Isolering af Funktionel Cardiac immunceller

Summary

Denne metode til at isolere funktionel immunceller fra hjertet giver et alternativ til de konventionelle metoder collagenase fordøjelse, der forårsager uønsket immun celle aktivering, hvilket resulterer i en nedsat reaktionsevne af disse celler. Vores metode til isolation giver funktionelle hjertets immunceller ved at undgå problemer i forbindelse med enzymatisk fordøjelse.

Abstract

Cardiac immunceller er stigende interesse for de roller, de spiller i den patologiske remodeling i mange hjertesygdomme ^1-5 Disse immunceller, som omfatter mast celler, T-celler og makrofager;. Opbevare og frigive en række af biologisk aktive mediatorer, herunder cytokiner og proteaser, såsom tryptase. ^6-8 Disse mæglere har vist sig at være centrale aktører i ekstracellulære matrix stofskifte ved at aktivere matrixmetalloproteinaser eller forårsager kollagen ophobning ved at modulere hjertefunktionen fibroblaster 'funktionen. ^9-11 dog tilgængelige teknik til at isolere hjerte immunceller har været problematisk, fordi de bruger bakteriel collagenase at fordøje myokardiets væv. Denne teknik medfører aktivering af immunceller og dermed et tab af funktion. For eksempel bliver hjertets mastceller betydeligt mindre lydhøre over for stoffer, der forårsager degranulering. ¹² Derfor har vi udviklet en teknik, der giver mulighed for than isolering af funktionelle hjerte immunceller, som ville føre til en bedre forståelse af den rolle, disse celler i hjertesygdom. ^{13, 14}

Denne metode kræver et kendskab til de anatomiske placering af rottens formet som et sværd proces, armhulen og falciform ligament, og hjertesækken af ​​hjertet. Disse milepæle er vigtigt at øge succesen af ​​proceduren og for at sikre et højere udbytte af hjertets immunceller. Disse isolerede hjerte immunceller kan derefter bruges til karakterisering af funktionalitet, fænotype, modenhed, og co-kultur eksperimenter med andre hjerteceller at få en bedre forståelse af deres samspil.

Protocol

1. Udarbejdelse af Hanks 'Balance Salt Solution (HBSS)

1. Autoklave 1 L glas bægerglas, dimitteret 1000 mL cylinder, og rør bar.
2. Opløs HBSS pulveret løsning i autoklaveres 1 L glas bægerglas til 900 mL mærket med dobbeltdestilleret vand.
3. Bland HBSS løsning med 3,4 g HEPES Na + salt og pH indstilles til en værdi mellem 7,35-7,41 enten ved hjælp af koncentreret HCl eller NaOH.
4. Når den ønskede pH-værdien er nået, og forbliver stabil, tilsættes 5 g af bovin serum albumin til løsningen ved stuetemperatur, indtil albumin er helt opløst.
5. Tilsæt 10 ml af antibiotika, antimyotic, at den løsning, og dobbelt destilleret vand, indtil det samlede volumen er på 1000 ml mærket.
6. Opløsningen omrøres grundigt.
7. Filtrer HBSS løsning og separate det i 50 ml Falcon rør til senere brug. Ekstra rør kan fryses og bruges på et senere tidspunkt.

2. Animal FORBEREDELSEn - Indsættelse af Trakeal Tube

1. Forbered en bakke med de nødvendige instrumenter og materiale til indsættelse af en trakeale rør (dvs. pincet, saks, trakeale rør, 3-0 sort flettet sutur, lille dyr ventilator, osv.).
2. Når rotten er helt bedøvet med ketamin / xylazin cocktail i forholdet 2 ketamin til 1 xylazin, barbere maven, brystet og halsen af ​​rotten. For at sikre, at en dyb bedøvelse tilstand er opnået, knivspids rottens tå og tjekke for pedal tilbagetrækning af lemmer. Sørg for, at rotten er dybt bedøvet, før du foretager alle indsnit.
3. Placer rotte med hovedet hævet på et skærebræt, der hælder i en 30 ° vinkel
4. Lav en incision i huden fra midten af ​​maven til under underkæben. Dissekere væk musklerne i den forreste trekant af halsen at eksponere luftrøret.
5. Placer en 3-0 sort flettet sutur under luftrøret.
6. Lav et snit i luftrøret mellem bruskspidserne ringe end indsætte trakeale rør. Tie suturen tæt for at sikre trakeale rør til luftrøret.
7. Slut trakeale rør til et lille dyr ventilator.

