Isolatie van Functionele Cardiac immuuncellen

Summary

Deze methode voor het isoleren van functionele immuun cellen van het hart biedt een alternatief voor de conventionele methoden van collagenase spijsvertering, die ongewenste immuun-cel activatie veroorzaakt, wat resulteert in een verminderde respons van deze cellen. Onze methode van isolatie levert functionele hart immuuncellen door het vermijden van problemen die samenhangen met enzymatische spijsvertering.

Abstract

Cardiale immuuncellen worden steeds belangstelling voor de rollen die zij spelen in de pathologische remodeling in veel hartaandoeningen ^1-5 Deze immuuncellen, die mestcellen, T-cellen en macrofagen bevatten;. Bewaren en laat een verscheidenheid van biologisch actieve mediators zoals cytokines en proteases zoals tryptase. ^6-8 Deze bemiddelaars is aangetoond dat de belangrijkste spelers in de extracellulaire matrix metabolisme worden door het activeren van matrix metalloproteinases of het veroorzaken van collageen accumulatie door het moduleren van de cardiale fibroblasten 'functie. ^9-11 echter beschikbare technieken voor het isoleren van het hart immune cellen is problematisch omdat ze bacterieel collagenase om de myocardweefsel verteren. Deze techniek zorgt voor de activatie van het immuunsysteem cellen en dus een verlies van functie. Bijvoorbeeld, cardiale mestcellen worden aanzienlijk minder reageren op stoffen die degranulatie kunnen veroorzaken. Daarom ^12, hebben we een techniek ontwikkeld die het mogelijk maakt voor tHij isolatie van functionele hart immune cellen, die zou leiden tot een beter begrip van de rol van deze cellen in hart-en vaatziekten. ^{13, 14}

Deze methode vereist een vertrouwdheid met de anatomische locatie van zwaardvormig de rat het proces, oksel en gebogen ligament, en hartzakje van het hart. Deze monumenten zijn belangrijk voor het succes van de procedure te verhogen en een hogere opbrengst van de cardiale immune cellen te verzekeren. Deze geïsoleerde hart immune cellen kunnen vervolgens worden gebruikt voor de karakterisering van functionaliteit, fenotype, volwassenheid en co-cultuur experimenten met andere hartcellen tot een beter begrip van hun interacties te krijgen.

Protocol

1. Voorbereiding van de Balance Hanks 'Salt Solution (HBSS)

1. Autoclaaf een L glazen beker, 1000 ml maatcilinder, en roer bar.
2. Los het poeder HBSS oplossing in de geautoclaveerde een L glazen beker op de 900 ml maatstreep met dubbel gedestilleerd water.
3. Meng HBSS oplossing met 3,4 g van Hepes Na + zout en breng de pH op een waarde tussen 7,35-7,41 met behulp van geconcentreerde HCl of NaOH.
4. Zodra de gewenste pH is bereikt en blijft stabiel, voeg 5 g runder serum albumine aan de oplossing op kamertemperatuur tot de albumine volledig is opgelost.
5. Voeg 10 ml van het antibioticum, antimyotic, aan de oplossing en dubbel gedestilleerd water tot het totale volume is op 1000 ml streepje.
6. Roer de oplossing.
7. Filter de HBSS oplossing en scheiden in 50 ml Falcon buizen voor later gebruik. Extra buizen kunnen worden ingevroren en gebruikt op een later tijdstip.

2. Animal VOORBEREIDn - Toevoeging van tracheale buizen

1. Bereid een dienblad met de vereiste instrumenten en materiaal voor het inbrengen van een endotracheale tube (dat wil zeggen tang, schaar, tracheale tube, 3-0 zwart gevlochten hechtdraad, kleine dieren ventilator, etc.).
2. Zodra de rat is volledig verdoofd met een ketamine / xylazine cocktail in de verhouding van 2 tot en met 1 ketamine xylazine, scheren de buik, borst en keel van de rat. Om ervoor te zorgen dat een diepe verdoving staat is bereikt, knijp de rat teen en controleer pedalen terugtrekking van de ledemaat. Zorg ervoor dat de rat is diep verdoofd voordat alle incisies.
3. Plaats de rat met zijn hoofd omhoog op een snijplank, dat is een hoek van een hoek van 30 °
4. Maak een huidincisie uit het midden van de buik tot onder de onderkaak. Ontleden weg de spieren van de voorste driehoek van de hals naar de luchtpijp bloot te leggen.
5. Plaats een 3-0 zwart gevlochten hechtmateriaal in de luchtpijp.
6. Maak een insnijding in de luchtpijp tussen de kraakbenige ringen eend Plaats de tracheale tube. Strak binden de hechting aan de tracheale tube vast aan de luchtpijp.
7. Sluit de tracheale tube om een ​​klein dier ventilator.

