法胶原酶消化，从而导致不必要的免疫细胞活化，从而导致了这些细胞的减少响应。我们隔离的方法，产生心脏功能的免疫细胞，避免与酶消化相关的问题。
Abstract
心脏免疫细胞获得利益的角色，他们在许多心脏疾病的病理重塑发挥1-5这些免疫细胞，其中包括肥大细胞，T细胞和巨噬细胞;存储和释放的多种生物活性介质，包括细胞因子和蛋白酶（如胰蛋白酶）。6-8这些调解员已被证明是通过激活基质金属蛋白酶或胶原蛋白的积累引起心脏成纤维细胞的功能，通过调节细胞外基质代谢的关键球员。9-11然而，隔离心脏免疫细胞技术一直是个问题，因为他们使用细菌胶原酶消化心肌组织。这种技术的原因，从而激活免疫细胞功能的损失。例如，心脏肥大细胞变得大大减少响应的化合物，导致脱粒， 因此 ，我们开发出一种技术，允许对T他隔离心脏功能的免疫细胞，这将导致更好地了解了这些细胞在心脏疾病中的作用。 13，14
此方法需要一个熟悉大鼠剑突，腋下和镰状韧带的解剖位置，对心脏和心包。这些标志性建筑是重要的，以提高手术成功和心脏的免疫细胞，以确保较高的产量。这些孤立的心脏，免疫细胞可以用于表征功能，表型，成熟，并与其他心肌细胞共培养实验，以获得一个更好地了解它们之间的相互作用。
Protocol
1。汉克斯“平衡盐溶液的制备（HBSS）
- 1000毫升高压灭菌器1升玻璃烧杯，量筒，搅拌棒。
- 重组蒸压1 L玻璃烧杯用双蒸水900毫升标记的HBSS粉末的解决方案。
- HEPES钠+盐3.4克的HBSS混合溶液和pH值调整到7.35-7.41之间的价值，无论是使用浓盐酸或氢氧化钠。
- 一旦所需的pH值已达到并保持稳定，加5克牛血清白蛋白在室温下的解决方案，直到完全溶解白蛋白。
- 添加的抗生素，antimyotic，解决方案和双蒸馏水10毫升，直至总量在1000毫升标记。
- 搅拌彻底的解决方案。
- 过滤器的HBSS解决方案，并分成50毫升猎鹰管，供以后使用。其他管可以被冻结，并在以后的日子使用。
2。动物PREPARATION - 插入气管套管
- 准备一盘插入气管套管（即镊子，剪刀，气管插管，3-0黑色编织缝合，小动物呼吸机等）所需的仪器和材料。
- 一旦大鼠氯胺酮/甲苯噻嗪的鸡尾酒在2氯胺酮1甲苯噻嗪的比例是完全麻醉，刮胡子，大鼠腹部，胸部和喉咙。为了确保已经达到深麻醉状态，捏老鼠的脚趾，检查踏板肢体撤回。确保大鼠深麻醉前使所有的切口。
- 将其头部大鼠砧板上提出的，是在30度角斜
- 从中期腹部下颌下方做一个皮肤切口。解剖走的颈部，暴露气管前壁三角形的肌肉。
- 下放置3-0黑色编织缝合气管。
- 在气管软骨环之间的一个切口ð插入气管套管。领带的缝合紧密，以确保气管插管气管。
- 气管插管连接小动物呼吸机。
3。免疫细胞分离仪器的准备工作
- 准备一个托盘，与免疫细胞分离过程中的工具（如镊子，剪刀，HBSS中，修剪过的针快速导管软聚四氟乙烯24号巴克斯特血管）
- 准备两个10CC注射器，引入心包囊和储备的另一种缓冲吸HBSS中含有细胞与HBSS中填充一个注射器。
3.2.1减少其分离过程中的原始长度的1 / 2至3 / 4的24号巴克斯特血管聚四氟乙烯以上的快速导管针（1.6厘米）提示。
- 将所有注射器，缓冲区和一个空的15毫升猎鹰管（保存过程完成后，提取液）在冰上。
- 请在腹壁沿白线正中切口，直到你达到剑突。
- 开始略有横向至剑突过程，通过双边切口肋骨笼继续朝腋下的角度。要小心，不要刺穿肺部，心脏或心包。
- 一旦胸骨两侧的切口完成后，解剖远离较低的肋骨膜片，切割外侧到内侧。
注意：永远知道心包连接到膈肌，胸骨，以避免损坏。作为一个具有里程碑意义的的镰状韧带，要注意的是对面的隔膜附着心包。此外，如果被切断，心包分离细胞的能力都将丢失。
- 轻轻抬起一侧胸腔，暴露胸腔和心脏（心包封装）。
- 以HBSS中充满注射器和心包囊中找到一个点之间的胸骨和心脏（最好超过尾鳍延髓）约一半的方式，插入聚四氟乙烯尖的快速通过两层心包导管缩短。
- 导管到位后，轻轻地进行填充2至3毫升HBBS缓冲区心包空间。你会立即知道，当您发现心包空间不断扩大，如果导管妥善安置。如果没有填充的见证下，撤销和重新定位的快速导管。
- 心包囊内充满时，其他10毫升注射器和地点提示心包，并开始吸缓冲区。可以使用相同的项目，洞，或其他可以创造的。确保针尖不来太接近，特别是在心脏底部心包囊的墙壁上，同时提供吸力，。这可能会导致穿刺心包囊和细胞含有细胞的损失第
- 在吸缓冲区，可移动导管尖端的心包囊内左右，以收集尽可能多的缓冲区。
注意：如果你这样做轻微撕裂心包，使心脏比原来的洞大顶部的孔，不要惊慌。只要心包仍然包围着的心脏的话，你仍然可以执行另一场心脏，尽管有少量的缓冲洗净。收集细胞的最优数量，需要三至四个额外的清洗。
- 将猎鹰管置于冰上提取的缓冲区。
- 取出心脏，肺，和/或任何其他组织如果需要作进一步的研究。大鼠免疫细胞和其他组织的集合后，必须迅速和人道安乐死。
- 10分钟200克在4 ° C离心收集的免疫细胞样本始终保持在冰上管在不使用时。
- 删除在1毫升Hyclone公司缓冲区或HBSS上清和重组颗粒。
注：重要的是要计算每个心脏后，免疫细胞的分离过程中获得的免疫细胞的数量。
5。代表性的成果：
与这项技术，并与甲苯胺蓝染色和番红O /阿尔辛蓝获得一个孤立的心脏肥大细胞的例子是，分别在图2a和2b。可以看到在图3中，心脏肥大，维护他们的能力，释放组胺治疗后如复方48/80和P物质，如摩根等著名激活 。9代表散点图从流式细胞仪的CD4 +细胞CD8 +细胞，分别在图4和5。 T淋巴细胞是进一步查明并作为这项技术的细胞群phenotyped。
图1。心脏的免疫细胞的分离过程的流程图。
图2心脏肥大细胞的组织的代表图像染色如下：（一）与甲苯胺蓝和（B）是番红O /阿尔辛蓝。