3. Instrument Forberedelse til immunceller Isolation

1. Forbered en bakke med de instrumenter, for immunforsvarets celler isolation procedure (dvs. pincet, saks, HBSS, trimmes bløde Teflon 24 gauge Baxter intravaskulær over kanylen hurtig-Cath)
2. Udarbejde to 10cc sprøjter, fylde en sprøjte med HBSS for indførelse af buffer ind i hjertesaek og reservere den anden for sugning de HBSS indeholder celler.

   3.2.1. Reducer Teflon spidsen af 24 gauge Baxter intravaskulær over kanylen quick-Cath (1,6 cm) med 1 / 2 til 3 / 4 af sin oprindelige længde til isolering procedure.

3. Læg alle sprøjter, buffere, og en tom 15 mL Falcon Tube (til at holde den udtrukne væske, når proceduren er afsluttet) på is.

<p class = "jove_title"> 4. Immun Cell Isolation

1. Lav en midterlinjen snit i bugvæggen (langs linea alba), indtil du når den formet som et sværd proces.
2. Start en anelse lateralt til den formet som et sværd processen, bilaterale snit foretager via brystkassen fortsætter i en vinkel mod armhulen. Vær forsigtig med ikke at perforere lunger, hjerte, eller hjertesækken.
3. Når indsnit på begge sider af brystbenet er færdige, dissekere væk mellemgulvet fra den nederste ribben, skære lateralt til medialt.

   Bemærk: Vær altid opmærksom på, hvor hjertesækken forbinder til mellemgulvet og brystbenet for at undgå skader. Brug falciform ligament som en milepæl at notere, hvor hjertesækken er fastgjort på den modsatte side af mellemgulvet. Også, hvis hjertesækken skæres, er evnen til at isolere celler tabt.

4. Løft forsigtigt den ene side af brystkassen at eksponere brysthulen og hjertet (stadig indkapslet af hjertesækken).
5. Tag HBSS fyldt sprøjte, og find et punkt i hjertesaek omtrent halvvejs mellem brystbenet og hjertet (helst mere rostralt end caudale) og indsæt Teflon-spidsen af ​​den forkortede quick-Cath gennem begge lag af hjertesækken.
6. Når kateteret er på plads, gå forsigtigt fylde perikardiel plads med 2 til 3 ml HBBS buffer. Du vil vide det samme, hvis kateteret er korrekt placeret, når du bemærker perikardial rummet udvider sig. Hvis der ikke påfyldning er vidne til, hæve og flytte quick-Cath.
7. Når hjertesaek er fyldt, træffer de andre 10 ml sprøjten og placer spidsen tilbage i hjertesækken og begynde sugning bufferen. Det samme indgangshul kan bruges eller anden kan oprettes. Sørg for, at spidsen ikke kommer for tæt på væggene i hjertesaek samtidig med at suge, især på undersiden af ​​hjertet. Dette kunne føre til punkterer hjertesaek og tab af celle-holdige cellerS.
8. Mens sugning bufferen, kan kateterspidsen skal flyttes rundt inde i hjertesaek med henblik på at indsamle så meget buffer som muligt.

Bemærk: Hvis i gør, så du let rive hjertesækken og gøre hullet i toppen af hjertet er større end det oprindelige hul, skal du ikke gå i panik. Så længe hjertesækken stadig omgiver nok af hjertet kan du stadig udføre en vask over hjertet dog med en mindre mængde buffer. Til opsamling af en optimal mængde af celler, er tre til fire ekstra vaske behov.

9. Placer den udpakkede buffer ind i Falcon rør, der blev lagt på is.
10. Fjern hjerte, lunger, og / eller ethvert andet væv hvis der er behov for yderligere undersøgelser. Efter indsamling af immunceller og andre væv, skal rotten være hurtigt og humant aflivet.
11. Centrifugér de indsamlede immun celleprøver i 10 min ved 200 g ved 4 ° C. Altid holde rørene på isnår den ikke er i brug.
12. Fjern supernatanten og genoprette pellet i 1 mL Hyclone buffer eller HBSS.

Bemærk: Det er vigtigt at tælle antallet af immunceller fra hvert hjerte efter immunceller isolation procedure.

5. Repræsentative resultater:

Et eksempel på isolerede hjerte mastceller opnået med denne teknik og farves med toluidin blå og safranin O / alcian blå er præsenteret i figur 2A og 2B, hhv. Som det kan ses i figur 3, hjerte-mast, fastholdt deres evne til at frigive histamin efter behandling med kendt aktivatorer som for eksempel sammensat 48/80 og substans P, som beskrevet i Morgan et al. ⁹ Repræsentant scatter plots fra flowcytometri af CD4 + celler og CD8 + celler er præsenteret i figur 4 og 5, hhv. T-lymfocytter er yderligere identificeret og phenotyped som en celle befolkningen fra denne teknik.