3. Instrument Voorbereiding voor immuuncel Isolation

1. Bereid een lade met de instrumenten voor de immuun cel isolatie procedure (dat wil zeggen tang, schaar, HBSS, bijgesneden zachte Teflon 24 meter Baxter intravasculaire over de naald quick-cath)
2. Bereid twee 10cc spuiten, vul een spuit met HBSS voor de invoering van de buffer in de pericardiale zak en reserveer de andere voor opzuigen van de HBSS met cellen.

   3.2.1. Verminder de Teflon topje van de 24 meter Baxter intravasculaire over de naald quick-cath (1,6 cm) met 1 / 2 tot 3 / 4 van de oorspronkelijke lengte van de isolatie procedure.

3. Plaats alle spuiten, buffers, en een lege 15 ml Falcon Tube (de uitgepakte vloeistof te houden nadat de procedure is voltooid) op ijs.

<p class = "jove_title"> 4. Immuun celisolatie

1. Maak een middellijn incisie in de buikwand (langs de linea alba) tot u bij de zwaardvormig proces.
2. Begint een beetje zijdelings aan de zwaardvormig proces, maken bilaterale incisies door de ribbenkast blijft onder een hoek in de richting van de oksel. Wees niet naar de longen, hart of hartzakje perforeren.
3. Zodra de insnijdingen aan beide zijden van het borstbeen zijn voltooid, ontleden weg de membraan van de onderste ribben, snijden lateraal naar mediaal.

   Let op: Wees altijd bewust van waar het pericard verbindt met het middenrif en het borstbeen om schade te voorkomen. Gebruik de gebogen ligament als een baken om op te merken waar het hartzakje is bevestigd aan de andere kant van het middenrif. Ook, indien het hartzakje wordt gesneden, is de mogelijkheid om cellen te isoleren verloren.

4. Til de ene kant van de ribbenkast naar de borstholte en het hart (nog steeds ingekapseld door het hartzakje) bloot te leggen.
5. Neem de HBSS spuit en vind een punt in de hartzak ongeveer halfweg tussen het borstbeen en het hart (bij voorkeur meer rostraal dan caudale) en plaats de Teflon topje van de verkorte quick-cath door beide lagen van het hartzakje.
6. Nadat de katheter is op zijn plaats, voorzichtig verder vult de pericardiale ruimte met 2 tot 3 ml HBBS buffer. U zult meteen weten of de katheter juiste manier is geplaatst wanneer u merkt dat de pericardiale ruimte uit te breiden. Als er geen vulling is getuige, zich terugtrekken en plaats het quick-cath.
7. Wanneer de pericardiale zak vol is, neemt de andere 10 cc spuit en plaats de tip terug in het hartzakje en begin opzuigen van de buffer. Dezelfde ingang gat kan worden gebruikt of een ander kunnen worden gemaakt. Zorg ervoor dat de tip niet te dicht komen om de muren van de hartzak terwijl zuiging, vooral op de onderkant van het hart. Dit kan leiden tot aanprikken van de pericardiale zak en het verlies van cel-bevattende cels.
8. Terwijl opzuigen van de buffer, kan de katheter tip worden verplaatst binnen het hartzak in om zo veel buffer te verzamelen als mogelijk.

Opmerking: Als in het doen, zodat je een beetje scheurt het hartzakje en maak het gat aan de bovenkant van het hart groter is dan het oorspronkelijke gat, raak niet in paniek. Zolang het hartzakje omgeeft nog voldoende van het hart die u kunt nog altijd een wassen over het hart, zij het met een kleinere hoeveelheid buffer. Voor de inzameling van een optimale hoeveelheid cellen, zijn drie tot vier extra wasbeurten nodig.

9. Plaats de uitgepakte buffer in de Falcon buizen die werden geplaatst op ijs.
10. Verwijder het hart, de longen en / of enig ander weefsel als dat nodig is voor verdere studies. Na het verzamelen van immuuncellen en andere weefsels, moet de rat zijn snel en humaan gedood.
11. Centrifugeer de verzamelde immuuncel monsters gedurende 10 min bij 200 g bij 4 ° C. Altijd de buizen op het ijswanneer niet in gebruik.
12. Verwijder het supernatant en reconstrueren van de pellet in 1 ml van Hyclone buffer of HBSS.

Opmerking: Het is belangrijk te tellen van het aantal immuun cellen verkregen van elk hart na het immuunsysteem celisolatie procedure.

5. Representatieve resultaten:

Een voorbeeld van geïsoleerde hart mestcellen verkregen met deze techniek en gekleurd met toluidine blauw en safranine O / Alcian blauw worden gepresenteerd in de figuren 2A en 2B, respectievelijk. Zoals te zien is in Figuur 3, De cardiale mast, onderhouden van hun vermogen om histamine vrij na de behandeling met bekende activatoren, zoals samenstelling 48/80 en substantie P, zoals beschreven in Morgan et al. ^9. Vertegenwoordiger puntgrafieken van flow cytometrie van de CD4 + cellen en CD8 + cellen worden gepresenteerd in de figuren 4 en 5, respectievelijk. T-lymfocyten worden verder geïdentificeerd en fenotype als een cel populatie van deze techniek.