图3从心外膜心肌地区隔离，并与化合物48/80（10μg/mL）和P物质（10μM）刺激心脏肥大细胞的功能研究。
代表孤立的CD4 +细胞与P物质（1:100 dilut标记流式细胞仪散点图图4。离子）。
图5。孤立的CD8 +标记细胞与P物质（1:100稀释）代表流式细胞仪。
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Discussion
这种隔离心脏免疫细胞的方法，使无不需要激活，通常发生在传统的酶消化法分离技术，分析其功能，表型，成熟。这种技术获得的平均细胞总数约400000元大鼠心脏，差这些细胞的染色和流式细胞仪分析表明（〜70％），巨噬细胞（〜12％）和肥大细胞，T淋巴细胞混合的人口使用了这种技术。（〜12％）。13，14因此，心脏的免疫细胞群的进一步分离纯化方法是必要的。隔离的免疫细胞，可用于多个应用程序，包括功能研究，流式细胞仪，immunofluroescence，并合作培养实验。随着进一步的净化和实验，这些孤立的细胞提供了一个有用的工具，对于理解在心脏重塑过程中的免疫系统的作用。
大鼠饲养标准的环境条件下，保持商业大鼠议员和自来水随意 。所有的研究都符合的国家卫生指南研究院实验动物的关心和使用原则，由南卡罗来纳州机构的动物护理和使用委员会大学的批准。麻醉在实验终点是在2氯胺酮1甲苯噻嗪的比例受氯胺酮/甲苯噻嗪鸡尾酒。这是一个nonsurvival程序，它允许使用未经消毒的工具。大鼠的免疫细胞和其他所需的组织分离后，迅速和人道安乐死根据美国兽医医疗协会啮齿类动物（如放血，颈椎脱位，或麻醉过量）安乐死的指引。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
这项工作是由一个UNCF默克研究生学研究论文奖学金（JLM），国家心脏，肺，血液研究所授予RO1 - HL - 62228（JSJ）和RO1的HL - 073990（JSJ）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks’ Balanced Salt | Sigma-Aldrich | H4891 | One bottle makes 1 L of Hanks’ Balance Salt Solution. Reconstitute Hanks’ Balance Salt Solution as a part of the procedure. |
| Antibiotic- Antimyotic | GIBCO, by Life Technologies | 15240-062 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A3912 | |
| 250 mL Nalogene Filter Bottle | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 157-0020 | |
| 12 N HCL | Fisher Scientific | CAS 7647-01-0 | For 6 N, add equal volumes of HCL to deionized water. |
| 10 N NaOH | Fisher Scientific | SC267 | For 5 N, add equal volumes of NaOH to deionized water. |
| Double Distilled Water | |||
| Table of Specific Equipment: | |||
| 3-O Suture Silk Braided | Ethicon Inc. | SA64H | |
| Small Animal Ventilator | CWE, Inc. | SAR-830 | Set breathing rate to 40.5 breaths per min. |
| Bevel 18 gauge needle | BD Biosciences | 305199 | Trim needle by 1/2 to 3/4 of its original length for use as a tracheal tube. |
| Teflon Tip (with needle removed) of 24-gauge Baxter quick-cath catheter | Baxter Internationl Inc. | 2N111 | Reduce the Teflon Tip length by 1/2 to 3/4. |
| 10 cc syringe | Fisher Scientific | 14-823-16B | |
| 15 mL Falcon Tubes | BD Biosciences | 352097 | |
| Sorvall RT6000B Refrigerated Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-377 | Remember to pre-cool and keep at 4°C. |
| Hyclone | Thermo Fisher Scientific, Inc. | S300030.02 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | HS-LB-1483 | |
References
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