Figur 1. Flow diagram af hjerte-immun celle isolation procedure.

. Figur 2 Histologisk repræsentant billeder af hjerte-mast celler er farvet som følger: (A) med toluidin blå og (B) er safranin O / alcian blå.

Figur 3. Funktionel undersøgelse af hjerte-mast celler isoleret fra epikardielle myokardiets regionen og stimuleret med renters 48/80 (10μg/mL) og substans P (10μM).

Figur 4. Repræsentant flowcytometri scatter plot af isolerede CD4 + celler mærkes med substans P (1:100 dilution).

Figur 5. Repræsentant flowcytometri af isolerede CD8 + celler mærkes med substans P (1:100 fortynding).

Discussion

Denne metode til at isolere hjerte immunceller muliggør en analyse af deres funktion, fænotype, og modenhed uden uønskede aktivering, der typisk opstår under en traditionel enzymatisk fordøjelse isolation teknik. Den gennemsnitlige samlede antal celler, der opnås med denne teknik er omkring 400.000 per rotte hjerte, og forskellen farvning og flowcytometri analyse af disse celler indikerer blandet befolkning af T-lymfocytter (~ 70%), makrofager (~ 12%) og mast celler med brugen af denne teknik. (~ 12%). ^{13, 14,} er derfor rensning metoder til yderligere adskillelse af hjerte-immun cellepopulationer behov. Isoleret immunceller kan bruges til flere forskellige applikationer, herunder funktionelle undersøgelser, flowcytometri, immunofluroescence, og co-kultur eksperimenter. Med yderligere rensning og eksperimenter, giver disse isolerede celler et nyttigt redskab til at forstå rollen af ​​immunsystemet i processen af ​​hjertets remodellering.

Rotter været opstaldet under standard miljøforhold og vedligeholdes på kommercielle rotte Chow og postevand ad libitum. Alle studier var i overensstemmelse med principperne i National Institutes of Health Guide til pleje og brugen af ​​forsøgsdyr og blev godkendt af University of South Carolina institutionens Animal pasning og anvendelse Udvalg. Anæstesi på forsøgsstadiet slutpunktet var påvirket af ketamin / xylazin cocktail i et forhold på 2 ketamin til 1 xylazin. Dette er en ikke-overlevelse procedure, der tillader brugen af ​​usteriliseret instrumenter. Efter isolering af immunceller og andre ønskede væv, blev rotten hurtigt og humant aflives ifølge American Veterinary Medical Association retningslinje om Eutanasi til gnavere (f.eks afblødning, dislokation af halsen, eller bedøvende overdosis).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hanks’ Balanced Salt	Sigma-Aldrich	H4891	One bottle makes 1 L of Hanks’ Balance Salt Solution. Reconstitute Hanks’ Balance Salt Solution as a part of the procedure.
Antibiotic- Antimyotic	GIBCO, by Life Technologies	15240-062
HEPES	Sigma-Aldrich	H3784
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A3912
250 mL Nalogene Filter Bottle	Thermo Fisher Scientific, Inc.	157-0020
12 N HCL	Fisher Scientific	CAS 7647-01-0	For 6 N, add equal volumes of HCL to deionized water.
10 N NaOH	Fisher Scientific	SC267	For 5 N, add equal volumes of NaOH to deionized water.
Double Distilled Water
Table of Specific Equipment:
3-O Suture Silk Braided	Ethicon Inc.	SA64H
Small Animal Ventilator	CWE, Inc.	SAR-830	Set breathing rate to 40.5 breaths per min.
Bevel 18 gauge needle	BD Biosciences	305199	Trim needle by 1/2 to 3/4 of its original length for use as a tracheal tube.
Teflon Tip (with needle removed) of 24-gauge Baxter quick-cath catheter	Baxter Internationl Inc.	2N111	Reduce the Teflon Tip length by 1/2 to 3/4.
10 cc syringe	Fisher Scientific	14-823-16B
15 mL Falcon Tubes	BD Biosciences	352097
Sorvall RT6000B Refrigerated Centrifuge	Fisher Scientific	75-004-377	Remember to pre-cool and keep at 4°C.
Hyclone	Thermo Fisher Scientific, Inc.	S300030.02
Hemocytometer	Hausser Scientific	HS-LB-1483