Figuur 1. Stroomdiagram van het hart immune celisolatie procedure.

. Figuur 2 Histologische representatieve beelden van hart mast-cellen worden gekleurd als volgt: (A) met toluidine blauw en (B) zijn safranine O / Alcian blauw.

Figuur 3. Functionele studie van de cardiale mestcellen geïsoleerd uit de epicardiale myocardiale regio en gestimuleerd met compound 48/80 (10μg/mL) en substantie P (10μM).

Figuur 4. Vertegenwoordiger van flowcytometrie puntgrafieken van geïsoleerde CD4 +-cellen gelabeld met Substance P (1:100 dilution).

Figuur 5. Vertegenwoordiger van flowcytometrie van geïsoleerde CD8 + cellen gelabeld met Substance P (1:100 verdunning).

Discussion

Deze methode van isoleren van cardiale immuuncellen maakt de analyse van hun functie, fenotype, en volwassenheid zonder de ongewenste activering die normaal gesproken optreedt tijdens een traditionele enzymatische vertering isolatie techniek. De gemiddelde totale aantal cellen verkregen met deze techniek is ongeveer 400.000 per rat hart, en differentiële kleuring en flowcytometrie-analyse van deze cellen geeft aan gemengde populatie van T-lymfocyten (~ 70%), macrofagen (~ 12%) en mast cellen met het gebruik van deze techniek. (~ 12%). ^{13, 14} Daarom zijn zuivering methoden voor de verdere scheiding van cardiale immuun cel populaties nodig. Geïsoleerde afweercellen kan gebruikt worden voor meerdere toepassingen met inbegrip van functionele studies, flow cytometrie, immunofluroescence, en co-cultuur experimenten. Met de verdere zuivering en experimenteren, deze geïsoleerde cellen zorgen voor een nuttig instrument voor het begrijpen van de rol van het immuunsysteem in het proces van cardiale remodellering.

Ratten werden ondergebracht onder standaard omgevingsomstandigheden en onderhouden van commerciële rat chow-en kraanwater ad libitum. Alle studies voldeden aan de principes van de National Institutes of Health Guide voor de verzorging en gebruik van proefdieren en werden goedgekeurd door de Universiteit van Animal South Carolina instelling verzorging en gebruik Comite. Anesthesie bij de experimentele eindpunt werd beïnvloed door ketamine / xylazine cocktail in een verhouding van 2 ketamine tot een xylazine. Dit is een nonsurvival procedure, die het gebruik van niet-gesteriliseerde instrumenten vergunningen. Na de isolatie van immuuncellen en andere gewenste weefsel, de rat was snel en humaan gedood volgens de American Veterinary Medical Association Richtsnoer inzake Euthanasie voor knaagdieren (bijv. verbloeding, cervicale dislocatie of verdoving overdosis).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hanks’ Balanced Salt	Sigma-Aldrich	H4891	One bottle makes 1 L of Hanks’ Balance Salt Solution. Reconstitute Hanks’ Balance Salt Solution as a part of the procedure.
Antibiotic- Antimyotic	GIBCO, by Life Technologies	15240-062
HEPES	Sigma-Aldrich	H3784
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A3912
250 mL Nalogene Filter Bottle	Thermo Fisher Scientific, Inc.	157-0020
12 N HCL	Fisher Scientific	CAS 7647-01-0	For 6 N, add equal volumes of HCL to deionized water.
10 N NaOH	Fisher Scientific	SC267	For 5 N, add equal volumes of NaOH to deionized water.
Double Distilled Water
Table of Specific Equipment:
3-O Suture Silk Braided	Ethicon Inc.	SA64H
Small Animal Ventilator	CWE, Inc.	SAR-830	Set breathing rate to 40.5 breaths per min.
Bevel 18 gauge needle	BD Biosciences	305199	Trim needle by 1/2 to 3/4 of its original length for use as a tracheal tube.
Teflon Tip (with needle removed) of 24-gauge Baxter quick-cath catheter	Baxter Internationl Inc.	2N111	Reduce the Teflon Tip length by 1/2 to 3/4.
10 cc syringe	Fisher Scientific	14-823-16B
15 mL Falcon Tubes	BD Biosciences	352097
Sorvall RT6000B Refrigerated Centrifuge	Fisher Scientific	75-004-377	Remember to pre-cool and keep at 4°C.
Hyclone	Thermo Fisher Scientific, Inc.	S300030.02
Hemocytometer	Hausser Scientific	HS-LB-1483